m6A修飾及其生殖調(diào)控功能研究進展

郭韶珂，裴 杰，王興東，吳曉云，郭 憲

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

RNA將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)，維持生命活動的正常運轉(zhuǎn)。RNA修飾是RNA調(diào)控生物系統(tǒng)、維持RNA穩(wěn)定的主要方式，和DNA修飾在表觀遺傳學中發(fā)揮的多種作用類似，RNA上的可逆化學修飾已作為普遍現(xiàn)象出現(xiàn)，可能會開啟“RNA表觀遺傳學”的新篇章。目前在mRNA和非編碼RNA中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多種不同的RNA修飾，其中1974年發(fā)現(xiàn)的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，mA）甲基化是最普遍的RNA內(nèi)部修飾。mA修飾在生物體的各個組織中都被發(fā)現(xiàn)，這種修飾通過控制RNA代謝、剪接、降解和翻譯來調(diào)控基因表達和實現(xiàn)相應的生物學功能。近年來，有研究報道m(xù)A修飾在細胞分化、動物發(fā)育、動物生殖和疾病發(fā)生中起到重要調(diào)控作用。mA甲基化相關酶表達異常也會影響mA的修飾水平，進而影響生物體的生殖和分化功能，提示mA修飾可能是生殖類疾病調(diào)控的新靶點，然而其作用機制還未闡明。本文從mA修飾特點、mA甲基化酶及其在動物配子發(fā)生和胚胎發(fā)育等生殖方面的調(diào)控作用進行分析和總結(jié)，旨在為mA修飾在家畜生殖和育種上的研究與應用提供思路和理論依據(jù)。

1 m6A修飾的定位

mA修飾是指在mRNA中腺苷酸（A）的第六位氮原子處發(fā)生甲基化，在人和小鼠中有1/3～1/2的mRNA存在mA修飾。哺乳動物mRNA中分離的mA占所有腺苷核苷酸的0.1%～0.4%，平均每2 000個核苷酸上就存在1個mA修飾峰（mA peak），每條mRNA上含有3～5個mA peak。在研究初期有人推測mA可能來自rRNA和snRNA的污染，并認為特定mA位點的突變不會影響mRNA的豐度和加工。雖然mA的化學性質(zhì)穩(wěn)定，但mRNA在細胞內(nèi)的豐度較低，并且對檢測它的化學處理不敏感，在所檢測的細胞mRNA中很少檢測到mA。直到2012年，Dominissini等和Meyer等將免疫沉淀技術與下一代高通量測序（mA-Seq或 MeRIP-Seq）結(jié)合起來，這種方法可以對mA修飾進行分辨率為200 nt的全基因組定位，并首次在人和小鼠組織中7 000多個基因的轉(zhuǎn)錄本中檢測到12 000多個mApeak。mA修飾在約25%的轉(zhuǎn)錄本中是非隨機分布的，研究發(fā)現(xiàn)mA在終止密碼子附近、3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）和較長內(nèi)部外顯子中富集，并更多地出現(xiàn)在前體mRNA中，優(yōu)先嵌入由5′-RRACU-3′（R=A或G；H=A、C或U）組成的共有序列基序中。隨后，2015年，研究發(fā)現(xiàn)通過miCLIP和mA-CLIP技術可以將mA修飾位點精確到近單堿基分辨率的測定，但由于實驗方法涉及同位素標記成本過高，目前實驗室仍普遍采用MeRIP-Seq技術進行mA檢測。

2 m6A甲基化酶

2010年，He首次提出在基因表達調(diào)控中可逆的RNA修飾問題。Jia等的研究進一步證實了mA修飾的動態(tài)可逆性。mA修飾的調(diào)控功能需要甲基化轉(zhuǎn)移酶（Writer）、去甲基化酶（Eraser）和甲基化閱讀蛋白（Reader）3種酶協(xié)同發(fā)揮作用。甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用是使mRNA上的腺苷酸發(fā)生甲基化修飾，而發(fā)生甲基化修飾的堿基可以在去甲基化酶的作用下將甲基移除，甲基化閱讀蛋白的功能是識別這些發(fā)生甲基化修飾的甲基位點，不同的閱讀蛋白發(fā)揮的調(diào)控功能也不相同。

2.1 甲基化轉(zhuǎn)移酶 甲基轉(zhuǎn)移酶復合體是催化mA修飾的重要物質(zhì)，其關鍵成分主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶3（METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶14（METTL14）和Wilms腫瘤1相關蛋白（WTAP）。METTL3在各個組織中都有表達，在睪丸中的表達尤其豐富。METTL14是METTL3的高度同源物，METTL3和METTL14之間會形成一個化學計量比為1:1的穩(wěn)定異二聚體，前者作為催化亞基，后者提供RNA結(jié)合支架，并且這個復合物的甲基化活性要高于這兩個酶單獨的甲基化活性。WTAP是一種與Wilms腫瘤1（WT1）蛋白結(jié)合的剪切因子，它在體外不顯示mA修飾的催化活性，但WTAP在核小點中與METTL3-METTL14相互作用，共同參與mA RNA甲基化過程。Sorci等研究顯示，METTL3蛋白的敲低和過度表達均導致WTAP蛋白上調(diào)。KIAA1429也稱為vir樣mA甲基轉(zhuǎn)移酶相關蛋白VIRMA，是mA甲基轉(zhuǎn)移酶復合物的新鑒定成分，在指導區(qū)域選擇性mA沉積中起關鍵作用。有研究表明，甲基轉(zhuǎn)移酶可以通過調(diào)節(jié)RNA半衰期和選擇性剪切來影響機體的組織或干細胞的分化異常，也可通過調(diào)節(jié)mRNA翻譯和基因表達發(fā)揮致癌作用。

2.2 去甲基化酶 Jia等首次在小鼠中發(fā)現(xiàn)去甲基化酶脂肪質(zhì)量和肥胖相關蛋白（FTO），F(xiàn)TO的發(fā)現(xiàn)證明了mA修飾是通過可逆調(diào)節(jié)來影響mRNA的功能。FTO在控制食物攝入的下丘腦部位表達量最高。基因表達下調(diào)提高mRNA中mA的水平，而基因上調(diào)表達抑制mA甲基化，這一現(xiàn)象揭示FTO具有去甲基化活性。隨后被發(fā)現(xiàn)的另一個去甲基化酶是同為ALKB家族成員的-酮戊二酸依賴的雙加氧酶ALB同系物5（ALKBH5），ALKBH5主要通過其去甲基化活性影響mRNA的輸出和加工。ALKBH5在大多數(shù)組織中都有表達，在小鼠睪丸中的表達量最高，基因敲除的雄性小鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常。到目前為止，僅有FTO和ALKBH5兩個mA去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)，由于它們在組織分布和RNA靶點的種類上存在差異，它們在RNA代謝中發(fā)揮的生物學作用也不盡相同。此外，F(xiàn)TO不僅與肥胖的發(fā)生和發(fā)展密切相關，也與其他代謝性疾病和癌癥的發(fā)生有關，ALKBH5在癌癥發(fā)病和抑制的機理中起到關鍵作用。

2.3 甲基化閱讀蛋白 使mA甲基化發(fā)揮生物學作用的是特定的閱讀蛋白。YT521-B Homology（YTH）結(jié)構(gòu)域家族在真核生物中普遍存在，具有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可識別mA標記，并且發(fā)揮RNA剪接、mRNA衰減、翻譯的分子功能。在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了5個YTH家族的閱讀蛋白，根據(jù)一級序列和結(jié)構(gòu)特征分為3類：YTHDC1（DC1家族）、YTHDC2（DC2家族）和YTHDF1-3（DF家族）。YTH蛋白在細胞內(nèi)有不同的分布，其中YTHDF家族蛋白和YTHDC2蛋白廣泛分布于細胞質(zhì)中，而YTHDC1蛋白主要分布于細胞核中。YTHDF1能特異性識別和結(jié)合3′-UTR區(qū)中的mA，并直接與啟動因子相互作用以促進翻譯。YTHDF2的羧基末端結(jié)構(gòu)域選擇性地結(jié)合特定區(qū)域發(fā)生mA甲基化的mRNA，促進mRNA的衰退與降解。YTHDF3同樣也可以促進翻譯，它通過與YTHDF1的協(xié)同作用促進甲基化mRNA的翻譯和蛋白質(zhì)合成。研究發(fā)現(xiàn)YTHDF3敲除會降低YTHDF1和YTHDF2的RNA結(jié)合特異性。YTHDC1是唯一發(fā)現(xiàn)的細胞核內(nèi)mA閱讀蛋白，它在核mRNA加工和核定位中發(fā)揮作用。YTHDC2與減數(shù)分裂特異的包含卷曲結(jié)構(gòu)域的蛋白（MEIOC）形成復合物，通過其YTH結(jié)構(gòu)域識別mA來調(diào)節(jié)RNA水平。除了含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白外，有報道稱真核細胞啟動因子3（eIF3）也為mA閱讀蛋白。5′-UTR中包含mA的mRNA可以直接結(jié)合eIF3，可以在沒有帽結(jié)合因子eIF4E的情況下募集43S復合體以啟動mRNA的翻譯。

3 m6A修飾調(diào)控動物生殖過程

3.1 影響干細胞增殖和分化 在哺乳動物中，精原干細胞（Spermatogonial Stem Cell，SSC）會進行無限制的自我更新和分化以生成精原細胞，維持雄性的整個生命周期中都能持續(xù)產(chǎn)生精子。SSCs自我更新和分化之間的平衡受到外部環(huán)境刺激和特定內(nèi)在基因表達的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，SSCs的大多數(shù)關鍵調(diào)控因子都具有廣泛的mA甲基化修飾。小鼠生殖細胞中METTL3或METTL14通過控制SSCs增殖和分化的關鍵調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄本來維持SSCs穩(wěn)態(tài)，其特異性失活會引起mA缺失，導致SSCs過度增殖，從而使SSCs庫耗竭。

在動物的胚胎干細胞（Embryonic Stem Cell，ESC）中也發(fā)現(xiàn)了mA甲基化修飾在維持自我更新和分化過程中發(fā)揮作用。在mESC中，mA的靶標包括ESC核心多能性網(wǎng)絡和分化過程中具有動態(tài)控制豐度的轉(zhuǎn)錄本。Batista等在人和小鼠ESCs中鑒定出的位置和序列特征表明，mA沉積的機制與體細胞中的機制相似，與未修飾的轉(zhuǎn)錄本相比，發(fā)生mA修飾的轉(zhuǎn)錄本具有RNA半衰期縮短、mRNA衰減速率增加、翻譯效率降低的特點。Wang等報道小鼠胚胎干細胞中敲除后會表現(xiàn)出喪失自我更新能力的表型特征。然而，Batista等研究表明，缺失不會影響ESCs的生存能力或自我更新，只是ESCs的更新速度有所提高。這兩項研究中觀察到的表型差異可能是由于不同細胞類型對mA修飾的RNA依賴性不同，急性與慢性失活或RNAi脫靶的作用所致。缺失的ESCs增強了自我更新能力，但mA不足會影響ESCs在體外和體內(nèi)從自我更新到分化成特定譜系的過程，導致ESCs分化受阻，這是通過限制許多ESC基因（包括多能性調(diào)節(jié)劑）的水平實現(xiàn)的。

3.2 調(diào)控精子減數(shù)分裂和精子發(fā)生 精子生成是一個復雜的過程，涉及動態(tài)的精原細胞分化、減數(shù)分裂和精細胞分化過程。近年來，去甲基化酶和甲基轉(zhuǎn)移酶催化的mA修飾已被證實在動物精子的發(fā)育過程中起重要作用。METTL3在睪丸發(fā)育期間在生殖細胞和體細胞中均表達，但在未分化精原細胞中的表達相對較高。缺失會影響與精子發(fā)生相關基因的表達模式，使精母細胞無法達到減數(shù)分裂前期的粗線期，嚴重阻斷了精原細胞分化和最初的減數(shù)分裂正常進行。METTL3介導的mA修飾通過基因的選擇性剪接在精子發(fā)生中起重要調(diào)節(jié)作用，如選擇性剪接因子Bcas2在減數(shù)分裂的轉(zhuǎn)化過程中起作用。與這些結(jié)果不同的是，Lin等研究發(fā)現(xiàn)或單獨缺失的小鼠表現(xiàn)出正常的減數(shù)分裂和精子發(fā)生，但和聯(lián)合缺失的個體表現(xiàn)出精子分化受損，這是由于精子發(fā)生關鍵因子翻譯失調(diào)所致。這表明，METTL3和METTL14在精子發(fā)生晚期中可能具有不同或部分重疊的功能，而mA調(diào)控RNA翻譯可能是控制精子發(fā)生后期的機制。

mA去甲基酶的缺失也會導致精子發(fā)生受損。ALKBH5的整體失活除導致雄性小鼠不育外，均不會導致明顯的發(fā)育缺陷或成年疾病，這表明ALKBH5只在精子形成過程中起至關重要的作用。ALKBH5從前體mRNA正確擦除mA對于在睪丸中的粗線精細胞和圓形精子細胞的細胞核中正確剪接和產(chǎn)生較長的3′-UTR mRNA是必不可少的，否則，將導致異常剪接。mA去甲基化酶和甲基轉(zhuǎn)移酶在精子從形成到發(fā)生過程中的重要作用還表明，mA修飾的總體平衡是在精子發(fā)生過程中維持分化程序的關鍵，可逆的mA修飾是減數(shù)分裂和單倍體生精細胞中控制mRNA轉(zhuǎn)錄后命運的關鍵機制。

作為甲基化閱讀蛋白的YTHDC2同樣在從有絲分裂性精原細胞的基因表達程序成功過渡到減數(shù)分裂精子細胞中起著至關重要的作用。在雄性小鼠睪丸中的缺失改變精原細胞有絲分裂和減數(shù)分裂中相關基因的表達，導致其無法正確進行減數(shù)分裂。YTHDC2降低mRNA的豐度可能通過募集衰變機制，以在哺乳動物細胞翻譯期間或之后加速mRNA靶標的降解。上述研究表明，YTHDC2在調(diào)節(jié)mA修飾的轉(zhuǎn)錄本水平，以維持有利于減數(shù)分裂進展的基因表達程序中的作用，不過由YTHDC2組裝的mA指導的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控復合物的詳細作用機理還需要進一步的研究。

3.3 調(diào)控卵子發(fā)生 卵子發(fā)生的過程分為生長、成熟和排卵3個階段。有研究發(fā)現(xiàn)，mA修飾主要發(fā)生在生殖細胞中，而不是卵巢體細胞中，并且mA水平隨著減數(shù)分裂的啟動而顯著增加。在非洲爪蟾的生發(fā)泡期（GV期）或減數(shù)分裂中期II期，卵母細胞中的mRNA發(fā)生廣泛的mA修飾，這些mRNA主要參與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化和細胞分裂等生物學過程，而mA甲基化可能通過抑制mRNA翻譯來影響減數(shù)分裂進行。斑馬魚中的缺失導致膽固醇轉(zhuǎn)運和類固醇生成途徑中關鍵酶的mRNA水平顯著降低，損害卵母細胞減數(shù)分裂過程。這很可能是mA水平降低導致性激素合成和促性腺激素信號轉(zhuǎn)導重要基因表達受阻的結(jié)果，可通過體內(nèi)和體外激素來挽救。最新研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1429介導的RNA代謝在小鼠卵泡形成和卵母細胞能力維持中起關鍵作用，其缺失導致卵泡發(fā)育不良，完全長大的生發(fā)泡卵母細胞無法經(jīng)歷生發(fā)泡破裂（GVBD），因此喪失恢復減數(shù)分裂的能力。這主要是改變了卵泡發(fā)育必需的卵母細胞衍生因子的表達模式所致，影響了與卵子發(fā)生有關的基因的選擇性剪接。

甲基化閱讀蛋白也是哺乳動物卵母細胞能力的內(nèi)在決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，3種mA閱讀蛋白YTHDF2、YTHDC1和YTHDC2在調(diào)節(jié)雌性動物生殖方面的功能略有不同。YTHDF2主要維持女性的生育力和卵母細胞生長能力，YTHDC1是卵母細胞生長和成熟所必需的，YTHDC2是卵母細胞減數(shù)分裂進程所必需的。YTHDF2可能以mA依賴性的方式調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中的mRNA降解，YTHDF2缺失不會嚴重影響卵母細胞的生長或母體轉(zhuǎn)錄的發(fā)生，只會導致在卵母細胞成熟期間基因mRNA表達量的異常。YTHDC1在卵母細胞核中的前mRNA轉(zhuǎn)錄物的加工中起關鍵作用，可以調(diào)節(jié)含mA的mRNA的核輸出和選擇性剪接。除了剪接缺陷外，YTHDC1缺失還會引起卵母細胞中廣泛的替代性聚腺苷酸化，影響多腺苷酸化位點的選擇和3′-UTR長度。Wojtas等研究表明YTHDC2缺失卵巢的RNA-seq分析顯示轉(zhuǎn)錄組調(diào)控異常，這可能導致雌性生殖細胞無法成功執(zhí)行減數(shù)分裂程序，從而導致不孕。Zeng等在雌性生殖細胞中發(fā)現(xiàn)的YTHDC2表達模式與其他人報道的兩性減數(shù)分裂生殖細胞中的表達模式相似，這表明YTHDC2在介導不同性別之間的生育力和配子發(fā)生方面具有潛在的保守功能。

3.4 影響早期胚胎發(fā)育 mA修飾可能通過調(diào)節(jié)mRNA的衰變影響細胞周期進而影響早期胚胎發(fā)育過程。有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎中敲除后會導致神經(jīng)中放射狀膠質(zhì)細胞周期進程中斷，最終導致腦皮層厚度減小，甚至會出現(xiàn)出生后死亡的現(xiàn)象。而小鼠中的METTL3滅活或果蠅中的IME4（METTL3的同系物）滅活也會發(fā)生一定的胚胎致死率，這證明mA在譜系分化中起著至關重要的作用。Zhao等發(fā)現(xiàn)mA修飾會影響斑馬魚早期胚胎中的靶標mRNA的穩(wěn)定性和隨后的蛋白質(zhì)合成。斑馬魚胚胎中的的敲除減緩了阻礙了合子基因組的激活，使其在細胞周期的G2晚期或M早期處于阻滯狀態(tài)，并在整個幼蟲壽命中保持發(fā)育延遲。另一項研究報道了METTL3在著床前胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，METTL3介導的mA可能通過阻止mRNA降解來影響母體到合子的轉(zhuǎn)換和合子基因組的激活。

3.5 控制性別決定 mA修飾還與動物的性別決定有關。Haussmann等研究發(fā)現(xiàn)，mA在果蠅性別決定和劑量補償中起作用，IME4失活的果蠅盡管仍能存活并飛行，但表現(xiàn)出偏向雄性的性別發(fā)育。果蠅性別決定性的關鍵調(diào)節(jié)因子是RNA結(jié)合蛋白SXL，它在雌性中特異性表達。果蠅控制性別分化通常采用劑量補償機制，即上游的X:A的性染色體和常染色體比例決定下游的是否會被激活。Lence等研究發(fā)現(xiàn)雄性果蠅基本不受IME4的影響，而雌性果蠅中的缺失在基因型上表現(xiàn)出與雄性果蠅共有的外顯子插入以及雌雄果蠅獨有的剪切模式。這些結(jié)果表明，IME4破壞了果蠅體內(nèi)正常的劑量補償效應，并通過調(diào)控影響雌雄果蠅的存活。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)YT521-B（YTHDC1的同源物）是調(diào)節(jié)性別決定因子SXL的主要mA效應因子，YT521-B過表達可誘導雌性的特異性SXL剪接，該發(fā)現(xiàn)在其他研究中也得到證實。mA介導的基因表達調(diào)節(jié)可能是自然界發(fā)現(xiàn)的多種性別決定機制的關鍵步驟，目前只是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，這可能跟果蠅特殊的性別分化機制有關。在其他動物中的調(diào)控機制需進一步探究。

3.6 mA與人類生殖疾病相關 弱精子癥（Asthenozoos permia，AS）是男性不育的常見原因，實驗表明，與健康對照組相比AS患者精漿中的mA水平顯著增加，精子中METTL3可能調(diào)節(jié)某些與精子運動相關的基因的穩(wěn)定mRNA表達。mA不僅與某些代謝物水平減少相關，似乎與精子數(shù)量、運動性和曲線速度也顯著相關。與這個結(jié)果相似的是，通過分析特發(fā)性無精癥（Idiopathic Azoospermia，IA）患者的GEO數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，YTHDF3的過表達可能在精子發(fā)生障礙的機制中起重要作用。

表1 m6A甲基化修飾調(diào)控生殖發(fā)育過程的主要機制

卵巢早衰（Premature Ovarian Insufficiency，POI）是一種早期卵巢功能障礙，Ding等發(fā)現(xiàn)mA含量與POI風險高度相關，F(xiàn)TO調(diào)控的細胞凋亡會損害卵巢顆粒細胞功能并進一步引起卵巢癌。多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是一種常見的內(nèi)分泌失調(diào)，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)mA修飾引起卵巢過度刺激后PCOS患者黃素化顆粒細胞（GC）中與細胞凋亡相關基因上調(diào)，這可能與YTHDF2調(diào)節(jié)mRNA降解有關。上述這些結(jié)果暗示mA水平可能是導致人類不育的潛在生物標志物。

4 小 結(jié)

mA修飾作為表觀遺傳修飾的一種，以其廣泛的存在影響著生物各個組織的生長發(fā)育。在mRNA中，mA修飾可以通過不同的機制影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶主要通過單獨的或兩者協(xié)同作用調(diào)控兩性生殖和胚胎發(fā)育；去甲基化酶FTO主要調(diào)控卵母細胞成熟和卵巢發(fā)育，而ALKBH5主要調(diào)控精子發(fā)生和發(fā)育；閱讀蛋白YTHDC1、YTHDC2、YTHDF2主要在雌性生殖中起調(diào)節(jié)作用。這表明mA可能是通過不同的調(diào)控機制在動物配子發(fā)生過程中發(fā)揮不同作用?？偟膩碚f，mA調(diào)控兩性生殖以及早期胚胎發(fā)育主要是通過控制基因表達、選擇性剪接、mRNA降解和翻譯效率來實現(xiàn)的。

目前，仍存在以下問題需要研究人員去探究：1）mA甲基化是否和其他修飾聯(lián)合調(diào)控動物生殖系統(tǒng)發(fā)育；2）除了人和小鼠等模式動物，在其他家畜的生殖發(fā)育中mA修飾的功能以及作用機制是否相似？3）目前在動物生殖學方面的研究主要集中在mA甲基化產(chǎn)生的影響，其在生殖生育中的確切作用和潛在分子機制的全面系統(tǒng)研究尚不完善。通過檢測或調(diào)節(jié)甲基化作用酶的水平，有望成為診斷和治療某些生殖方面疾病的新突破口。未來對mA修飾在動物生殖上的深入研究不僅可以促進對表觀遺傳調(diào)控的理解，而且對人類生殖疾病的發(fā)生與治療以及在家畜繁殖育種中的應用有著積極作用。