豬增生性腸炎實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國(guó)，姚春陽(yáng)，張 穎，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬增生性腸炎（Porcineproliferative enteritis,PPE）是由胞內(nèi)勞森氏菌（Lawsonia intracellularis,LI）引起的一種以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征的豬的常見(jiàn)接觸性傳染性腸道傳染病。LI屬于脫硫弧菌科，革蘭氏陰性菌，菌體呈弧形彎曲狀、逗點(diǎn)狀或S形，是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，主要寄生在豬及其他動(dòng)物的回腸、結(jié)腸、盲腸黏膜的上皮細(xì)胞內(nèi)，可導(dǎo)致未成熟的腸道上皮細(xì)胞腺瘤樣增生[1]。1931年，PPE首次在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)。1993年，Lawson等首先從增生性腸病患豬的腸道分離出一種專(zhuān)性胞內(nèi)寄生菌，建立了細(xì)菌培養(yǎng)方法，并用該菌的純培養(yǎng)物成功復(fù)制出PPE病例。為紀(jì)念Lawson等在病原分離的貢獻(xiàn)，1995年McOrist等將該菌命名為胞內(nèi)勞森氏菌[2]。LI感染機(jī)體造成的病理?yè)p傷主要集中在腸道，根據(jù)其病理變化的不同，臨床上主要表現(xiàn)為急性的增生性出血性腸炎（Proliferative hemorrhagic enteritis, PHE）、壞死性腸炎（Necrotic enteritis, NE）、慢性的豬腸腺瘤樣?。≒orcine intestinaladenomatosis, PIA）及亞臨床感染等幾種感染形式，其中慢性型最為常見(jiàn)[3]。在自然界中LI能通過(guò)多種途徑傳播，如鳥(niǎo)類(lèi)、鼠、昆蟲(chóng)等動(dòng)物性傳播，人員、設(shè)備、車(chē)輛等流動(dòng)性傳播。易感動(dòng)物很多，除可感染豬以外，還可感染馬、兔、山羊、鹿、犬、狼、狐貍、大鼠、雪貂等動(dòng)物[4]。LI主要感染6～20周齡生長(zhǎng)肥育豬，病豬一般表現(xiàn)為被毛粗亂、食欲下降、拉稀、糞便稀軟呈黃棕色，生長(zhǎng)減緩甚至突然死亡[5]。目前該病已呈全球性流行，疾病的暴發(fā)和流行引起豬只生長(zhǎng)發(fā)育阻滯，飼料報(bào)酬率嚴(yán)重降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的危害和巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是影響世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)甚至亞洲的豬場(chǎng)，豬增生性腸炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。鑒于該病的流行性和危害性，迫切需要對(duì)其進(jìn)行深入研究，而建立快速、準(zhǔn)確、有效的診斷方法是防治該病的前提。本文綜述了近年來(lái)PPE的最新實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展，以期為疾病的防治提供參考。

1 組織病理學(xué)診斷

1.1 病理剖檢

PPE的剖檢病變以小腸及結(jié)腸黏膜增厚，出血或壞死為典型特征。腸黏膜增生呈現(xiàn)增生性花紋或分枝狀皺褶，嚴(yán)重時(shí)似腦回狀；腸管外徑變粗，漿膜下和腸系膜常見(jiàn)水腫。增生壞死性腸段表現(xiàn)有臌氣或炎性分泌物和積水現(xiàn)象，腸段較薄。壞死性腸炎的病變還可見(jiàn)凝固性壞死和炎性滲出物形成灰黃色干酪樣物，牢固地附著在腸壁上。出血性腸病的病變類(lèi)似于增生性腸病，但很少波及大腸，主要在小腸末端，表現(xiàn)為小腸壁局部增厚，腸腔內(nèi)有血液，結(jié)腸內(nèi)積有含血的糞便。局限性回腸炎的腸壁肌肉呈顯著肥大，如同硬管，習(xí)慣上稱(chēng)“襪管腸”。打開(kāi)腸腔，可見(jiàn)潰瘍面常呈條形，毗鄰的正常黏膜呈島狀[7]。根據(jù)臨床癥狀及剖檢病變僅可做出初步診斷，PPE引起的腸炎臨床表現(xiàn)無(wú)法從肉眼上與豬圓環(huán)病毒病等引起的腸炎相區(qū)分，確診還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)室診斷。

1.2 組織染色法

取PPE病例的腸黏膜、糞便等涂片或組織切片染色鏡檢，進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以證實(shí)是否存在LI感染。組織染色法可以用于某些時(shí)期大量樣本的快速診斷。LI常用的染色法有H.E染色法、Warthin-Starry（WS）銀染法、抗酸染色法、萋-尼氏（Ziehl Neelsen）染色法等[8]。肖愛(ài)歡等（2009）[9]取豬回腸等組織固定后，制作石蠟切片，H.E染色，在顯微鏡下觀察到在回腸處有豐富的集合淋巴小結(jié)，且該部位腺窩杯狀細(xì)胞消失，上皮細(xì)胞增生。鍍銀染色法可檢測(cè)到組織中彎曲樣細(xì)菌，但對(duì)于自溶和壞死樣品具有限制性且無(wú)特定性。羅玲等（2008）[10]報(bào)道，將病變?cè)錾阅c段做成切片，經(jīng)鍍銀染色法后，在上皮細(xì)胞的頂部胞漿中觀察到有大量的LI。LI革蘭氏染色陰性，抗酸染色陽(yáng)性，Ziehl Neelsen染色呈紅色。組織染色法具有快速、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，但其不足之處是特異性較差，特別是對(duì)鏡檢未見(jiàn)黏膜增生性變化的病例及壞死的或自溶組織樣品時(shí)存在明顯的非特異性。

1.3 免疫組化法（IHC）

IHC是應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽或蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。Gebhart等（1991）[11]使用特殊標(biāo)記的1.8 kb特異性DNA片斷，進(jìn)行回腸段冰凍組織中胞內(nèi)勞森氏菌的免疫組織化學(xué)診斷。Kim等（2000）[12]首次用抗LI膜蛋白單抗建立免疫組化法，檢測(cè)增生性腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)頂端是否存在LI，并與PCR鑒定結(jié)果進(jìn)行比較。田城（2012）[13]在被LI感染的大鼠回腸上皮細(xì)胞（IEC-18）中，經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)法，觀察到胞漿中有特異性染色的彎曲樣桿菌。其中一抗為鼠抗LI單克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。Guedes等（2003）[14]比較了PPE的不同診斷方法，結(jié)果表明，對(duì)于PPE病例組織中LI的檢測(cè)，IHC染色的敏感性（86.3%）高于H.E染色（36.8%）及WS染色（50%），IHC檢測(cè)結(jié)果與PPE感染后4周的肉眼觀察結(jié)果有很高的相關(guān)性（82.5%），認(rèn)為IHC是最好的福爾馬林固定樣品診斷方法。IHC可從黏膜已完全破壞的病例中檢測(cè)出LI，也可檢出康復(fù)階段只有黏膜固有層單核細(xì)胞存在的LI。

2 細(xì)菌分離與鑒定

LI的分離培養(yǎng)是PPE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。由于LI是一種專(zhuān)性胞內(nèi)寄生菌，目前尚不能用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法培養(yǎng)，也不適應(yīng)雞胚增殖，但其可在某些特定的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行體外分離和培養(yǎng)。適于LI生長(zhǎng)的細(xì)胞系有IEC-18、豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）、人小腸上皮細(xì)胞（INT 407、Henle407）、鼠結(jié)腸癌細(xì)胞、豚鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（GPC-16）以及小鼠成纖維細(xì)胞（McCoy）等。由于該菌具有細(xì)胞依賴(lài)性呼吸作用和磷酸鹽制造能力，因此在細(xì)胞培養(yǎng)中需要維持微需氧環(huán)境（4%～10%的二氧化碳和0～10%的氧氣），并且要加入一定的抗生素以防止其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。感染的細(xì)胞單層一般不出現(xiàn)細(xì)胞病變。Lawson等（1993）[15]利用處理過(guò)的感染豬的回腸勻漿感染IEC-18細(xì)胞，在82.8%氮?dú)狻?.8%二氧化碳、8%氧氣環(huán)境中成功分離到該菌。Koyama等（2006）[16]對(duì)日本分離株進(jìn)行體外培養(yǎng)，用腸黏膜提取物接種IEC-18細(xì)胞和Hep-2細(xì)胞，接種5 d后，用兔抗LI抗體染色，觀察到LI，其培養(yǎng)液中LI的濃度為104個(gè)/mL。LI因其特殊的培養(yǎng)條件，目前世界上分離到的菌株十分有限，國(guó)內(nèi)也未見(jiàn)有經(jīng)細(xì)胞成功分離出LI的報(bào)道，給該菌致病機(jī)理和防控技術(shù)等研究造成了很大障礙，限制了研究的深入。

3 血清學(xué)檢測(cè)方法

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA具有操作簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)，可用于大批量LI感染或疫苗免疫后血清抗體樣本的檢測(cè)，被廣泛用于PPE的診斷和豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。目前用于LI檢測(cè)的ELISA方法主要是間接 ELISA方法，選取的包被抗原有全菌、脂多糖（LPS）、脫氧膽酸鹽（DOC）、Lsa A蛋白、LI外膜蛋白、重組鞭毛鉤基體復(fù)合蛋白（flgE）等[17]，已有多種商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒。Holyoake等（1994）[18]以LI離心沉淀后的全菌作包被抗原建立間接ELISA方法。Watarai等（2004）[19]以LI Lsa A蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法。Kroll等（2005）[20]用LI毒株純培養(yǎng)物提取的LPS作為包被抗原建立LPS- ELISA方法。與IFA（間接免疫熒光抗體試驗(yàn)）相比，LPS包被的ELISA可檢測(cè)出更多的IgG，其敏感性（99.5%）及特異性（100%）比IFA高，可用于LI感染的早期檢測(cè)，其結(jié)果不受細(xì)菌分離株（疫苗株或野毒株）差異的影響。Boesen等（2005）[21]以LI脫氧膽酸鹽為包被抗原建立DOC-ELISA方法，該方法的特異性（99.3%）及敏感性（98%）與LPS包被的間接ELISA相似，而高于IFA及IPMA（免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)）。黃忠等（2006）[22]對(duì)采自福建、廣東、廣西、湖南、湖北5省區(qū)22個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的1 100份血清樣品進(jìn)行了ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，22個(gè)豬場(chǎng)均有LI感染，其中18～24周齡的豬陽(yáng)性率高達(dá)90%，后備母豬和母豬陽(yáng)性率高達(dá)50%～100%，10周齡以下豬的陽(yáng)性率一般低于50%。Wattanaphansak等（2008）[23]以超聲處理的LI純培養(yǎng)物作為包被抗原建立ELISA方法，能檢測(cè)到LI感染后2～4周的轉(zhuǎn)化血清，靈敏度為89.8%，特異性為99.4%。蔣增艷等（2008）[24]采用ELISA方法對(duì)國(guó)內(nèi)LI感染情況和流行情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有受檢豬場(chǎng)LI抗體均為陽(yáng)性，其中受檢豬場(chǎng)中肥育豬陽(yáng)性率為99%。張曙儉（2012）[25]、劉磊（2013）[26]先后以LI外膜蛋白1102、1024建立間接ELISA方法。吳艷陽(yáng)等（2018）[27]以純化后的LI Lsa A蛋白為包被抗原建立間接ELISA方法。廖榮莉等（2021）[28]以純化的LI重組鞭毛鉤基體復(fù)合蛋白flgE為包被抗原建立間接ELISA方法。結(jié)果顯示，母豬和肥育豬的感染率高達(dá)100%；母源抗體下降后，自50日齡起到肥育豬階段，LI陽(yáng)性率和抗體水平隨著日齡的增長(zhǎng)而不斷上升。ELISA檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可用于大批量樣本檢測(cè)，節(jié)省人力和物力，但是也有一定的缺點(diǎn)，如不同批次存在一定差異，操作環(huán)節(jié)較多，存在很多影響因素等。

3.2 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）

IFA可用已知抗原檢測(cè)未知抗體，也可用已知抗體檢測(cè)未知抗原，具有靈敏度較高、特異性較強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。Lawson等（1988）[29]用IFA試驗(yàn)對(duì)人工感染 LI的豬進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果表明早期出現(xiàn)的抗體主要是IgM，其次為IgA。Knittel等（1998）[30]用純化的LI培養(yǎng)物作抗原，豬血清為第一抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗豬IgG抗體為第二抗體，以此改進(jìn)IFA，可檢測(cè)到LI的IgG抗體。其在評(píng)估PCR和IFA檢測(cè)LI感染情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)在感染21～28 d，PCR檢出率為39%，IFA檢出率為90%，且在豬死前檢測(cè)IFA方法敏感性遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)。Tomanova等（2003）[31]用IFA檢測(cè)抗LI-IgG抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)，IFA可用于活體中LI的檢測(cè)。Huerta等[32]（2003）設(shè)計(jì)了一組雙盲試驗(yàn)，比較PCR與IFA、剖檢、H.E染色后組織病理學(xué)觀察和Warthin-Starry銀染4種方法在PPE診斷中的效果。發(fā)現(xiàn)IFA的靈敏度為89%、特異性為97%，與PCR檢測(cè)結(jié)果的符合率為82%，可以作為豬宰后PPE診斷的一種替代方法。陳長(zhǎng)風(fēng)（2019）[33]通過(guò)表達(dá)LI熱休克蛋白（Hsp60）重組蛋白，利用制備的單克隆抗體9G作為一抗，使用FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗，建立了IFA檢測(cè)方法，靈敏度高達(dá)102個(gè)菌/mL。使用該法檢測(cè)了25份臨床樣品，與PCR方法符合率為100%。IFA具有較高的特異性和敏感性，但也存在一定的缺點(diǎn)，如操作和儀器要求較高，存在非特異性染色造成結(jié)果的假陽(yáng)性，在結(jié)果觀察時(shí)存在較大的人為主觀性等。

3.3 免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)（IPMA）

IPMA是一種血清學(xué)免疫酶測(cè)定試驗(yàn)，可用于豬感染 LI后血清抗體檢測(cè)，敏感性與IFA法相當(dāng)。與IFA相比，IPMA不需要熒光顯微鏡，并且著色后的微孔板可以穩(wěn)定保存數(shù)月，可為診斷提供更為直觀的證據(jù)。Guedes等（2002）[34]應(yīng)用IPMA和IFA兩種方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，比較人工口服接種LI感染的腸黏膜勻漿，檢測(cè)感染后7 d、14 d、21 d、28 d的抗體水平，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合率為98.6%。Corzo等（2005）[35]收集29個(gè)豬場(chǎng)的523份血清，與培養(yǎng)有LI的單層細(xì)胞96孔板（已用丙酮和甲醇固定）進(jìn)行反應(yīng)，再加入抗豬 IgG 酶標(biāo)抗體與血清中特異性抗體結(jié)合，染色后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色結(jié)果。該報(bào)道還與IFA進(jìn)行了比較，評(píng)價(jià)兩者在檢測(cè)自然感染豬血清樣本時(shí)的準(zhǔn)確度和一致性。結(jié)果認(rèn)為，IFA的假陰性較多，而IPMA假陽(yáng)性較多。IPMA可用于生前檢測(cè)，但存在一定的不足，如其操作技術(shù)要求高、成本高、假陽(yáng)性高，不適合大批量樣品檢測(cè)等。

3.4 電子探針?lè)治黾夹g(shù)（EPMA）

李磊（2014）[36]探索并建立了LI的EPMA抗體檢測(cè)方法，摸索了該方法的最佳HRP-Protein A工作濃度為1∶2 000，最佳孵育時(shí)間為1 h，底物顯色最佳時(shí)間為15 min。該方法特異性好、敏感化強(qiáng)、操作流程方便，適用于LI抗體的檢測(cè)，為PPE疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)、流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)檢疫提供了一種新的技術(shù)手段。

4 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

4.1 PCR

PCR技術(shù)具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，是目前作為檢測(cè)糞便和腸內(nèi)容物中LI的金標(biāo)方法?？捎妹奘米訌呢i肛門(mén)采樣或采集新鮮糞便樣品，也可用于感染豬死后病理材料的檢測(cè)。PCR方法通常根據(jù)LI菌染色體DNA或16S rRNA部分基因片段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR或套式 PCR（nest-PCR）擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，電泳后判定結(jié)果。PCR方法其靈敏度高于病理剖檢、組織染色、免疫組化、細(xì)胞接種培養(yǎng)等方法，其檢測(cè)樣本需要量小、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、特異性高。

Jones等（1993）[37]和McCormick等（1995）[38]根據(jù)LI的16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物建立PCR法，可從感染豬腸黏膜中檢測(cè)出10個(gè)LI純培養(yǎng)物或從每克糞樣中檢測(cè)出1 000個(gè)LI。Jensen等（1997）[39]將65份肉眼判斷為PPE感染的腸道病料，用Warthin-Starry法鍍銀染色，檢出陽(yáng)性62份（95%）；用IHC染色，檢出陽(yáng)性64份（98%）；以PCR法檢測(cè)，檢出陽(yáng)性63份（97%）。說(shuō)明這3種方法，包括有經(jīng)驗(yàn)的肉眼判斷，均有相當(dāng)?shù)目煽啃?。?duì)22份肉眼認(rèn)為疑似PPE的病料，用PCR法檢出陽(yáng)性的有17份（77%），用IHC檢出陽(yáng)性的有14份（64%），PCR檢出率較高。Jodan等（1999）[40]認(rèn)為，PCR最敏感，IFA次之，Warthin-Starry鍍銀染色法再其次。Suh等（2000）[41]根據(jù)LI的210 bp基因片段建立了一步法PCR，其中腸黏膜檢出率達(dá)94%，糞便樣本檢出率達(dá)88%，樣本檢測(cè)的敏感性可達(dá)100 pg。Jacobson等[42]（2003）使用了一種模擬DNA（mimic DNA），以證實(shí)糞便樣品中是否存在抑制因子，該DNA在PCR反應(yīng)體系中能被LI特異性引物擴(kuò)增。張曙儉（2012）[25]、郭建超等（2014）[43]、孫娜等（2017）[44]先后根據(jù)16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物建立了PCR方法。董炳梅等（2011）[45]通過(guò)擴(kuò)增天冬氨酸蛋白酶（aspA）基因建立PCR方法，陽(yáng)性樣品最低檢出量為1.7×102拷貝/μL。

套式PCR與普通PCR相比，特異性更強(qiáng)，敏感性更高。Moller等（1998）[46]、Dongkyun等（2000）[47]先后建立套氏PCR方法，檢測(cè)LI、致病性沙門(mén)氏菌和豬痢疾螺旋體3種病原體。Jacobson等（2003）[42]使用7種不同糞便前處理方法和4種不同DNA聚合酶進(jìn)行PCR或套式PCR。發(fā)現(xiàn)PCR檢測(cè)組織樣品的靈敏度可達(dá)10～100個(gè)菌/管，套式PCR檢測(cè)糞便樣品的靈敏度可達(dá)100～1 000個(gè)菌/管。Joanna等（2004）[48]應(yīng)用套式PCR和IFA法檢測(cè)LI，從波蘭各地采集了364份非感染豬回腸和結(jié)腸腸樣及364份血清，應(yīng)用套式PCR法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品194份，IFA檢測(cè)陽(yáng)性樣品322份，結(jié)果顯示，套式PCR適合LI早期診斷。張文波等（2014）[49]、彭忠等（2017）[50]先后建立檢測(cè)豬LI的套氏PCR方法并驗(yàn)證該方法具有快速、方便和敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。La等（2006）[51]建立檢測(cè)LI、豬痢疾短螺旋體、多毛結(jié)腸短螺旋體的多重PCR方法，檢測(cè)192份糞便樣本，分別擴(kuò)增655 bp、354 bp和823 bp片段，檢測(cè)靈敏度最低為每克糞便樣本中102～103個(gè)LI。王恒（2020）[52]建立多重PCR方法檢測(cè)LI、豬痢疾短螺旋體、艱難梭菌3種病原，其中LI選取asp A基因。

納米金 PCR（Nanogold-assisted PCR）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型技術(shù)，它是在普通PCR基礎(chǔ)上添加納米金顆粒，使納米金材料對(duì)普通PCR原有體系進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系，提高反應(yīng)的靈敏度和特異性。白云等（2016）[53]根據(jù)LI 16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物建立了納米金PCR方法，結(jié)果表明該方法檢測(cè)靈敏度比普通PCR高100倍，適用于LI的臨床快速檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查。

PCR方法的建立與應(yīng)用為PPE的疫病診斷及流行病學(xué)、傳播途徑的研究提供了快速、簡(jiǎn)便和有用的工具。但是該方法也存在一定的不足：一是基因的選取，盡量選取保守區(qū)基因；二是引物非特異性，引起假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果；三是該方法的檢測(cè)結(jié)果受排菌期的影響；四是糞便樣本中PCR抑制因子的影響。Jordan等（1999）[40]認(rèn)為隱性攜菌但不排菌時(shí)無(wú)法鑒定PPE，由于在亞臨床或慢性感染的病例中，間歇排菌比較常見(jiàn)，因此用PCR檢測(cè)糞樣時(shí)可能造成假陰性。

4.2 熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR與PCR相比，具有定量、更高的特異性和靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法主要是SYBR Green I染料法和探針?lè)?，前者操作?jiǎn)單，成本低；后者特異性更高強(qiáng)，假陽(yáng)性率較低。Wattanaphansak等（2008）[23]根據(jù)LI的asp A基因設(shè)計(jì)引物，成功建立SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，定量檢測(cè)田間樣品中的LI。馬景霞等（2015）[54]根據(jù)LI基因組asp A序列設(shè)計(jì)引物建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法，靈敏度為17.5拷貝/μL。鄭新添等（2015）[55]根據(jù)LI 16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法，最小可檢測(cè)到10拷貝/μL的重組質(zhì)粒。該方法對(duì)糞便及小腸組織中LI的檢出率分別為46.9%和84.2%，高于普通PCR的檢出率（分別為40.7%和78.9%）。Lindecrona等（2002）[56]根據(jù)LI 16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了TaqMan熒光定量PCR方法，在204個(gè)臨床樣品中，有111個(gè)樣品（54%）檢測(cè)為L(zhǎng)I陽(yáng)性，而用IHC法檢測(cè)只有98個(gè)樣品為陽(yáng)性（48%），其檢測(cè)靈敏度超過(guò)免疫組化法。Richter等（2010）[57]根據(jù)LI 16S rRNA建立的TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR，用于檢測(cè)豬糞便和腸道內(nèi)LI，在腸黏膜刮取物最低能檢測(cè)到DNA量達(dá)4拷貝/管，在糞便和組織最低能檢測(cè)到DNA量達(dá)18拷貝/管。田城（2012）[13]根據(jù)LI 16S rDNA保守序列設(shè)計(jì)引物和探針建立TaqMan熒光定量PCR方法，利用該方法對(duì)173份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與套式PCR基本一致，符合程度較高。陳世界等（2013）[58]根據(jù)LI asp A基因序列設(shè)計(jì)引物和探針建立的TaqMan熒光定量PCR，其敏感性高于套式PCR方法。鄭新添等（2014）[59]、白挨泉等（2014）[60]根據(jù)LI 16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物和探針建立的TaqMan熒光定量PCR，對(duì)豬糞便樣品中LI進(jìn)行定量檢測(cè)，最低檢出量分別為10拷貝/μL和5.55拷貝/μL。熒光定量PCR方法適用于大量樣本的檢測(cè)，為L(zhǎng)I的早期快速定性檢測(cè)和定量分析以及PPE的致病機(jī)理研究提供了技術(shù)支持，也為PPE分子診斷試劑盒的研制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。但是由于本方法操作嚴(yán)謹(jǐn)、靈敏度高、容易出現(xiàn)氣溶膠污染，造成定量結(jié)果的不準(zhǔn)確性。另外本方法需要精密儀器和專(zhuān)業(yè)人士操作，也是局限之一。

4.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

LAMP技術(shù)為一種新型、快速基因擴(kuò)增方法，能在恒溫（60～65 ℃）條件下，短時(shí)間（通常是1 h）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有快速、敏感、特異、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。Park等（2015）[61]、羅露（2015）[62]、Li等（2018）[63]先后成功建立快速檢測(cè)豬糞便樣本中LI的LAMP方法，敏感性為普通PCR的100倍。LAMP不僅可以在實(shí)驗(yàn)室短時(shí)間操作完成，也能在現(xiàn)場(chǎng)操作，而且不需要繁瑣的操作步驟和實(shí)驗(yàn)室精密的儀器，通過(guò)肉眼便可直接觀察。但是，該技術(shù)由于靈敏度較高，容易受氣溶膠污染影響結(jié)果。另外該方法需要多對(duì)引物，容易造成引物之間的非特異性結(jié)合而影響結(jié)果。

4.4 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）

RPA是一種近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域不同病原的快速檢測(cè)。Wu等（2019）[64]建立了檢測(cè)LI的RPA方法，該方法在25～40 ℃下，30 min即可完成，不需要借助電泳，通過(guò)肉眼直接觀察結(jié)果，并且其結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。劉立兵等（2020）[65]根據(jù)LI菌16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物和Exo探針建立了RPA方法。該方法能夠在39 ℃恒溫條件下，20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)LI的有效檢測(cè)，并且結(jié)果同LAMP和熒光定量PCR方法一致。RPA技術(shù)的缺點(diǎn)是反應(yīng)條件要求較高，且需要最適的酶反應(yīng)條件。

4.5 原位雜交（ISH）

Jones等（1993）[66]利用地高辛標(biāo)記的1.8 kb的LI特異性探針從病豬糞便中檢測(cè)LI基因組DNA，其所建立的核酸探針雜交法的檢測(cè)極限為每克糞便中有107個(gè)LI。Gebhart等（1994）[67]用一種與16S rRNA的高變區(qū)序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針成功地與LI進(jìn)行了雜交，建立了精確檢測(cè)LI的DNA探針?lè)治龇?。Boye等（1998）[68]建立一種檢測(cè)LI的熒光16S rRNA原位雜交方法，熒光探針能與16S rRNA基因序列結(jié)合。Weissenbock等（2007）[69]以地高辛標(biāo)記的LI的16S rRNA序列為探針對(duì)福爾馬林固定的組織切片進(jìn)行原位雜交，對(duì)PCR陽(yáng)性的PPE樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果原位雜交陽(yáng)性率為71%，其敏感性高于WS銀染法（陽(yáng)性率為41%）。ISH法耗時(shí)費(fèi)力，且操作需要經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，因此在PPE亞臨床感染的診斷、流行病學(xué)和群體監(jiān)測(cè)中應(yīng)用較少。

4.6 PCR-酶聯(lián)寡核苷酸探針捕獲法

Zhang等（2000）[70]采用PCR-酶聯(lián)寡核苷酸探針捕獲法替代PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖電泳和EB染色。該方法使用的微孔板上固定有胺修飾的DNA捕獲探針，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（生物素標(biāo)記）可以與其雜交，形成親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定450 nm時(shí)的吸光度值可以反映出產(chǎn)物量的真實(shí)變化。此方法可以檢測(cè)到0.8 ng的DNA，而EB染色僅能檢測(cè)到6.1 ng。應(yīng)用該法對(duì)315份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其特異性為100%、靈敏度為74%、準(zhǔn)確率為94%。

5 小結(jié)

胞內(nèi)勞森氏菌是一種重要的腸道致病菌，雖然該菌引起的豬增生性腸炎主要表現(xiàn)為亞臨床癥狀，很少引起豬群的大批死亡[71]，但是由于該菌常與其他多種腸道病原混合感染，已經(jīng)嚴(yán)重影響豬只的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國(guó)集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，LI在全國(guó)范圍內(nèi)不同豬場(chǎng)抗體陽(yáng)性率的不斷增加，提示養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)提高對(duì)LI感染的重視度，加強(qiáng)血清學(xué)監(jiān)測(cè)，及早采取有效措施控制LI感染在我國(guó)的發(fā)生和流行。一種特異、靈敏、操作方便且快速檢測(cè)LI的檢測(cè)方法，對(duì)豬群中PPE的監(jiān)測(cè)、預(yù)防、控制和清除具有重要意義。上述PPE的診斷方法多種多樣，技術(shù)在不斷的革新和完善，但是每種方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和實(shí)用性，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適宜的方法。目前國(guó)內(nèi)對(duì)PPE臨床感染情況的相關(guān)研究報(bào)道仍然很少，相信隨著人們對(duì)LI相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能的深入研究及對(duì)菌株與宿主間相互作用機(jī)制的正確認(rèn)識(shí)，PPE的各種診斷方法將會(huì)得到進(jìn)一步改進(jìn)和完善，向著更加敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便、高效的方向發(fā)展，并在綜合防控與凈化中發(fā)揮重要作用，從而達(dá)到根除疾病的目的。