不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌物的GC-MS分析

李艷春，葉 菁,王義祥

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/福建省紅壤山地農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013)

茶樹(Camelliasinensis(L.) O. Kuntze)是我國(guó)重要的特色經(jīng)濟(jì)作物，但多年宿根連作后茶樹會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)量下降、品質(zhì)變差的連作障礙問題[1-2]?；凶远咀饔帽徽J(rèn)為是引起植物連作障礙的主要原因之一，探究自然連作狀況下鐵觀音茶樹根系分泌物組分和含量的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)進(jìn)一步闡明鐵觀音茶樹連作障礙機(jī)理有重要意義。據(jù)報(bào)道，宿根連作20年鐵觀音茶樹的茶葉產(chǎn)量、光合速率和茶芽密度都比10年鐵觀音茶樹顯著降低了54.6%、13.3%和24.6%，茶鮮葉的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素含量等品質(zhì)指標(biāo)也比10年鐵觀音茶樹的顯著降低[2]。目前普遍認(rèn)為土壤理化性質(zhì)改變、微生物群落結(jié)構(gòu)失衡和化感自毒作用是引起植物連作障礙的3個(gè)重要原因[3-6]。關(guān)于茶樹連作障礙問題，已有較多學(xué)者從根際微生態(tài)失衡方面進(jìn)行研究并發(fā)現(xiàn)，隨著鐵觀音茶樹種植年限的增加，土壤微生物種類大量減少，結(jié)構(gòu)更加單一[7]；假單胞菌、慢生根瘤菌、產(chǎn)黃桿菌等一些植物有益菌急劇減少，鏈格孢菌等植物病原菌數(shù)量卻不斷增多[8-9]。關(guān)于茶樹根系分泌物的自毒作用方面，Ye等人[10]研究指出，鐵觀音、本山、黃棪茶樹連作9年后根際土壤中積累了較多的自毒物質(zhì)，被認(rèn)為是引起茶葉品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低的重要原因。Arafat等[11]認(rèn)為根系分泌物中的(+)-兒茶素對(duì)鐵觀音茶樹根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化有較大影響。Kaur等人[12]認(rèn)為，植物根系分泌的自毒物質(zhì)在土壤中發(fā)生了土壤吸附、微生物分解等物理、生物變化過程，可能并不是在前后茬作物間直接產(chǎn)生毒害，而只是作為誘因通過改變根際微生態(tài)平衡間接地影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，一些學(xué)者認(rèn)為根系分泌物的間接生態(tài)效應(yīng)及其引起的土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡是導(dǎo)致植物連作障礙的主要因素[13-15]。目前對(duì)于宿根連作鐵觀音茶樹根系分泌物的研究較少，自然連作狀況下茶樹根系分泌物組分、含量以及與微生物群落之間的關(guān)系尚不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。針對(duì)鐵觀音茶樹連作障礙問題，利用原位取土法收集不同宿根年限(0年、1年、10年、20年)的鐵觀音根際土，借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析和鑒定不同連作年限鐵觀音根系分泌物的化學(xué)組分及其含量變化，篩選影響連作障礙的關(guān)鍵根系分泌物，為進(jìn)一步揭示鐵觀音茶樹連作障礙機(jī)理提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以福建省安溪縣感德鎮(zhèn)定點(diǎn)觀測(cè)試驗(yàn)站(25°18′N，117°51′E)內(nèi)的鐵觀音茶樹為研究對(duì)象，該區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫15～18℃，年平均降雨量1700～1900 mm，是名茶鐵觀音主產(chǎn)區(qū)之一。選取海拔高度、坡向和坡位及管理水平基本一致的宿根連作1年、10年、20年的鐵觀音茶園各3個(gè)，每個(gè)茶園小區(qū)面積不小于15 m × 15 m，鄰近未種植過茶樹的荒地土壤作為對(duì)照。采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行根際土壤取樣，方法如下：挖開茶樹周邊土壤，用小刀慢慢剝離根系上附著的土壤，離根系1 cm的土壤抖落下來為根際土壤。

1.2 根系分泌物的提取

將采集的根際土壤研磨過1 mm篩，精確稱量5 g土壤置于50 mL的離心管中，加入30 mL 80%甲醇溶液(-20℃)，室溫超聲3 h，在4℃條件下3500 rpm離心10 min，取20 mL上清液到另一新的50 mL離心管中；再次往沉淀中加入20 mL 80%甲醇溶液(-20℃)，重復(fù)以上步驟，取15 mL上清液合并到上述50 mL離心管中，利用真空濃縮儀濃縮至2 mL；在4℃條件下3500 rpm離心10 min，取上清液1800 μL經(jīng)過0.22 μm膜過濾，利用真空濃縮儀將其濃縮至盡干；加入甲氧基溶液100 μL后渦旋振蕩持續(xù)30 s，在37℃條件下反應(yīng)2 h；之后再加入BSTFA 試劑60 μL(含 1%三甲基氯硅烷)，37℃反應(yīng)90 min，在4℃條件下12000 rpm離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至檢測(cè)瓶中；從每個(gè)檢測(cè)樣本中吸取20 μL混合成為QC樣本以校正誤差；用剩余的待測(cè)樣本用于GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析條件

氣相色譜柱采用HP-5MS毛細(xì)管柱(5%苯/95%甲基聚硅氧烷，30 m × 250 μm × 0.25 μm)，載氣：氦氣，流速1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：1 μL(分流比20∶1)；注射溫度為280℃，接口設(shè)置為150℃和離子源調(diào)整到230℃。升溫程序：初始60℃，持續(xù)2 min，10℃·min-1的速率升至300℃，持續(xù)5 min。質(zhì)譜全掃描范圍：35～750(m/z)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用G1701 MSD ChemStation軟件將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成netCDF格式，利用R軟件XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過濾、峰對(duì)齊，得到保留時(shí)間、質(zhì)核比、峰面積等信息，利用AMDIS程序應(yīng)用NIST質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)和Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分泌物的注釋。為便于不同量級(jí)數(shù)據(jù)的分析比較，將數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積歸一化。利用SIMCA-P(v13.0)和R語言ropls包進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、主成分分析(PCA)以及正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。采用t-檢驗(yàn)和OPLS-DA相結(jié)合的方法進(jìn)行差異代謝物篩選(VIP>1和P<0.05)。利用R語言pheatmap程序包進(jìn)行聚類熱圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS結(jié)果分析

通過GC-MS分析，首先得到不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌物的總離子流圖(圖1)。4份根系分泌物成分的出峰時(shí)間和相對(duì)峰強(qiáng)度都有明顯區(qū)別。

圖1 不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of root exudates from Tieguanyin tea plants grown under different years of continuous cropping注：Y0、Y1、Y10、Y20分別為宿根連作0年、1年、10年、20年的鐵觀音茶樹。圖2，圖3同。

用GC-MS檢測(cè)到鐵觀音根系分泌物中共有52種代謝物，其中有機(jī)酸13種(25%)、糖類11種(21%)、醇類16種(31%)、甾醇4種(8%)、酚酸類2種(4%)、二萜類1種(2%)以及其他有機(jī)物5種(10%)(表1)。用差異倍數(shù)(FC)表示初始值到最終值的變化程度，對(duì)差異倍數(shù)取對(duì)數(shù)表示差異的相對(duì)變化趨勢(shì)。相對(duì)于0年(CK)，不同種植年限下鐵觀音根系分泌物的含量變化趨勢(shì)見表1。

表1 不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌代謝物成分及差異倍數(shù)

(接表1)

2.2 不同種植年限鐵觀音根系分泌物的PLS-DA分析

采用PLS-DA分析對(duì)不同種植年限鐵觀音根系分泌物的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化、降維和判別分析。結(jié)果表明：不同種植年限鐵觀音的根系分泌物呈現(xiàn)明顯的分組，PLS-DA對(duì)于自變量X和因變量Y的擬合度分別為R2X=0.983，R2Y=0.991，預(yù)測(cè)度Q2=0.976，說明模型擬合效果較好(圖2)。在200次的置換檢驗(yàn)中隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2和Q2值都小于原始值，直線斜率大，表明PLS-DA模型沒有出現(xiàn)過擬合，該模型較為可靠，能夠依據(jù)VIP值篩選差異代謝物。

圖2 不同種植年限鐵觀音根系分泌物PLS-DA得分及置換檢驗(yàn)Fig.2 PLS-DA score map and model test results on root exudates from Tieguanyin tea plants grown under different years of continuous cropping

2.3 不同種植年限鐵觀音根系分泌物的差異代謝物篩選

為進(jìn)一步找到不同處理間主要差異代謝物，根據(jù)PLS-DA第一主成分變量投影重要性值(VIP值)結(jié)合方差分析篩選差異代謝物(VIP > 1且P< 0.05)，得到18種主要差異代謝物(表2)。隨著種植年限的增加，6個(gè)醇類化合物(2-單戊二酰甘油、2-單硬脂酰甘油、二十醇、二十九醇、木糖醇、甘露醇)、3個(gè)糖類化合物(肌醇半乳糖苷、異麥芽糖和麥芽糖)、以及4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、DL-β-羥基丁酸、十七烷酸的相對(duì)含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。相反地， 4個(gè)糖類化合物(果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖)、十五烷酸、磷酸的相對(duì)含量隨著種植年限的增加呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

2.4 差異代謝物熱圖分析

將18種差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類分析(圖3)。每一列代表一個(gè)樣本，每一個(gè)格子代表一種代謝物，顏色深淺代表代謝物的含量高低。0年(CK)和1年聚在一起，10年和20年聚在一起，說明篩選出的差異代謝物能將各處理聚類區(qū)分開來。差異代謝物經(jīng)過聚類也能聚成簇，說明每一簇代謝物可能參與了相同的代謝途徑或者具有相似的功能。

圖3 差異代謝物的熱圖聚類分析Fig.3 Heat map of differential exudate metabolites

3 討論與結(jié)論

目前，對(duì)于不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌物的鑒定以及含量動(dòng)態(tài)變化的研究比較少。根系分泌物的提取大致有水培、土培、基質(zhì)培養(yǎng)等多種方法。從根際土壤提取根系分泌物的方法與植物自然生長(zhǎng)狀態(tài)最接近，其優(yōu)點(diǎn)在于由于土壤機(jī)械阻力的存在，根系分泌作用更加旺盛，根系分泌物的量要比液體培養(yǎng)條件下收集到的量更高[16]，該提取方法很容易受到土壤微生物代謝和分解的干擾，但是可以反映出在自然生長(zhǎng)狀況下植物根系分泌的真實(shí)情況。本研究表明，不同種植年限鐵觀音茶樹根系分泌物中鑒定出的代謝物質(zhì)主要有糖類、有機(jī)酸類、醇類、甾醇、酚酸、二萜類等，各類物質(zhì)的相對(duì)含量隨著種植年限的增加發(fā)生變化。

目前研究公認(rèn)酚酸類物質(zhì)是造成連作障礙的主要化感物質(zhì)，苯甲酸及其衍生物已在多種作物中，如黃瓜、大豆等被確認(rèn)為化感物質(zhì)[17-18]；土壤中的對(duì)羥基苯甲酸含量隨著花生連作年限的增加而增加[19]，鄰苯二甲酸被認(rèn)為是辣椒中的主要化感物質(zhì)之一[20]；本研究中，4-羥基-3-甲氧基苯甲酸隨著鐵觀音連作年限的增加而增加，呈上調(diào)的趨勢(shì)，是潛在的化感物質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，4-羥基-3-甲氧基苯甲酸存在于地黃根際土壤中并且具有很強(qiáng)的自毒作用[21]。

根系分泌物是植物、土壤、根際微生物之間相互作用的重要媒介，能夠?yàn)楦H微生物提供營(yíng)養(yǎng)和能量促進(jìn)其生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)也能夠影響到根際微生物的種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)[22]。根系分泌物中的糖和糖醇被認(rèn)為是很多微生物的能量來源以及通用的趨化性物質(zhì)[23-25]。本研究中，果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖隨著鐵觀音種植年限的增加呈顯著下降的趨勢(shì)，可能是引起根際微生物群落失衡導(dǎo)致連作障礙的趨化性物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。

利用GC-MS技術(shù)在不同種植年限的鐵觀音根際土壤中共檢測(cè)并鑒定到52個(gè)根系分泌物，OPLS-DA分析表明，連作10年和20年的鐵觀音茶樹根系分泌物差異較小，可與1年和0年根系分泌物明顯區(qū)分開。共篩選到4-羥基-3-甲氧基苯甲酸、果糖、半乳糖等18個(gè)組間差異顯著的根系分泌物質(zhì)。其中，4-羥基-3-甲氧基苯甲酸是潛在的自毒物質(zhì)，隨種植年限的增加其含量顯著增加；果糖、半乳糖、葡萄糖等隨著鐵觀音種植年限的增加呈顯著下降的趨勢(shì)，可能是引起根際微生物群落失衡導(dǎo)致連作障礙的趨化性物質(zhì)，有待進(jìn)一步研究。