桑葚酵素復(fù)合與自然發(fā)酵的功效成分、感官評價與抗氧化活性比較

唐 敏，劉 剛，2*，王雪力，汪淑芳，2，趙甲元，2，陳曉鳳，劉興艷

（1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101；2.四川師范大學(xué) 食品功能及加工應(yīng)用研究所，四川 成都 610101；3.四川師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610066）

桑葚是桑屬植物桑樹（Morus alba L.）的果實，為聚花果，俗稱桑椹、桑烏、桑棗等［1］.桑葚中水分質(zhì)量分數(shù)約為85%［2］，酸甜可口，卡路里含量比較低，而且含有多種人體必需的氨基酸、維生素、纖維素、礦物質(zhì)和果膠等營養(yǎng)成分，具有極高的營養(yǎng)價值［3-4］.此外，大量研究表明，桑葚中富含多酚、黃酮、多糖等多種功能性成分［5-6］.據(jù)《中國藥典》記載，桑葚具有滋陰補血、生津潤燥的功能［7］.1993 年桑葚因其具有的食藥用價值，被列入“既是食品又是中藥材”的物質(zhì)目錄.

新鮮桑葚含水量高、果皮薄、果實柔軟，采摘后極易發(fā)生腐爛和霉變，儲存和運輸成本較髙［8］.因此，桑葚大多被加工制作成桑葚果汁、桑葚果醬［9］、桑葚果干等產(chǎn)品.近年來，隨著生物發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，桑葚果酒、果醋、酵素等產(chǎn)品逐漸被開發(fā)出來.桑葚酵素是利用桑葚的特征成分和菌種的發(fā)酵轉(zhuǎn)化作用生產(chǎn)的具有一定保健功能的新型保健食品［10］.

酵素由日語的“酶”翻譯而來，是日本對酶的別稱［11］.現(xiàn)在市面上的酵素多指包含酶和其他生物活性物質(zhì)的混合物.據(jù)已有研究，酵素有抗氧化［12］、抑菌［13］、降血脂［14］、潤腸通便［15］、保護酒精性肝損傷、改善胃腸功能和平衡機體等作用［16-17］，倍受消費者青睞，具有廣闊的發(fā)展前景和很大的開發(fā)價值.

本研究以桑葚為原材料，采用自然發(fā)酵與復(fù)合發(fā)酵2 種不同的發(fā)酵工藝對桑葚進行發(fā)酵，制備桑葚酵素；并從感官評價、發(fā)酵過程中質(zhì)量變化等方面比較2 種發(fā)酵工藝制得的桑葚酵素，為桑葚產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料桑葚產(chǎn)于四川省德昌縣，酸奶發(fā)酵劑（含嗜熱鏈球菌、長雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌等乳酸菌）由安琪酵母股份有限公司提拱.

1.2 儀器與設(shè)備YB-250 高速多功能粉碎機（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）、SJ-CJ-2FDQ 超凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠）、LRH-800F 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）和LDZH-150KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）等.

1.3 桑葚酵素的制備制備工藝參考專利文獻［18］并略做改進.桑葚去梗，無菌水清洗2次，瀝干水分，粉碎，得桑葚漿液.將桑葚漿液∶白砂糖∶無菌水按4 ∶1∶1的質(zhì)量比混合，置于無菌發(fā)酵罐，低速攪拌30 min，然后復(fù)合發(fā)酵組加入體積分數(shù)1%酸奶發(fā)酵劑，自然發(fā)酵組不添加，均置于35 ℃進行恒溫發(fā)酵.

1.4 桑葚酵素功效成分的測定發(fā)酵期間每日定時取樣、抽濾，對濾液進行測定.利用已校準(zhǔn)的pH計測定樣品pH值.多糖含量的測定參考Wu 等［19］的苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為

多酚含量的測定參考Lachman等［20］采用的福林酚法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為

黃酮含量的測定參考范艷麗等［21］采用的硝酸鋁顯色法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為

1.5 桑葚酵素的感官評價參考文獻［22-23］的感官評定標(biāo)準(zhǔn)，對不同工藝制得的桑葚酵素進行感官分值評定，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1.取10 名試驗人員，按感官評價標(biāo)準(zhǔn)，對桑葚酵素進行評分.

表1 感官評分表Tab.1 Sensory score table

1.6 桑葚酵素的抗氧化活性

1.6.1DPPH測定法 取2 支試管，向其中一支試管加入2 mL DPPH溶液與1 mL酵素樣品液，另一支試管中加入2 mL DPPH 溶液與1 mL 體積分數(shù)95%乙醇，搖勻，室溫下避光放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度值，以體積分數(shù)95%乙醇溶液作為空白對照，多次重復(fù)測定取平均值［24］.DPPH自由基清除率計算公式為

其中，As為DPPH溶液+1 mL樣品的吸光度，A0為DPPH溶液+1 mL體積分數(shù)95%乙醇的吸光度.

1.6.2ABTS 測定法 準(zhǔn)確稱取ABTS 3 mg，加0.735 mL蒸餾水配制成7.4 mol／L的ABTS 儲備液.準(zhǔn)確稱取1 mg K2S2O8，加蒸餾水1.43 mL，得2.6 mmol／L K2S2O8儲備液.分別吸取ABTS·儲備液和K2S2O8儲備液各0.5 mL，混合均勻，于黑暗條件室溫放置12 h.使用體積分數(shù)95%乙醇對混合儲備液進行稀釋，稀釋到A734nm＝0.7±0.02.取2 mL稀釋液與0.5 mL酵素樣品液混合，室溫放置6 min，于波長734 nm處測定吸光值.以體積分數(shù)95%乙醇溶液作為空白對照，多次重復(fù)測定取平均值［25］.ABTS自由基清除率的計算公式為

其中，As為2 mL ABTS·溶液+0.5 mL 酵素稀釋液的吸光度，A0為2 mL ABTS·溶液+0.5 mL 體積分數(shù)95%乙醇的吸光度.

1.7 實驗數(shù)據(jù)處理與分析本試驗均設(shè)有至少3組平行，所有的實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means ± std）表示.采用SPSS 21.0 中的ANOVA、Duncan檢驗對數(shù)據(jù)進行分析.統(tǒng)計結(jié)果用Graph Pad Prism 5 和Origin 8.5 軟件來繪制圖表.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵制備方式對桑葚酵素質(zhì)量指標(biāo)的影響

2.1.1發(fā)酵制備方式對桑葚酵素pH 值的影響測定 發(fā)酵期間桑葚酵素的pH結(jié)果如圖1所示.2種桑葚酵素的pH變化，均呈先下降再上升的趨勢，在第5天時均降到最低值，然后再上升.與自然發(fā)酵的桑葚酵素比較，復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素pH值變化幅度相對較小，在第6～10 天的變化趨勢更加穩(wěn)定.發(fā)酵過程中pH值小幅度降低，可能由于酵素在發(fā)酵過程中有機酸濃度增加導(dǎo)致［26］；而發(fā)酵后期pH值有所升高，可能與發(fā)酵中微生物利用氨基酸或水解蛋白質(zhì)有關(guān)［27］.

圖1 桑葚酵素發(fā)酵期間pH值變化曲線Fig.1 pH change during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.2發(fā)酵制備方式對桑葚酵素多糖含量的影響測定 桑葚酵素發(fā)酵期間多糖的含量，結(jié)果如圖2所示.在發(fā)酵過程中，復(fù)合發(fā)酵制得的桑葚酵素多糖含量最高為422.94 mg／mL，在第4 天時達到最低值，為231.91 mg／mL；自然發(fā)酵制得的桑葚酵素多糖含量在發(fā)酵過程中最高為410.57 mg／mL，在第5 天時達到最低為219.27 mg／mL.桑葚酵素多糖含量在發(fā)酵期間，復(fù)合發(fā)酵與自然發(fā)酵變化趨勢一致，在前4 天呈上升趨勢，隨后達到最低，然后有上升的趨勢，這可能是由于在桑葚酵素發(fā)酵期間發(fā)酵液中微生物含量的變化，對多糖的利用率造成影響，進而影響多糖的含量變化.

圖2 桑葚酵素發(fā)酵期間多糖含量變化曲線Fig.2 Changes in polysaccharide content during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.3發(fā)酵制備方式對桑葚酵素多酚含量的影響測定 發(fā)酵期間多酚的含量，結(jié)果見圖3.由此可知，自然發(fā)酵、復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素中多酚含量一直較為接近，這表明是否添加酸奶發(fā)酵劑對多酚含量影響不大.多酚含量變化都呈現(xiàn)先上升再下降，而后逐漸平穩(wěn)的趨勢，這可能與微生物對多種構(gòu)型多酚的轉(zhuǎn)化有關(guān).多酚組分含量的變化，會影響酵素的抗氧化活性［28］.

圖3 桑葚酵素發(fā)酵期間多酚含量變化曲線Fig.3 Changes in polyphenol content during the fermentation of mulberry enzymes

2.1.4發(fā)酵制備方式對桑葚酵素黃酮類物質(zhì)含量的影響測定 發(fā)酵過程中樣品黃酮類物質(zhì)的含量，結(jié)果見圖4.可以看出，在桑葚酵素制備期間，自然發(fā)酵的黃酮含量顯著高于復(fù)合發(fā)酵的，2 種發(fā)酵方式的黃酮含量在發(fā)酵過程中均有所增加，但變化趨勢基本不同，這可能是由于不同微生物對不同黃酮類物質(zhì)的利用率相差較大，以及在發(fā)酵過程中不同種類的黃酮類物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的.

圖4 桑葚酵素發(fā)酵期間黃酮含量變化曲線Fig.4 Changes in flavonoid content during the fermentation of mulberry enzymes

2.2 發(fā)酵制備方式對桑葚酵素感官評價的影響選取發(fā)酵過程中最好條件下的桑葚酵素，進行感官評價，結(jié)果見圖5.復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素感官評分，大多高于自然發(fā)酵的桑葚酵素.在感官指標(biāo)的透明澄清度、顏色均一度、雜質(zhì)沉淀、狀態(tài)均勻、不良異味5個方面，2 種酵素的感官評分差異極顯著（P ＜0.01），其中復(fù)合發(fā)酵的評分較高.自然發(fā)酵的芳香較濃，評分高于復(fù)合發(fā)酵，差異極顯著（P ＜0.01），復(fù)合發(fā)酵的酸度值顯著高于自然發(fā)酵（P≤0.05）.從氣味、澀口、口感持久度3方面比較，2種不同發(fā)酵工藝的桑葚酵素?zé)o明顯區(qū)別，差異不顯著（P ＞0.05）.本實驗研究的結(jié)論，更加細化了文獻［29］的酵素風(fēng)味會隨發(fā)酵條件變化而改變的結(jié)論.因此，本實驗的結(jié)果對于桑葚酵素產(chǎn)品質(zhì)量控制尤為重要.

圖5 桑葚酵素感官評價結(jié)果Fig.5 Sensory score of mulberry enzymes

2.3 發(fā)酵制備方式對桑葚酵素體外抗氧化活性影響

2.3.1DPPH 測定法的結(jié)果 測定桑葚酵素DPPH清除率的變化，結(jié)果見圖6.可以看出，發(fā)酵過程中，DPPH清除率呈下降趨勢，復(fù)合發(fā)酵下降趨勢較自然發(fā)酵緩慢且平緩.復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素最低DPPH自由基清除率顯著高于自然發(fā)酵（P ≤0.05）.發(fā)酵過程中，樣品清除DPPH自由基的活性逐漸減弱，這很可能與發(fā)酵中微生物消耗了清除DPPH自由基的成分有關(guān).

圖6 桑葚酵素發(fā)酵期間DPPH清除率變化曲線Fig.6 Changes in DPPH clearance during the fermentation of mulberry enzymes

2.3.2 ABTS 測定法的結(jié)果測定桑葚酵素的ABTS清除能力，結(jié)果見圖7.可以看出，自然發(fā)酵、復(fù)合發(fā)酵2種發(fā)酵工藝，桑葚酵素對ABTS自由基的清除率變化趨勢大致相同，都可分為2 個階段：第一階段呈上升趨勢，復(fù)合發(fā)酵的清除率比自然發(fā)酵的提前1 d達到最大值，到最大值后的第二階段，對ABTS自由基的清除率趨于平緩，無明顯的變化.

圖7 桑葚酵素發(fā)酵期間ABTS清除率變化曲線Fig.7 Changes in ABTS clearance during the fermentation of mulberry enzymes

綜合分析圖5、6 可以看出，復(fù)合發(fā)酵的DPPH清除率、ABTS清除率均高于自然發(fā)酵，表明復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素抗氧化活性高于自然發(fā)酵的桑葚酵素.桑葚酵素發(fā)酵的DPPH清除率和ABTS清除率，變化趨勢不一致，這可能與發(fā)酵過程中的微生物利用的原料成分和代謝產(chǎn)物不同，導(dǎo)致DPPH、ABTS自由基清除率變化有差異.

3 結(jié)論

以桑葚為原材料，比較自然發(fā)酵與復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素，結(jié)果表明，pH值、多糖和多酚含量的變化趨勢一致，這與2種發(fā)酵過程的相似有關(guān)，而黃酮的變化差異較大，這可能受到黃酮類物質(zhì)的不穩(wěn)定性影響，而且發(fā)酵中黃酮類物質(zhì)的構(gòu)型會發(fā)生轉(zhuǎn)化.感官評價結(jié)果，復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素，色澤較好、溶液澄清、幾乎不含雜質(zhì)沉淀，整體風(fēng)味明顯優(yōu)于自然發(fā)酵，這可能與復(fù)合發(fā)酵劑添加的乳酸菌能快速形成優(yōu)勢菌，可抑制霉菌等微生物的生長有關(guān).

桑葚酵素的體外抗氧化活性變化較大，DPPH清除能力逐漸降低，復(fù)合發(fā)酵桑葚酵素的DPPH 最低，清除率明顯高于自然發(fā)酵；而ABTS 清除率呈上升趨勢，最低清除率均在90%以上.復(fù)合發(fā)酵的桑葚酵素的DPPH 清除率、ABTS 清除率均高于自然發(fā)酵.

本實驗研究從桑葚酵素發(fā)酵過程功效成分、感官評價與抗氧化活性的變化等方面，比較了2 種發(fā)酵工藝，為桑葚的綜合開發(fā)、深度利用提供了理論支持.

致謝2015 年“質(zhì)量工程”項目《生物技術(shù)專業(yè)實踐教學(xué)目標(biāo)的整合與協(xié)調(diào)研究》、2015 年學(xué)科專業(yè)類創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育課程項目《食品與藥品制造檢驗綜合應(yīng)用的實踐》、成都益康堂藥業(yè)有限公司和北京聚仁康生物技術(shù)開發(fā)有限公司對本文給予了資助，謹此謝意.