測定食品中16種氨基酸國家標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)

李巧琪,李洪燕,盧桂鋒,周海練,許志彬

(廣州檢驗(yàn)檢測認(rèn)證集團(tuán)有限公司 國家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心(廣東),廣州 511447)

自然界存在300多種氨基酸,其中,構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的有20多種,被稱為基本氨基酸[1]。從營養(yǎng)學(xué)角度看,由于部分氨基酸人體無法直接合成,需要從食品中攝取,并且食品中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值取決于食品中所含氨基酸的種類和含量,因此測定食品中多種氨基酸的含量對人體營養(yǎng)攝入評估具有一定意義[2]。

目前,食品中氨基酸的前處理方法主要采用酸水解法[3],但是該方法前處理時(shí)間較長(需要22 h左右)。測定方法主要有液相色譜-質(zhì)譜法[4-6]、液相色譜法[7-9]、離子色譜法[10-12]等。其中液相色譜-質(zhì)譜法儀器成本較高;而液相色譜法中,樣品經(jīng)柱前衍生反應(yīng)后,部分產(chǎn)物受基體以及過量試劑的影響,穩(wěn)定性較差,并且衍生試劑的價(jià)格較高;陰離子交換直接檢測法易受細(xì)菌干擾,進(jìn)而造成測定結(jié)果重現(xiàn)性不理想。基于此,本工作首先對國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》中的酸水解法進(jìn)行改進(jìn),并提出了微波消解這一前處理方法,然后采用優(yōu)化后的陽離子交換色譜分離-柱后茚三酮衍生法測定食品中天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨 酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)等16種氨基酸的含量。該方法分析結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,為食品中氨基酸的快速測定提供了參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

S433D 型氨基酸分析儀;ED53 型精密烘箱;TVE-1100型試管濃縮儀;Ethos MHP型微波蛋白質(zhì)水解系統(tǒng);ME204E型電子天平。

17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:胱氨酸(Cys)的濃度為1.25 mmol·L－1,Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg的濃度均為2.50 mmol·L－1。

緩沖液1:稱取檸檬酸三鈉11.8 g、檸檬酸6.0 g于燒杯中,加入65 mL乙醇、5.6 mL鹽酸以及適量水,溶解后用水定容至1 L,用6 mol·L－1鹽酸溶液將溶液酸度調(diào)至pH 3.42。

緩沖液2:稱取檸檬酸三鈉19.6 g、硼酸5.0 g、氫氧化鈉3.1 g于燒杯中,用水溶解并定容至1 L,用20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液將溶液酸度調(diào)至pH 10.85。

再生液:稱取氫氧化鈉20.0 g于燒杯中,用水溶解并定容至1 L。

顯色液:稱取乙酸鉀196 g、三水合乙酸鈉272 g于燒杯中,加入乙酸200 mL,用水溶解并定容至1 L,配制成鉀鈉緩沖液,備用;稱取茚三酮20 g、苯酚2 g于另一燒杯中,加入甲醇600 mL和鉀鈉緩沖液400 mL,溶解,配制成顯色液,避光保存。

氮?dú)獾募兌炔恍∮?9.999%;甲醇為色譜純;鹽酸、檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、硼酸、乙醇、檸檬酸、乙酸鉀、三水合乙酸鈉、乙酸、苯酚、茚三酮均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

LCA K06/Na 色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm);氮?dú)庠鰤?0～80 kPa。柱升溫程序:初始溫度58 ℃,保持22.0 min;22.0～27.0 min,升溫至73 ℃,保持17.0 min;44.0～48.0 min,降溫至58 ℃。流動相A為緩沖液1,B為緩沖液2,C 為 再生液,流量0.45 mL·min－1,壓力3～4 MPa;衍生體系為顯色液,流量0.25 mL·min－1,壓力0.7～1 MPa;檢測波長為440 nm(Pro)和570 nm(其余15種氨基酸);進(jìn)樣量50μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 常規(guī)酸水解法

參照GB 5009.124－2016中的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 改進(jìn)后的酸水解法

稱取樣品1 g于聚四氟乙烯管中,加入含0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚的6 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,充氮后封口,于165℃水解1 h。水解結(jié)束后,取出,冷卻,用水定容至50 mL,取1 mL 減壓濃縮至近干,再用10 mL 0.02 mol·L－1鹽酸溶液復(fù)溶,過濾,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。根據(jù)樣品的實(shí)際情況可進(jìn)一步稀釋。

1.3.3 微波消解法

稱取樣品約0.1 g于石英罐中,加入6 mol·L－1鹽酸溶液1 mL,充分濕潤后,將其放入裝有6 mol·L－1鹽酸溶液的聚四氟乙烯罐中,充氮除氧,封蓋后放入微波消解儀,設(shè)置微波輸出功率為1 000 W,于165 ℃消解12 min。消解結(jié)束后,取出,冷卻,將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,用0.02 mol·L－1鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻,過濾,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。根據(jù)樣品實(shí)際情況可進(jìn)一步稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸水解條件的優(yōu)化

提高水解溫度可使活化分子增多,水解效率提高。為防止普通安培管在高溫下難以承受鹽酸蒸氣壓而破裂,試驗(yàn)采用聚四氟乙烯管進(jìn)行水解。以豬瘦肉為研究對象,考察了不同酸水解條件對樣品中16種氨基酸測定結(jié)果的影響,并與GB 5009.124－2016的測定結(jié)果進(jìn)行比對,結(jié)果見表2。

表2 不同酸水解條件下氨基酸的測定結(jié)果Tab.2 Determination results of amino acids under different acid hydrolysis conditions %

結(jié)果表明:隨著酸水解溫度的升高,水解時(shí)間逐漸縮短,酸水解效率逐漸提高;當(dāng)酸水解溫度為180 ℃時(shí),部分氨基酸分解,導(dǎo)致其測定值有所下降。因此,試驗(yàn)選擇酸水解溫度為165℃,酸水解時(shí)間為1 h,此條件下與GB 5009.124－2016的測定結(jié)果基本一致,且酸水解時(shí)間由22 h縮短至1 h。

2.2 微波消解條件的優(yōu)化

微波消解法是常見的樣品前處理技術(shù),其消解效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酸水解法。設(shè)置微波輸出功率為1 000 W,以酸水解最佳溫度165 ℃為消解溫度,考察了不同消解時(shí)間(6,9,12,15,18 min)對2.1節(jié)同一豬瘦肉樣品中16種氨基酸測定結(jié)果的影響,并與GB 5009.124－2016的測定結(jié)果進(jìn)行比對,結(jié)果見表3。

表3 不同消解時(shí)間下氨基酸的測定結(jié)果Tab.3 Determination results of amino acids under different digestion time %

由表3可知:當(dāng)消解時(shí)間為6 min時(shí),蛋白質(zhì)消解不徹底,測定值比GB 5009.124－2016的測定值小;當(dāng)消解時(shí)間為9～18 min 時(shí),測定值與GB 5009.124－2016的測定值基本一致。為避免因消解時(shí)間過短而出現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)樣品消解不徹底現(xiàn)象,同時(shí)提高分析效率,試驗(yàn)選擇消解時(shí)間為12 min。

2.3 柱溫的優(yōu)化

參考GB 5009.124－2016,采用陽離子交換色譜分離-柱后茚三酮衍生法進(jìn)行分析。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),柱溫過低,色譜峰峰形變寬變矮。特別是Asp對溫度十分敏感,當(dāng)柱溫不大于30 ℃時(shí),其色譜峰在Thr后面出峰;當(dāng)柱溫不小于45 ℃時(shí),其色譜峰在Thr前面出峰;當(dāng)柱溫達(dá)到58 ℃時(shí),Asp和Thr分離更徹底。并且,隨著柱溫的繼續(xù)升高,Thr和Ser出現(xiàn)疊峰現(xiàn)象;但當(dāng)柱溫控制在58 ℃時(shí),Tyr和Phe出現(xiàn)疊峰現(xiàn)象,需要進(jìn)一步升溫才能使兩者完全分離,經(jīng)試驗(yàn),當(dāng)柱溫達(dá)73℃,兩者才可分離完全。因此,試驗(yàn)采用柱升溫程序來分離各目標(biāo)物,柱升溫程序見1.1節(jié)。

2.4 洗脫程序的優(yōu)化

無論是酸水解法還是微波消解法,都會將部分Cys轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸,造成Cys的測定值偏小。并且試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),Cys的保留時(shí)間與Val相近,流動相A 的酸度及流動相B 的更換時(shí)間對Cys的保留時(shí)間影響較大。為避免Cys對Val測定結(jié)果的影響,試驗(yàn)將Cys作為雜質(zhì),考察了流動相A 的酸度及流動相B 的更換時(shí)間對各目標(biāo)物分離效果的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)流動相A 的pH 小于3.30或流動相B的更換時(shí)間不小于14.0 min時(shí),Cys的保留時(shí)間較長,并且與Val的色譜峰黏連在一起,造成Val的測定值偏大;當(dāng)流動相A 的pH 大于3.50或流動相B的更換時(shí)間不大于10.0 min時(shí),各目標(biāo)物的保留時(shí)間均提前,但Thr與Ser、Leu與Ile分離不完全;當(dāng)流動相A 的pH 為3.40～3.45以及流動相B的更換時(shí)間為12.0 min時(shí),Cys與Val分離效果較好。因此,試驗(yàn)選擇流動相A 的酸度為pH 3.42,流動相B的更換時(shí)間為12.0 min,梯度洗脫程序見表1。

在上述優(yōu)化條件下對17種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液進(jìn)行測定,所得色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 Chromatograms

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

移取適量的17 種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.02 mol·L－1鹽酸溶液逐級稀釋,配制成16種目標(biāo)物濃度為10,20,50,100,200μmol·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件對上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以各目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,16種氨基酸的濃度在10～200μmol·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性參數(shù)見表4。

通常情況下,食品中均含有氨基酸,無法采用陰性樣品進(jìn)行檢出限試驗(yàn)。因此,本工作分別按照改進(jìn)后的酸水解法和微波消解法對豬瘦肉進(jìn)行處理,采用2倍基線噪聲峰高(峰底附近30個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)以內(nèi)的值)乘以樣品含量(濃度乘以進(jìn)樣量),再除以目標(biāo)物峰高來計(jì)算檢出限,并通過配對樣本t檢驗(yàn)法驗(yàn)證上述兩種方法檢出限與GB 5009.124－2016檢出限的差異性,結(jié)果見表4。

表4 線性參數(shù)和檢出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

結(jié)果顯示,改進(jìn)后的酸水解法和微波消解法所得檢出限與GB 5009.124－2016的檢出限相當(dāng)[3],P值依次為0.589,0.621,說明這兩種方法與GB 5009.124－2016不存在顯著性差異(P＞0.05),能夠滿足日常檢測需要。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

分別按照改進(jìn)后的酸水解法和微波消解法對豬瘦肉進(jìn)行低(20μmol·L－1)、中(50μmol·L－1)、高(100μmol·L－1)等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n=6)

表5 (續(xù))

結(jié)果顯示:采用改進(jìn)后的酸水解法時(shí),16種氨基酸的回收率為93.6%～101%,測定值的RSD 為1.3%～7.2%;采用微波消解法時(shí),16種氨基酸的回收率為94.1%～100%,測定值的RSD 為1.2%～7.0%,兩種方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合分析檢測要求[13]。

2.7 樣品分析

按照改進(jìn)后的酸水解法、微波消解法和GB 5009.124－2016,分別對不同食品中16種氨基酸進(jìn)行測定,計(jì)算16種氨基酸總量,并通過配對樣本t檢驗(yàn)法分析改進(jìn)后的酸水解法、微波消解法與GB 5009.124－2016是否存在顯著性差異,結(jié)果見表6。

表6 樣品分析結(jié)果Tab.6 Analytical results of samples %

結(jié)果顯示,改進(jìn)后的酸水解法、微波消解法與GB 5009.124－2016的測定結(jié)果基本一致,并且計(jì)算得改進(jìn)后的酸水解法與GB 5009.124－2016的P值為0.870,微波消解法與GB 5009.124－2016的P值為0.643,均大于0.05,說明這兩種方法的測定結(jié)果與GB 5009.124－2016的不存在顯著性差異,進(jìn)一步驗(yàn)證了這兩種方法的準(zhǔn)確度較好。

本工作通過對GB 5009.124－2016中的常規(guī)酸水解法進(jìn)行改進(jìn),將原來的前處理時(shí)間由22 h縮短至1 h(改進(jìn)后的酸水解法)或12 min(微波消解法),并進(jìn)一步優(yōu)化柱溫和洗脫程序,建立了陽離子交換色譜法測定食品中16 種氨基酸含量的方法。改進(jìn)后的酸水解法和微波消解法大大提高了試驗(yàn)效率,并且回收率高,精密度好,適用于食品中16種氨基酸的快速測定。