超聲提取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定毛發(fā)中常見毒品及代謝物的含量

陳順琴,唐 美,黃 江,王 杰,王愛民,朱發(fā)澤,劉玉波,羅 鵬

(貴州醫(yī)科大學 法醫(yī)學院,貴陽 550004)

隨著經濟的飛速發(fā)展,人們的物質生活水平得到了極大的提升,與此同時,人們面臨的精神壓力也與日俱增,因此不少人加入了“癮君子”行列,嚴重危害著國家和社會的安定[1-4]。為有效遏制毒品類犯罪案件,建立一種快速、準確、靈敏地檢測生物檢材中毒品及代謝物的方法至關重要[5]。對于毒品案件,常用的檢材有血液、尿液、唾液等,但其存在許多不可控因素,如毒品在體內代謝速率較快,不易被檢測;前處理過程復雜;分析時間較長等[6]。近年來,毛發(fā)分析已在諸多領域顯示出了廣闊的應用前景,由于其穩(wěn)定強、取樣簡單快速、檢測時間窗口可達數月甚至數年,因此成為毒品檢測領域較為理想的長程檢材[7-8]。利用毛發(fā)每月生長0.8～1.2 cm 的特點,對其進行分段檢測,可推斷出被檢對象的吸毒、用藥情況[9-10]。

2016年11月,國家禁毒委員會辦公室對《吸毒成癮認定方法》進行了修訂,將毛發(fā)中毒品及代謝物的檢測結果作為吸毒成癮的重要證據。根據國際毛發(fā)協(xié)會(SOHT)規(guī)定的毛發(fā)中O6-單乙酰嗎啡(6-AM)、嗎啡(MOR)、氯胺酮(K 粉)、甲基苯丙 胺(MAMP)、苯丙胺(AMP)、可卡因(COC)、苯甲酰愛康寧(BZE)、3,4-亞甲雙氧甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲雙氧苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲雙氧乙基苯丙胺(MDEA)、可待因(COD)、去甲氯胺酮(NK)、Δ9-四氫大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、大麻酚(CBN)等15種毒品及代謝物的閾值濃度(表1),對被檢人員的吸毒情況進行判定。目前,對于毒品進入頭發(fā)的確切機制尚不清楚,一般研究認為毒品主要經過血液循環(huán),擴散到毛髓質、毛皮質等毛發(fā)部位中,在一定條件下對其進行特殊處理,可將毒品從毛髓質和毛皮質中提取出來。

表1 15種毒品及代謝物的閾值濃度Tab.1 Threshold concentrations of 15 drugs and metaboliteles

毛發(fā)中毒品及代謝物含量分析常用的前處理方法有堿水解、酸水解、酶水解,但這些方法操作耗時較長,不利于對案件的快速分析[11-16]。司法部頒布了多項毛發(fā)檢測技術規(guī)范[17-19],但是前處理過程均較為繁瑣,不利于毛發(fā)中毒品及代謝物的快速檢驗鑒定。因此,本工作在司法部鑒定技術規(guī)范的基礎上,采用有機溶劑提取毛發(fā)中的毒品,建立了一種更加靈敏、高效、快速、簡便的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UHPLC-MS/MS)測定毛發(fā)中毒品及代謝物含量的方法,適用于實際案件的分析應用。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AB-4500QTRAP型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀;JXFSTPRP-CL 型全自動樣品冷凍研磨儀;SB-5200D 型超聲波清洗儀;ME-204 型電子分析天平;Direct-Q?3UV 型純水儀。

6-AM、MOR、COD、MAMP、AMP、MDMA、MDA、MDEA、COC、BZE、K 粉、NK、THC、CBD、CBN 單標準儲備溶液:1.0 g·L－1。

混合標準溶液:移取適量的單標準儲備溶液,用甲醇稀釋,配制成6-AM、MOR、COD、MAMP、AMP、MDMA、MDA、MDEA、K 粉、NK 質量濃度均為0.80 mg·L－1,BZE、THC、CBD、CBN 質量濃度均為0.20 mg·L－1,COC質量濃度為2.00 mg·L－1的混合標準溶液。

乙酸銨溶液:20 mmol·L－1,稱取乙酸銨1.54 g,用水溶解并定容至1 L 容量瓶中,混勻備用,配制成20 mmol·L－1乙酸銨溶液。

乙酸銨的質量分數不小于99.0%;甲醇、乙腈均為色譜純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1) 色譜條件 ACE C18-PFP 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;流動相A為含0.1%(體積分數,下同)甲酸的乙腈溶液,B 為含0.1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液;流量0.35 mL·min－1;進樣量5μL。梯度洗脫程序:0～1.0 min時,A 為80%;1.0～4.0 min時,A 由80%升至95%,保持2 min;6.0～6.1 min時,A 由95%跳轉至80%,保持1.9 min。

2)質譜條件 電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;多反應監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度550 ℃;噴霧電壓4 500 V;霧化器壓力345 k Pa,氣簾氣壓力241 k Pa,輔助氣壓力345 k Pa;駐留時間20 ms。其他質譜參數見表2,其中,“*”為定量離子。

表2 質譜參數Tab.2 MS parameters

表2 (續(xù))

1.3 試驗方法

取毛發(fā)樣品,用水、二氯甲烷、丙酮振蕩洗滌各1次,取出晾干。稱取晾干后的毛發(fā)樣品40～60 mg,將其剪成約1 mm 小段,置于2 mL 研磨瓶中,加入3.2 mm 的破碎珠6顆,冷凍破碎5 min。稱取破碎后的毛發(fā)樣品20 mg,加入1 mL 甲醇,于0 ℃冰水浴中超聲提取20 min,取上清液過0.25μm 有機濾膜,濾液供UHPLC-MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件測定混合標準溶液和空白樣品加標溶液(加標量相當于各目標物100%閾值濃度),得到總離子流色譜圖見圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms

2.2 破碎珠粒徑和破碎時間的選擇

影響毛發(fā)破碎效果的主要因素包括破碎珠粒徑和破碎時間。試驗考察了粒徑分別為0.5,3.2,5.0 mm 的破碎珠對毛發(fā)破碎效果的影響。結果顯示:采用0.5,5.0 mm 的破碎珠時,部分毛發(fā)無法被完全破碎,破碎效率較低;當采用3.2 mm 的破碎珠時,可將毛發(fā)完全破碎,破碎效率更高。因此,試驗選擇破碎珠粒徑為3.2 mm。

對于冷凍研磨,通常破碎時間越長,破碎效果越好。試驗考察了破碎時間分別為1,3,5,7 min時對毛發(fā)破碎效果的影響。結果顯示,當破碎時間為5 min時,便可將毛發(fā)研磨至粉末狀,使提取劑與樣品能夠充分接觸,因此試驗選擇破碎時間為5 min。

2.3 破碎毛發(fā)用量的選擇

破碎毛發(fā)用量取決于儀器及破碎所用管子的大小。中華人民共和國司法部公共法律服務管理局標準SF/Z JD0107025－2018《毛發(fā)中15種毒品及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質譜檢驗方法》[17]中規(guī)定毛發(fā)樣品用量為20 mg,綜合考慮稱量過程中的損失及破碎效率等因素,試驗選擇破碎毛發(fā)用量為40～60 mg。

2.4 提取劑的選擇

試驗考察了乙腈、甲醇、乙醚、乙酸乙酯為提取劑時對15種目標物回收率的影響。在空白毛發(fā)樣品中加入5μL混合標準溶液(加標量相當于各目標物100%閾值濃度),按照儀器工作條件進行測定。結果表明:以乙腈為提取劑時,各目標物的回收率偏低,這是由于乙腈具有較強的蛋白沉淀作用;以乙醚為提取劑時,由于其沸點低、揮發(fā)性強,提取過程中會造成部分目標物損失,從而導致目標物的回收率偏低;乙酸乙酯脂溶性過強,能夠溶解部分毛發(fā),導致目標物的回收率較低;甲醇對15種毒品及代謝物具有良好的溶解性,當以甲醇為提取劑時,目標物的回收率為71.2%～105%,提取效果好,滿足分析要求。因此,試驗選擇提取劑為甲醇。

2.5 提取方法的選擇

試驗考察了冰水浴超聲提取、靜置過夜、振蕩提取、粉碎研磨與振蕩提取同時進行等4種提取方法對15種目標物回收率的影響,結果見圖2。

圖2 提取方法對15種目標物回收率的影響Fig.2 Effect of extraction method on recovery of 15 analytes

結果表明,采用冰水浴超聲提取時,各目標物的回收率為77.0%～101%,提取效果較好,因此試驗選擇提取方法為冰水浴超聲提取。

2.6 提取時間的選擇

試驗考察了冰水浴超聲提取時間分別為10,15,20,30 min時對15種目標物回收率的影響,結果見圖3。

圖3 提取時間對15種目標物回收率的的影響Fig.3 Effect of extraction time on recovery of 15 analytes

結果表明,當冰水浴超聲提取時間為20,30 min時,各目標物的回收率分別為81.1%～103%和82.7%～102%。為提高試驗效率,試驗選擇提取時間為20 min。

2.7 方法專屬性

收集來自6種不同職業(yè)(學生、教師、公務員、醫(yī)務人員、實驗室人員、自由職業(yè)者)健康志愿者的空白毛發(fā)樣品,并按1.3節(jié)試驗方法進行處理,檢測其背景響應。結果表明,6種不同職業(yè)人員的空白毛發(fā)樣品對15種目標物測定均無干擾,說明該方法的專屬性較好。

2.8 基質效應

基質效應(ME)表現為目標化合物的離子強度增強或抑制效應[20]。按照試驗方法對2.7節(jié)中6種不同來源的毛發(fā)樣品進行處理,得到6個空白樣品基質溶液。按照儀器工作條件,對各目標物100%閾值濃度的混合標準溶液和空白樣品基質溶液配制的添加各目標物100%閾值濃度的混合標準溶液分別進行測定,每個樣品進樣6次,得到峰面積S標和S,按照ME＝(S－S標)/S標×100%計算不同樣品的ME和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 基質效應(n=6)Tab.3 Matrix effect(n=6)

結果顯示,不同樣品的ME為－25.0%～24.7%,RSD 為0.41%～15%,表明各目標物存在基質增強效應或基質減弱效應。按照SF/Z 0063－2020《法醫(yī)毒物分析方法驗證通則》[20]分析要求,試驗采用基質匹配的混合標準溶液系列來繪制工作曲線。

2.9 工作曲線和檢出限

在空白樣品溶液中分別加入1,3,5,10,15μL的混合標準溶液,配制成不同質量分數的混合標準溶液系列,按儀器工作條件進樣分析。以各目標物的質量分數為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示,15種目標物的質量分數在一定范圍內與其對應的峰面積呈線性關系,相關系數均大于0.998 0,線性參數見表4。

以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),結果見表4。

表4 線性參數和檢出限Tab.4 Linearity parameters and detection limits

2.10 精密度和回收試驗

在空白樣品溶液中分別添加4,5,6μL 混合標準溶液(加標量相當于各目標物80%,100%,120%的閾值濃度),每個濃度水平配制10份,按照儀器工作條件進行測定,計算回收率和測定值的RSD,結果見表5。

表5 精密度和回收試驗結果(n=10)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n=10)

由表5可知,15種目標物的回收率為73.3%～97.8%,測定值的RSD 為4.3%～14%,精密度和準確度均滿足方法學要求。

2.11 穩(wěn)定性試驗

對2.10節(jié)中添加100%閾值濃度的毛發(fā)樣品平行測定5次,連續(xù)測定5 d,記錄峰面積,計算各目標物的日內峰面積RSD 和日間峰面積RSD。結果顯示,15 種目標物的日內峰面積RSD(n＝5)為3.5%～13%,日間峰面積RSD(n＝5)為8.3%～27%,表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.12 方法對比

按照司法部司法鑒定技術規(guī)范 SF/Z JD0107025－2018和本法對送檢的30份毛發(fā)樣品進行測定,并根據表1對其進行陰陽性判定,結果見表6。

表6 不同方法對比結果Tab.6 Compared results with different methods

結果顯示,兩種方法得到的檢測結果一致,但本法的分析時間更短,表明本法可用于毒品案件的快速分析測定。

本工作以甲醇為提取劑,采用冷凍破碎和冰水浴超聲提取的前處理方法,建立了UHPLC-MS/MS測定毛發(fā)中常見毒品及代謝物的方法。與司法鑒定技術規(guī)范所制定的方法相比,該方法分析快速,并且靈敏度高、準確度好,為毒品案件的偵辦提供了一種有效的科學依據。