西洋參枳椇子配伍對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

李志滿，臧愛梅，沙紀(jì)越，李珊珊，孫印石,

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所, 吉林長春 130112；2.高密市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 山東濰坊 261500）

西洋參（American ginseng，AG）為五加科植物西洋參（PanaxquinquefoliumLinn.）的干燥根，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效[1]。西洋參主要活性成分為人參皂苷和多糖成分[2-3]，已被證明具有抗抑郁[4]、抗腫瘤[5]、提高機(jī)體免疫力[6]、降血糖[7]和抗肥胖[8]等多種生物活性。有研究證明西洋參可消除小鼠脂肪肝、減少肝臟和腸道脂蛋白分泌，降低脂質(zhì)循環(huán)水平，逆轉(zhuǎn)代謝綜合征[9-10]。枳椇子（Hovenia dulcisThunb）為鼠李科拐棗屬植物枳椇的種子，具有解酒毒、止嘔、清熱利尿等功效。近年來，中藥配伍類解酒制品紛紛涌向市場，主要成分以葛根、葛花和枳椇子為主，如食源復(fù)方解酒口服液、葛根解酒方、葛根-枳椇子解酒組合物等復(fù)方解酒口服液[11]。其中枳椇子常被用于解酒護(hù)肝產(chǎn)品開發(fā)中[12-14]。在2018年西洋參被衛(wèi)健委批準(zhǔn)為既是藥品又是食品，引起了大家對西洋參的廣泛關(guān)注。西洋參的特別之處在于補(bǔ)而無燥，常作為滋陰補(bǔ)腎中藥出現(xiàn)在復(fù)方當(dāng)中?；谖餮髤⑴c枳椇子的藥效作用，本研究將西洋參與枳椇子進(jìn)行配伍組合治療酒精性肝損傷。

幾十年來，醫(yī)治酒精性肝損傷（ALD）仍未找到特效藥物，因此，開展中藥配伍理論的研究思路可能是治療疾病的新方向。本研究通過預(yù)防灌胃小鼠組合物后建立急性酒精性肝損傷模型，檢測小鼠血清中生化指標(biāo)變化和抗氧化應(yīng)激能力，觀察肝臟病理組織病變程度和MAPK信號(hào)通路的變化。首次將西洋參與枳椇子配伍后探討其對酒精性肝損傷的作用，為西洋參的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級ICR健康雄性小鼠50只，體重為20～22 g 遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（遼）2015-0001，合格編號(hào)211002300023526；西洋參 吉林省撫松縣；枳椇子 山東濟(jì)南秦越人農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartateaminotransferase，AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、甘油三酯（Triglyceride，TG）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試 劑 盒、谷 胱 甘 肽（Glutathione，GSH）試劑盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、BCA法總蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素染液和伊紅染液 Sigma-Aldrich公司；中性樹膠

索萊寶生物科技有限公司，RIPA（Radio-Immunoprecipitation assay）裂解緩沖液 Bio-world公司，BCA試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒 美國密理博公司；phospho-ERK（p-ERK）、phospho-JNK（p-JNK）、phospho-P38（p-P38） 美國Santa cruz生物技術(shù)公司；GAPDH和二抗（鼠抗lgG） 美國Abcam公司。

Heraeus Megafuge 8R型超高速冷凍離心機(jī)賽默飛世爾科技有限公司；IX51型顯微鏡 奧林巴斯公司；Epoch2型酶標(biāo)儀 美國博騰儀器有限公司；MS204S型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；EG1150型生物組織包埋機(jī)、RM2265型切片機(jī)、HI1210型水浴鍋、HI1220型烘片儀 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；Alpha2-4LD plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；ChemiDocTMMP型全能成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參枳椇子提取物的制備 將西洋參和枳椇子放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在60 ℃條件下干燥12 h，分別按質(zhì)量比1:1、2:1和1:2混合，將干燥的混合物粉碎，過60目篩網(wǎng)，向混合物中加入重量比為8倍量蒸餾水，浸泡1 h，回流提取1 h，然后以5000 r/min，離心10 min，獲得上清液；再向殘?jiān)屑尤氚粗亓勘葹?倍量蒸餾水，回流提取0.5 h，離心，獲得上清液[11]，合并兩次上清液，將三種水煎液放置于-80 ℃條件下冷凍4 h后，真空冷凍干燥，即為組合物Ⅰ、組合物Ⅱ和組合物Ⅲ，產(chǎn)率分別為16.7%、19.3%和16.75%，產(chǎn)率（%）=提取物干燥后重量（g）/生藥重量（g）。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥方法 ICR小鼠在控溫（22±3）℃，相對濕度為（55%±15%）環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為五組，即為正常組、模型組、組合物Ⅰ組、組合物Ⅱ組和組合物Ⅲ組。西洋參枳椇子組合物組以100 mg/kg·bw劑量連續(xù)灌胃小鼠14 d，正常組及模型組給予生理鹽水。各組在最后一次給予受試物30 min后，除正常組外，24 h內(nèi)灌胃小鼠3次酒精（5 g/kg），酒精灌胃結(jié)束間隔6 h后，取血，麻醉處死小鼠，分離肝臟[15]。

1.2.3 血液和組織樣本采集 末次給予酒精6 h后，取血后，麻醉處死，分離肝臟，選取左葉常溫保存于福爾馬林中，其余肝臟保存于-80 ℃。將血液室溫靜置30 min，在4 ℃，以1000 r/min離心30 min，分離血清，保存于-80 ℃。

1.2.4 生化指標(biāo)檢測 血清中AST、ALT和TG水平與肝組織中GSH-Px、SOD、GSH試劑盒和MDA試劑盒指標(biāo)檢測按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行規(guī)范操作。

1.2.5 肝臟病理學(xué)檢測 將固定肝組織標(biāo)本切取厚度不超過0.5 cm小塊置于包埋盒中，用自來水沖洗24 h，經(jīng)由低濃度到高濃度酒精脫水，用溶于石蠟的透明劑二甲苯透明后，浸蠟包埋。用蠟塊固定在旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上，切成5 μm厚度薄片，溫水展開貼在載玻片上。將切片進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.2.6 蛋白印記檢測肝組織中蛋白的表達(dá) 運(yùn)用BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度，將SDS-PAGE（10%～12%）分離凝膠分離等量的蛋白樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后封閉1 h，經(jīng)p-ERK、p-JNK、p-P38和GAPDH一抗孵育，4 ℃條件下放置過夜，然后使用酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h。將A和B試劑等體積混合，PVDF膜與混合液充分接觸，在全能型成像系統(tǒng)中曝光。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋參枳椇子組合物對小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響

AST主要分布在肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，ALT主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，肝細(xì)胞損傷后釋放到血液，兩種轉(zhuǎn)氨酶活性增加，血液中AST和ALT酶水平可以作為肝損傷信號(hào)，反映肝臟受損情況[16]。如圖1所示，與正常組相比，模型組中ALT和AST活力極顯著升高（P＜0.01），表明酒精引起小鼠肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶活力升高；與模型組相比，西洋參枳椇子組合物Ⅰ極顯著降低ALT活力（P＜0.01）且顯著降低AST水平（P＜0.05），西洋參枳椇子組合物Ⅱ、Ⅲ極顯著降低ALT和AST活力（P＜0.01），西洋參給藥組間無顯著性差異。血清中轉(zhuǎn)氨酶的活力下降，說明西洋參枳椇子組合物具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

圖1 西洋參枳椇子組合物對小鼠血清ALT（A）和AST（B）活力的影響Fig.1 Effect of AGH on on the activities of serum ALT and AST in mice

2.2 西洋參枳椇子組合物對血清中甘油三酯的影響

甘油三酯由肝臟合成，是脂肪酸在人體內(nèi)儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)闹饕问剑^量攝入酒精可以使肝臟中甘油三酯積累，引起肝臟脂質(zhì)代謝異常[17]。與正常組相比，模型組小鼠血清中TG含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，組合物Ⅰ、Ⅱ組顯著降低小鼠血清中TG含量（P＜0.05），組合物Ⅲ極顯著降低TG含量（P＜0.01），各組間無顯著性差異。結(jié)果表明組合物能夠降低小鼠血清脂類物質(zhì)水平(圖2)。

圖2 西洋參枳椇子對小鼠血清TG含量的影響Fig.2 Effect of AGH on on the content of serum TG in mice

2.3 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織抗氧化能力的影響

酒精在肝臟被酒精脫氫酶轉(zhuǎn)化為有害物質(zhì)乙醛，乙醛隨后被醛脫氫酶代謝為乙酸，在代謝過程中可以促進(jìn)自由基如活性氧（ROS）產(chǎn)生，進(jìn)而引起脂質(zhì)過氧化[18]。此外，過量ROS導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)生，使抗氧化劑水平降低，導(dǎo)致氧化還原平衡失調(diào)[19]。肝細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性抗氧化酶，SOD和GSH-Px可以維持氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)，但酒精攝入增加活性氧水平，影響抗氧化酶水平，從而導(dǎo)致肝臟損傷[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01），還原型GSH含量極顯著降低（P＜0.01）和MDA含量極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，組合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極顯著升高了SOD、GSH-Px活力（P＜0.01）和GSH水平（P＜0.01），極顯著降低MDA含量（P＜0.01）。組 合物Ⅱ中GSH-Px、SOD活力 和GSH含量極顯著高于組合物Ⅰ，具有顯著性差異（P＜0.01），同時(shí)GSH-Px和SOD活力也高于組合物Ⅲ，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；組合物Ⅱ中MDA含量極顯著低于組合物Ⅰ（P＜0.05），低于組合物Ⅲ，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可說明組合物Ⅱ抗氧化能力高于組合物Ⅰ和組合物Ⅲ，結(jié)果提示該組合物明顯改善小鼠肝組織中酒精引起的氧化應(yīng)激情況(圖3)。

圖3 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織中SOD（A）、GSHPx（B）活性和GSH（C）、MDA（D）含量的影響Fig.3 Effects of AGH on SOD, GSH-Px activity and GSH,MDA content of liver tissue in mice

2.4 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝臟病理的影響

肝臟病理組織H&E染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯變性、壞死；模型組小鼠肝組織中細(xì)胞間出現(xiàn)大量白色脂滴和炎性細(xì)胞浸潤情況，說明酒精引起肝細(xì)胞中脂質(zhì)代謝異常；西洋參枳椇子組中小鼠肝細(xì)胞排列逐漸緊密、脂滴數(shù)量逐漸減少并且炎性浸潤程度減輕，說明組合物具有改善脂質(zhì)代謝和抗炎的作用(圖4)。

圖4 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝組織病理形態(tài)（蘇木精-伊紅染色，400×）Fig.4 Liver pathomorphology in different groups（H & E Staining, 400×）

2.5 西洋參枳椇子組合物對小鼠肝臟MAPK信號(hào)通路的影響

與正常組相比，模型組中p-ERK，p-JNK和p-P38的水平明顯增加（P＜0.01），組合物，組合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ極顯著降低p-ERK、p-JNK和p-P38的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)果表明，西洋參枳椇子組合物可能抑制ERK、JNK和P38的磷酸化從而減輕肝細(xì)胞凋亡(圖5)。

圖5 西洋參枳椇子組合物對MAPK信號(hào)通路中p-JNK、p-P38、p-ERK的影響Fig.5 Effects of AGH on p-ERK，p-JNK and p-P38 in MAPK signaling pathway

3 結(jié)論

肝臟是藥物代謝和解毒功能的重要器官，日常生活中過量飲酒或服用藥物都會(huì)引發(fā)肝臟的損傷[21-22]。肝細(xì)胞中儲(chǔ)存了大量血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT，當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，膜通透性增加，胞內(nèi)大量AST、ALT擴(kuò)散到血液中，以AST、ALT水平高低判斷肝細(xì)胞是否損傷[16]。而且在ALD早期發(fā)病機(jī)理研究表明，酒精進(jìn)入機(jī)體后，乙醇可影響脂肪代謝，導(dǎo)致TG在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，大量蓄積導(dǎo)致病變[23-24]。酒精經(jīng)酶代謝時(shí)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，消耗大量還原性物質(zhì)如GSH，從而無法清除過多自由基，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物迅速增加，肝細(xì)胞膜受損[25]。因此GSH多少是衡量抗氧化能力重要因素[26]，MDA含量可以反映過氧化損傷和細(xì)胞受損程度[18]。

ALD早期損傷多可逆轉(zhuǎn)，如及時(shí)進(jìn)行針對性治療可防止發(fā)展到肝硬化、肝癌等疾病，有效預(yù)防與治療ALD已成為醫(yī)藥與功能性食品領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，并且研究證明食藥同源天然產(chǎn)物具有較好預(yù)防保護(hù)酒精性肝損傷的作用[27]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用食藥同源西洋參和枳椇子組合物，通過西洋參與枳椇子配伍后提取出有效成分，并發(fā)現(xiàn)其對酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善脂質(zhì)代謝、提高抗氧化能力和抑制MAPK信號(hào)通路活化有關(guān)，這一結(jié)果為西洋參與枳椇子配伍應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。