QuEChERS-UPLC-MS/MS法測(cè)定雞蛋中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留量

譚建林，彭珍華，趙秀琳，馬雪濤，張雪媛，劉曉林，胡贈(zèng)彬，馮 雷

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院/國家熱帶農(nóng)副產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 云南昆明 650223）

氨基甲酸酯類農(nóng)藥殺蟲效果明顯，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[1]，但其對(duì)人畜有急性毒性作用，同時(shí)農(nóng)產(chǎn)品中殘留氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)公眾危害較大[2-3]。因此，我國和其他許多國家和地區(qū)對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥在食品中的殘留制定了限量標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，歐盟規(guī)定禽蛋中涕滅威的最高殘留量為：0.01 mg/kg；滅多威的最高殘留量為：0.02 mg/kg；呋線威、丙硫克百威和殘殺威的最高殘留量為：0.05 mg/kg[3]，而我國GB2763規(guī)定了蛋類中丁硫克百威、滅多威、殺線威和霜霉威的最大殘留量分別為：0.05、0.02、0.02和0.01 mg/kg，其他氨基甲酸酯類殺蟲劑并未作限量要求[4]。

目前我國檢測(cè)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)主要有酶抑制法[6-7]、液相色譜-柱后衍生法[8-10]、氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-19]。近年來，一些生產(chǎn)者為了降低雞的病死率，在生產(chǎn)過程中濫用各種農(nóng)藥和獸藥。從歐洲爆出雞蛋中氟蟲腈污染的食品安全事件[20]，使人們對(duì)雞蛋中農(nóng)獸殘的關(guān)注日益增加，但是國內(nèi)目前對(duì)雞蛋中農(nóng)藥殘留的研究較少，主要采用氣相色譜法[21]。由于氟蟲腈事件，關(guān)于雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留的研究和標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)較多[22-24]，但目前還未有雞蛋中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。此外，氨基甲酸酯類農(nóng)藥相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和應(yīng)用中的前處理大多采用固相萃取小柱進(jìn)行凈化[8-10,25-26]，前處理成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣，運(yùn)用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective,rugged and safe）方法對(duì)提取液進(jìn)行凈化，操作簡(jiǎn)單、效率高。本研究建立了同時(shí)測(cè)定雞蛋中的19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留量的快速分析方法，為蛋類樣品中農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購（每批采購數(shù)量：1 kg）；乙腈 色譜純，德國默克集團(tuán)；氯化鈉 分析純，四川西隴化工有限公司；甲酸銨 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）：19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（二氧威、惡蟲威、殘殺威、乙硫苯威、仲丁威、甲硫威、猛殺威、農(nóng)蟲威、甲萘威、滅多威、茚蟲威、抗蚜威、乙霉威、霜霉威、丁硫克百威、異丙威、殺線威、克百威（3-羥基克百威）、涕滅威（涕滅威砜、涕滅威亞砜）） 壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

LC-MS 8050串聯(lián)質(zhì)譜儀 日本島津公司；0.1 mg和0.01 mg分析天平 瑞士梅特勒公司；TGL-20B高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Milli-Q超純水儀 德國默克化工技術(shù)有限公司；KQ-800DE超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX2渦旋振蕩器 德國IKA集團(tuán)；Research? plus 20～200 μL、10～1000 μL移液槍 德國 Eppendorf 公司；PSA/C18凈化管（100 mg/100 mg） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；C18E小柱（500 mg/6 mL） 月旭科技（上海）股份有限公司；HLB小柱（200 mg/3 mL） 島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；NH2小柱（200 mg/3 mL） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取1 kg雞蛋去殼后混合均勻（GB 2763 附錄A），稱取2 g試樣至50 mL 離心管，加入2 g氯化鈉和10 mL乙腈，渦旋2 min，冰浴冷卻，8000 r/min條件下離心10 min，取1.0 mL上清液到PSA/C18凈化管中，渦旋1 min，靜置5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜至樣品瓶中，待測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確移取各氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確移取各氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成400 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋，配制成濃度為0.2、1、5、10、20和50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 色譜條件 采用Penomenex Kinetex 1.7 μ XB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品溫度8 ℃；流動(dòng)相A：10 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。梯度洗脫程序：0 min，流動(dòng)相B：25%；0～2.8 min，流動(dòng)相B：25%～95%；2.8～4.0 min，流動(dòng)相B：95%～95%；4.1～6.0 min，流動(dòng)相B：25%～25%。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），霧化氣流量：2.8 L/min；加熱氣和干燥氣流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃，接口電壓：4.0 kV；碰撞氣為氬氣。定量離子對(duì)和定性離子對(duì)見表1（定量及定性方法參考?xì)W盟《食品飼料中農(nóng)殘分析的質(zhì)量控制和方法確認(rèn)的指導(dǎo)文件SANTE/11945/2015》）。

表1 化合物的離子對(duì)、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Ion pair, linear equations, correlation coefficients, recoveries, relative standard deviations （RSDs）, LOD and ME for analytes （n=6）

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在島津公司的LabSolutions Version 5.89軟件下進(jìn)行采集以及對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果定量和定性分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)重復(fù)為6次。采用Execl 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和表格制作。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相選擇

一般來說，采用串聯(lián)質(zhì)譜法分析氨基甲酸酯類農(nóng)藥的流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液/乙腈[15-17]，電噴霧離子源正離子模式下在流動(dòng)相中加入一定量的甲酸、甲酸銨、乙酸銨等，可以增加目標(biāo)離子的離子化狀態(tài)，提高目標(biāo)物離子化效率，改善峰形，提高分離度。本實(shí)驗(yàn)分別采用A組：0.1%甲酸水溶液/乙腈、B組：5 mmol/L乙酸銨水溶液/乙腈和C組：0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨溶液/乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行分析。如圖1所示，以5 mmol/L乙酸銨水溶液/乙腈分析時(shí)，與0.1%甲酸水溶液/乙腈相比較，除霜霉威外的其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的出峰時(shí)間均縮短，靈敏度也在一定程度上提高，但霜霉威存在嚴(yán)重拖尾情況，這表明甲酸銨的加入可提高氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度，為解決霜霉威的拖尾現(xiàn)象，在甲酸銨溶液中加入0.1%甲酸，很好的解決了該現(xiàn)象，最終以0.1%甲酸+10 mmol/L甲酸銨溶液/乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的響應(yīng)相對(duì)是最高的，峰形最優(yōu)，無拖尾情況，因而采用C組作為流動(dòng)相。

圖1 流動(dòng)相選擇Fig.1 Mobile phase selection

2.2 凈化小柱選擇

本研究檢測(cè)的農(nóng)藥在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，但是極性相差很大，對(duì)凈化小柱的選擇尤為重要。HLB小柱對(duì)堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度；NH2小柱可以有效去除樣品中的磺酸根離子等強(qiáng)陰離子和糖類等高極性有機(jī)化合物；PSA吸附劑對(duì)脂肪酸結(jié)構(gòu)化合物具有較強(qiáng)的吸附作用；C18可以去除非極性化合物。本實(shí)驗(yàn)采用四種不同類型填料的小柱分別進(jìn)行凈化，四種凈化小柱分別為：C18E小柱、HLB小柱、NH2小柱和C18/PSA凈化管?？瞻纂u蛋樣品先加入1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg/mL），經(jīng)1.2.1方法處理，提取完成后分別取2 mL用四種凈化小柱進(jìn)行凈化（使用前活化），以目標(biāo)物回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)比較不同的凈化效果，結(jié)果如圖2所示。對(duì)于氨基甲酸酯類農(nóng)藥來說，C18E小柱回收率最差（回收率為23.6%～67.2%，最低為霜霉威：23.6%，最高為殘殺威：67.2%），其次是HLB小柱（回收率為53.2%～111.0%，最低為棉鈴?fù)?3.2%，最高為霜霉威：111.0%），NH2小柱和C18/PSA凈化管獲得的回收率較好（NH2小柱回收率為：63.8%～126.2%，最低為棉鈴?fù)?3.8%，最高為霜霉威：126.2%；C18/PSA凈化管小柱回收率為：66.5%～110.9%，最低為異丙威：66.5%，最高為丁硫克百威：110.9%），22種化合物，NH2小柱對(duì)其中3種農(nóng)藥殘留回收率最高，C18/PSA對(duì)其中18種農(nóng)藥殘留回收率最高，相對(duì)于其他的三種凈化方式，C18/PSA凈化效果好、回收率高，且操作簡(jiǎn)單、前處理效率高，適合大批量的樣品檢測(cè)，同時(shí)可以有效吸附雞蛋中脂肪等雜質(zhì)。因此選用C18/PSA凈化管作為雞蛋中氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測(cè)的凈化方式。

圖2 四種凈化小柱對(duì)目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of four kinds of purification columns on the recovery of target materials

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME：Matrix Effect）指樣品中其他成分對(duì)目標(biāo)待測(cè)物測(cè)定值的影響，即基質(zhì)對(duì)分析方法準(zhǔn)確測(cè)定分析物能力的干擾[24]。本實(shí)驗(yàn)采用乙腈對(duì)雞蛋進(jìn)行提取，提取液中可能含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)，均可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。采用提取后添加的方法，通過比較以乙腈為溶劑和空白提取溶液為溶劑，分別配制0.2、1、5、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。比較乙腈溶劑與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，評(píng)估雞蛋的基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)（%）=（空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100[27-28]。ME值如果是正，則是正效應(yīng)，基質(zhì)可提高目標(biāo)物效應(yīng)，ME值如果是負(fù)，則是負(fù)效應(yīng)，基質(zhì)可降低目標(biāo)物效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng) 按 其 絕 值|ME|分 為3個(gè) 等 級(jí)[29-30]：0%＜|ME|≤20%，是弱基質(zhì)效應(yīng)；20%＜|ME|≤50%，是中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞50%，是強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。從表1中可以看出，雞蛋樣品不同的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，基質(zhì)效應(yīng)是不同的，22種化合物，4種ME＞0，18種ME＜0，全部為弱基質(zhì)效應(yīng)（0%＜|ME|≤20%）。因此，本實(shí)驗(yàn)無需使用樣品基質(zhì)來配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，有效的節(jié)約成本和縮短前處理時(shí)間。

2.4 方法評(píng)價(jià)

采用1.2.3儀器條件對(duì)0.2～50 ng/mL的氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，由表1可見，各標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，結(jié)果說明了本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法在其線性范圍內(nèi)的線性相關(guān)性良好。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖3，圖中峰號(hào)所對(duì)應(yīng)農(nóng)藥名稱見表1。

圖3 19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物色譜圖Fig.3 Chromatogram of 19 carbamate pesticides and metabolites residues

方法檢出限是依據(jù)1.2.2操作步驟，制備不含目標(biāo)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的空白基質(zhì)樣品提取液，逐級(jí)稀釋氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，當(dāng)定量離子對(duì)和定性離子對(duì)的信噪比為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的含量為檢出限。19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥因其理化性質(zhì)不同，在色譜柱上保留時(shí)間和質(zhì)譜上離子化效率不同，猛殺威、抗蚜威、霜霉威、丁硫克百威和克百威響應(yīng)相對(duì)較好，檢出限較低；其余氨基甲酸酯類農(nóng)藥離子化效率相對(duì)較小，因此檢出限也較高。19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的檢出限結(jié)果見表1。

選取陰性的典型樣品，向試樣中添加氨基甲酸酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行10、20、50 μg/kg（農(nóng)蟲威檢出限、2倍農(nóng)蟲威檢出限和5倍農(nóng)蟲威檢出限）的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每份樣品檢測(cè)6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法的回收率為69.3%～107.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.21%。說明該方法對(duì)雞蛋中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物的測(cè)定，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

采用本檢驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)上采購的20批雞蛋進(jìn)行19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留檢測(cè)，以保留時(shí)間、定性離子對(duì)和離子對(duì)豐度比進(jìn)行定性分析，以定量離子對(duì)進(jìn)行定量分析。20批雞蛋樣品均未檢出19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留。

3 結(jié)論

本方法用乙腈進(jìn)行提取，采用QuEChERS方式進(jìn)行凈化，優(yōu)化了流動(dòng)相和凈化小柱，考察了不同的凈化方式和雞蛋樣品的基質(zhì)效應(yīng)，建立了雞蛋中19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法前處理過程快速簡(jiǎn)單，能實(shí)現(xiàn)大批量樣品的快速處理，方法的檢出限、精密度、穩(wěn)定性和線性關(guān)系均滿足19種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其代謝物殘留的分析檢測(cè)要求。