烘焙類食品中葉黃素酯提取及檢測(cè)方法建立

王 霞，朱金錦，曹雁平,

（1.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京工商大學(xué), 北京100048；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院, 北京100048）

葉黃素酯，一種由游離葉黃素和脂肪酸酯化形成的脂溶性類胡蘿卜素脂肪酸酯[1-2]，存在于蔬菜、水果、谷物[3]、微藻中[4]，主要來源于萬壽菊[5-6]，是葉黃素在自然界中的主要存在形式[7], 在日光照射、強(qiáng)酸和高溫環(huán)境下降解速率小于葉黃素，在中性和堿性條件下較為穩(wěn)定[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)增加游離葉黃素和葉黃素酯的攝入能夠預(yù)防老年性黃斑褐變（Age-related Macular Degeneration, AMD）[10]，游離葉黃素和葉黃素酯均能顯著提高血清葉黃素濃度和黃斑色素光密度（Macular Pigment Optical Density, MPOD），兩者之間無明顯差異，被認(rèn)為是有效的葉黃素補(bǔ)充劑[11]，而且葉黃素酯分解得到的葉黃素其生物利用率優(yōu)于游離葉黃素[12]。2008年，國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)葉黃素酯為功能性新資源食品，已經(jīng)應(yīng)用于曲奇餅干、蛋糕、酸奶、壓片糖果等食品的加工[13-16]。

萬壽菊中葉黃素酯的提取方法包括有機(jī)溶劑提取、微波提取、超聲輔助提取、酶輔助提取、超臨界提取和亞臨界提取等，其中最常用的是有機(jī)溶劑提取法[17-20]。天然葉黃素酯種類較多，在進(jìn)行定量分析時(shí)，一般以全反式葉黃素的含量表示，因此需進(jìn)行堿皂化前處理，將葉黃素酯皂化成葉黃素[21-23]。目前食品中葉黃素的提取檢測(cè)采用GB 5009.248-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉黃素的測(cè)定》法，而添加到烘焙食品中的葉黃素酯需要將食品中的油脂和葉黃素酯皂化，國(guó)標(biāo)中沒有推薦方法，因此有必要研究皂化條件。此外，國(guó)標(biāo)采用的葉黃素萃取溶劑體系有乙醚，屬于受到嚴(yán)格安全管理的易制爆危險(xiǎn)化學(xué)品，銷售、儲(chǔ)存和使用要求高。本文以烘焙食品為實(shí)際體系，對(duì)食品中的葉黃素酯和油脂進(jìn)行皂化條件研究，另篩選不含乙醚的葉黃素萃取溶劑體系，為高效、低成本地提取葉黃素奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葉黃素酯浸膏 河北晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；低筋蛋糕粉 新良面粉公司；雞蛋 北京德青源公司；烘焙細(xì)砂糖 結(jié)晶糖粉，廣州華糖食品有限公司；Crisco人造黃油 美國(guó)J. M. Smucker公司；無碘食用鹽 中鹽集團(tuán)；碳酸氫鈉 食品級(jí)，上海楓未實(shí)業(yè)有限公司；碳酸氫銨 食品級(jí)，海祥食品有限公司；雙效泡打粉 北京古松食品有限公司；氫氧化鉀 分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑公司；2, 6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT） 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇、環(huán)己烷、正己烷 色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；乙醚 分析純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；乙酸乙酯、丙酮分析純，福晨（天津）化學(xué)試劑公司；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品97%純度，美國(guó)Chromadex公司。

HM600和面機(jī) 海氏Hauswirt公司；打蛋器千團(tuán)精工廚具（浙江）公司；KB5010振蕩器 其林貝爾儀器制造有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮公司生化儀器廠；ME203E分析天平 德國(guó)賽多利斯公司；TDZ4-WS離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；W2695高效液相色譜 配有二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 蛋糕制備工藝：參考El-Sayed M[24]瑪芬蛋糕的制作并做修改，將90 g全蛋液低速打散，加入含有葉黃素酯的黃油中；加入70 g糖和1 g鹽；加30 g水；加130 g低筋蛋糕粉和4 g泡打粉，用刮刀翻拌；再放入到和面機(jī)中，第4擋攪拌5 min，第5擋攪拌10 min，制成面糊。

蛋卷制備工藝：借鑒《焙烤食品工藝》[25]，將165 g人造黃油軟化，與0.06 g葉黃素酯浸膏混合；180 g全蛋液和2 g鹽、90 g細(xì)砂糖混合加入油脂中；加入110 g低筋蛋糕粉攪勻；再放入到和面機(jī)中，第4擋攪拌5 min，第5擋攪拌10 min，制成面糊。

餅干制備工藝：參考Zou等[26]酥性餅干的制作并修改，稱取0.05 g葉黃素酯浸膏與軟化后的20 g人造黃油混勻；將30 g細(xì)砂糖、1 g鹽、0.8 g碳酸氫鈉、0.4 g碳酸氫銨放入16 g水中攪拌；相互混勻，與70 g低筋魔堡蛋糕粉混合制成面團(tuán)，用刮刀翻拌直至顏色均勻分布在面團(tuán)中。

1.2.2 葉黃素酯浸膏中的葉黃素組成分析 葉黃素酯浸膏溶液的配制：取一定量的葉黃素酯浸膏溶解于0.1% BHT無水乙醇中，配制0.5 mg/L葉黃素酯浸膏溶液，用0.22 μm尼龍膜過濾，進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 葉黃素酯皂化條件研究 葉黃素酯的皂化[27]：準(zhǔn)確稱取2 g樣品（面糊或者面團(tuán)）于50 mL離心管中，加入0.2 g BHT和10 mL無水乙醇，振蕩均勻。分別加入10 mL 20、40、60 g/100 mL KOH水溶液，渦旋振蕩1 min混勻，用錫紙包裹樣品后在室溫下分別振蕩1、2、3、4 h，每個(gè)樣品5次平行。

皂化后的樣品加入10 mL萃取劑避光振蕩5 min后，4500 r/min離心3 min，再重復(fù)提取2次，合并提取液。萃取后的樣品以10 mL水洗滌，4500 r/min離心3 min分層，再重復(fù)洗滌1次，合并有機(jī)相。在水溫30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用0.1% BHT乙醇溶液潤(rùn)洗圓底燒瓶并振蕩溶解殘?jiān)黐28]，最終定容于25 mL棕色容量瓶中，過0.22 μm尼龍膜，進(jìn)行色譜分析。

1.2.4 萃取溶劑篩選 吸取5 mL 0.02 g/100 mL的葉黃素酯乙醇溶液于50 mL離心管中，加入10 mL 60 g/100 mL KOH，10 mL 0.1% BHT無水乙醇，渦旋振蕩1 min混勻，室溫下皂化3 h，每個(gè)樣品平行5次。皂化后的樣品處理同1.2.3。

參照國(guó)標(biāo)[28]、孔凡華等[29]、溶劑極性，萃取溶劑體系選取見表1。

表1 萃取溶劑體系Table 1 Extraction solvent

1.2.5 檢測(cè)方法

1.2.5.1 高 效 液 相 色 譜 法 HPLC-PDA條 件[28]：Venusil XBP C30色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇/水（88/12，v/v）和甲基叔丁基醚；梯度洗脫，0～18 min，甲醇/水由100%變換至10%；18.1 min，甲醇/水由10%變換至100%，保留10 min；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：445 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

1.2.5.2 葉黃素酯含量測(cè)定

式中，X表示樣品中葉黃素酯的含量，μg/g；m表示樣品重量，g；c表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線而得的樣液中標(biāo)準(zhǔn)品的含量，μg/mL；V表示樣品最終定容體積，mL；F表示校正系數(shù)。用液相色譜分析試樣溶液,將反式葉黃素與異構(gòu)體的色譜峰面積加合作為總峰面積，其中反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數(shù)。本研究中葉黃素酯含量以總?cè)~黃素計(jì)。

1.2.5.3 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取5 mg葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，以0.1% BHT乙醇溶液溶解并定容于25 mL棕色容量瓶，配制200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。母液避光儲(chǔ)藏于-80℃冰箱。從母液200 μg/mL中移取100、250、500、750、1000、1250、1500 μL溶液至10 mL棕色容量瓶中，用0.1% BHT乙醇溶液定容，得到濃度依次為2、5、10 、15 、20 、25 、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。將不同濃度的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)液用0.22 μm尼龍膜過濾，進(jìn)行色譜分析。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 方法的評(píng)價(jià) 采用方法回收率、精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)方法[29-30]。

分別向50 mL離心管中加入2 mL 30、60、90 μg/mL葉黃素標(biāo)品，用10 mL去離子水代替上述60 g/100 mL KOH，加入10 mL 0.1% BHT無水乙醇后，漩渦振蕩1 min混勻，用1.2.4篩選出的萃取溶劑體系進(jìn)行加標(biāo)回收。在水溫30 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用0.1% BHT乙醇溶液潤(rùn)洗圓底燒瓶并振蕩溶解殘?jiān)罱K定容于10 mL棕色容量瓶，每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行3組。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布的前提下用單因素方差分析葉黃素酯含量，P＜0.05，認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉黃素酯的皂化條件優(yōu)化及組成分析

用20、40、60 g/100 mL KOH水溶液分別在室溫下進(jìn)行1、2、3、4 h皂化振蕩，得到的葉黃素含量曲線如圖1所示。由圖1得知，1～4 h 60 g/100 mL KOH皂化下蛋糕面糊、蛋卷面糊和餅干面團(tuán)中皂化出來的葉黃素含量趨于平穩(wěn)。

圖2 為20 g/100 mL KOH皂化后從蛋糕面糊、蛋卷面糊和餅干面團(tuán)提取的葉黃素乙醇溶液照片，此條件下提取出來的葉黃素乙醇溶液中含有白色的絮狀析出物。油脂（如棕櫚油、柴油）不能在乙醇中均勻分散，溶解性差，因此推測(cè)白色絮狀物質(zhì)為未皂化的油脂[31]。隨著時(shí)間的推移，白色絮狀物質(zhì)逐漸減少，可以推斷出對(duì)于本研究的樣品，KOH皂化焙烤樣品中的油脂和葉黃素酯是同時(shí)進(jìn)行的，但是水解油脂速率大于葉黃素酯。在圖1中40 g/100 mL KOH條件下葉黃素含量呈上升趨勢(shì)，因?yàn)閴A液濃度的提升加快了KOH與油脂、葉黃素酯碰撞的概率。當(dāng)皂化條件為60 g/100 mL KOH、3 h時(shí)葉黃素的含量達(dá)到最大值，之后趨于平穩(wěn)。

圖1 不同皂化條件下蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）、餅干面團(tuán)（c）中葉黃素的含量Fig.1 Lutein content in cake batter （a）, egg roll batter （b） and biscuit dough （c） in different saponification conditions

圖2 20 g/100 mL KOH皂化后從蛋糕面糊（a）、蛋卷面糊（b）和餅干面團(tuán)（c）提取的葉黃素乙醇溶液圖Fig.2 Lutein ethanol solutions extracted from cake batter （a）,egg roll batter （b） and biscuit dough （c） after 20 g/100 mL KOH saponification

從圖3（A）可以看出，譜圖主要有4種峰，其中d峰是溶劑中的BHT，用于阻礙葉黃素酯和皂化出來的葉黃素在操作中的氧化[32]。與標(biāo)準(zhǔn)反式葉黃素的色譜圖對(duì)比，確定a峰為反式葉黃素。葉黃素酯分為單酯和二酯，種類較多，其中含量最多的為葉黃素二棕櫚酸酯，與葉黃素二棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖對(duì)比，確定c中含有大量的葉黃素二棕櫚酸酯，則推斷c峰為葉黃素二酯。

圖3 葉黃素酯浸膏（A）、葉黃素二棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（B）、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（C）、0.1% BHT乙醇溶劑（D）色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of lutein ester extract（A）, lutein dipalmitate standard（B）, lutein standard（C）, 0.1% BHT ethanol solvent（D）

圖4 為用60 g/100 mL KOH皂化3 h后蛋糕面糊、蛋卷面糊和餅干面團(tuán)中葉黃素酯的液相譜圖。由圖4可以看出，此皂化條件下的液相色譜圖上只有反式葉黃素和其異構(gòu)體[33]，葉黃素酯皂化完全，說明60 g/100 mL KOH 室溫振蕩3 h，葉黃素酯全部從油中分離且皂化完全。此外，皂化之后，圖4（A）中的b、c峰消失，a峰面積增加，則推斷b峰為葉黃素單酯[34]。劉春菊等[35]報(bào)道發(fā)酵面包中皂化葉黃素酯條件為160 mL 40 g/100 g KOH溶液條件下60 ℃回流皂化3 h，在60 ℃ 3 h的皂化過程中，溫度可能會(huì)對(duì)葉黃素造成損失。本方法利用振蕩器可以同時(shí)皂化更多的樣品，耗能低，操作簡(jiǎn)便，而且有研究證明，影響葉黃素的穩(wěn)定性因素溫度＞pH[36]，因此本方法采用室溫、高濃度堿的方法進(jìn)行皂化。

圖4 用60 g/100 mL KOH皂化3 h后蛋糕面糊（A）、蛋卷面糊（B）和餅干面團(tuán)（C）中葉黃素酯的液相譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of lutein esters in cake batter （A）,egg roll batter （B） and biscuit dough （C） after saponification with 60 g/100 mL KOH for 3 h

2.2 萃取溶劑體系的效果分析

所選萃取溶劑體系的效果如表2，其中萃取溶劑體系3的提取效果最差，萃取溶劑體系1、2、4無顯著性差異。

表2 不同萃取溶劑體系萃取效果Table 2 Extraction effect of different extraction solvent systems

在萃取過程中，尤其是第二次萃取時(shí)（圖5），含丙酮組試劑出現(xiàn)明顯的三層分層，且中間層顏色較深。對(duì)中間層試劑單獨(dú)處理，進(jìn)行1.2.3中的去離子水潤(rùn)洗步驟中發(fā)現(xiàn)二者不分層，而丙酮與水任意比例互溶，猜測(cè)其為丙酮?？紤]其中含有一定量的葉黃素，為避免誤差，用正己烷進(jìn)行重復(fù)提取，合并有機(jī)相。

圖5 不同萃取劑第二次萃取時(shí)效果圖Fig.5 Effect diagram of different extractants during the second extraction

因丙酮組萃取過程繁瑣，萃取劑1和2無明顯差異，乙醚的沸點(diǎn)為34.5 ℃，乙酸乙酯的沸點(diǎn)為73.94 ℃，屬于低毒性化學(xué)品，通過表3對(duì)比萃取劑成本，萃取溶劑1成本最低。綜上，選擇萃取劑1為最佳萃取劑。

表3 萃取溶劑成本對(duì)比Table 3 Comparison of extraction solvent cost

2.3 方法線性范圍、檢出限

如圖6所示，葉黃素在0～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=174.31x-15.898，相關(guān)系數(shù)R2=1。根據(jù)檢出限為信噪比S/N=3時(shí)的濃度，得到此方法的檢出限為0.5 μg/mL。國(guó)標(biāo)方法食品中葉黃素的檢出限為3 μg/100 g，經(jīng)公式（1）換算，檢出限為0.012F μg/mL（F為校正系數(shù)，反式葉黃素峰面積除以總峰面積所得值為校正系數(shù)，0＜F＜1），色譜條件相同，但檢出限存在差異，推測(cè)其誤差可能為HPLC儀器型號(hào)的不同，以及儀器在工作過程中產(chǎn)生的噪音不同。檢出限不但與儀器噪音有關(guān)，還與樣品在處理過程中的每一個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)。

圖6 葉黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of lutein

2.4 方法回收率和精密度

如表4所示，用環(huán)己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2提取回收，葉黃素回收率為94.31%～103.83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%（1.78%～4.08%）。

表4 葉黃素加標(biāo)回收和方法精密度結(jié)果Table 4 Lutein spiked recovery and method precision results

3 結(jié)論

通過對(duì)烘焙食品中葉黃素酯的皂化條件進(jìn)行研究，得到最佳皂化時(shí)間為3 h，KOH水溶液濃度為60 g/100 mL。此外，通過對(duì)比不同萃取溶劑的萃取效果顯示，環(huán)己烷:正己烷:乙酸乙酯=1:2:2萃取效果較佳，單位萃取劑成本比國(guó)標(biāo)降低了72.4%，該方法精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，回收率為94.31%～103.83%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。