甜葉菊有效成分動(dòng)態(tài)積累分析及水提液澄清工藝初探

謝 虹，王雪銘，張紅藝，陳 云，梁建生

（1.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 江蘇揚(yáng)州 225009；2.巴州正達(dá)綠源生物科技有限公司, 新疆和靜 841303）

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是一種發(fā)源于南美洲的多年生草本植物[1]，我國于1977年試種成功后，甜葉菊種植面積居世界首位，近年來主要集中在安徽、甘肅和新疆等地種植[2]。甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs）是甜葉菊葉中含量最高的一類二萜類化合物的總稱，具有甜度高、熱量低、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，可作為“甜味劑”應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域[3-4]。甜葉菊所含有的SGs達(dá)30多種，各糖苷雖結(jié)構(gòu)相似但性質(zhì)各異。甜菊苷（Stevioside，ST）的甜度是蔗糖的近200倍，有明顯的后苦味；瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）的甜度為蔗糖甜度的350倍，但其甜味呈現(xiàn)較慢，有一定的后苦味；瑞鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）和瑞鮑迪苷M（Rebaudioside M，RM）的甜度是蔗糖甜度的350倍，苦澀后味明顯減少，最接近蔗糖的感官特征[5-8]。酚類是甜葉菊中另一類含量較高的化合物，總量可達(dá)甜葉菊干葉質(zhì)量的15.12%，其中綠原酸類含量達(dá)12.85%[9]。綠原酸類亦被稱為咖啡?？鼘幩犷?，包括單咖啡?？鼘幩?、二咖啡酰奎寧酸和三咖啡?？鼘幩醄10]，主要從綠咖啡豆、金銀花和杜仲葉中提取，生產(chǎn)成本較高[11]。研究表明，甜葉菊中二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A）占比最高，咖啡豆、金銀花、杜仲中以單咖啡?？鼘幩幔ňG原酸）為主要組成成分，而綠原酸類的抗氧化活性隨著其分子結(jié)構(gòu)中咖啡?；鶖?shù)量的增加而增強(qiáng)[12]。除了綠原酸類外，甜葉菊還含有多種類黃酮化合物，含量達(dá)2.27%[9]。以往關(guān)于甜葉菊原料的品質(zhì)評(píng)價(jià)和采收期的研究，以ST和RA的含量為考察指標(biāo)[13-15]，將SGs、綠原酸類和類黃酮同時(shí)作為質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)的研究報(bào)道較少。

盡管我國擁有豐富的甜葉菊資源，但目前對(duì)甜葉菊的利用主要集中在SGs的生產(chǎn)上[2]。SGs的制備工藝主要包括水浸提、澄清除雜、大孔吸附樹脂選擇性吸附、離子交換樹脂去除離子和結(jié)晶等工序[4]。甜葉菊水提液含有大量蛋白質(zhì)、色素和可溶性多糖等雜質(zhì)，為了提高SGs產(chǎn)品的質(zhì)量和延長樹脂的使用壽命，對(duì)水提液進(jìn)行除雜預(yù)處理是SGs分離純化的必要環(huán)節(jié)。工業(yè)化生產(chǎn)通常采用硫酸亞鐵作為絮凝劑，以氫氧化鈣作為助凝劑進(jìn)行酸堿中和反應(yīng)形成絮凝沉淀，從而除去甜葉菊水提液中80%的雜質(zhì)[16]。研究表明，酚類化合物隨SGs一同浸出，但在澄清過程中隨廢渣被處理[17]。如能在SGs生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上同時(shí)采用大孔吸附樹脂提取綠原酸類化合物，可以降低生產(chǎn)成本，提高甜葉菊的綜合利用效率。

本實(shí)驗(yàn)以新疆巴州地區(qū)產(chǎn)甜葉菊葉為研究材料，通過探討其中SGs、綠原酸類和類黃酮的積累規(guī)律，為甜葉菊的規(guī)范化栽培和合理采收提供依據(jù)；以甜葉菊水提液的澄清率和9種有效成分保留率為指標(biāo)對(duì)澄清工藝進(jìn)行考察，為甜葉菊水提液同時(shí)保留SGs和綠原酸類的除雜預(yù)處理提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜葉菊葉 新疆巴州正達(dá)綠源生物科技有限公司種植基地（東經(jīng)82°28'～87°52'，北緯42°06'～43°33'）采收，甜葉菊水浸提用實(shí)驗(yàn)材料為10月初公司大面積采收的干葉；RA 對(duì)照品，Tokyo化學(xué)工業(yè)有限公司；ST、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷 對(duì)照品，Solarbio生物科技有限公司；瑞鮑迪苷B（Rebaudioside B，RB）、瑞鮑迪苷C（Rebaudioside C，RC）、杜克苷A（Dulcoside A，DA）、甜茶苷（Rubusoside，Ru）、甜菊雙糖苷（Steviolbioside，SBio） 對(duì)照品，ChromaDex公司；新綠原酸、隱綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 對(duì)照品，成都曼思特生物科技有限公司；綠原酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁 對(duì)照品，成都瑞芬思生物科技有限公司；槲皮素-7-O-葡萄糖苷 對(duì)照品，上海源葉生物科技有限公司；槲皮素-3-O-木糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷 對(duì)照品，四川省維克奇生物科技有限公司；以上對(duì)照品均為色譜純（質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%）；RD、RM 對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%），新疆巴州正達(dá)綠源生物科技有限公司；甲酸 色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸（色譜純）、甲醇（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈 色譜純，瑞典歐普森公司；殼聚糖季銨鹽、殼聚糖鹽酸鹽（脫乙酰度≥90%） 南通綠神生物工程有限公司；聚合氯化鋁（白色和黃色） 河南眾邦環(huán)?？萍加邢薰?；硫酸亞鐵、氫氧化鈣 分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；Sepax GP-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 蘇州賽分科技有限公司；AL204電子天平、320pH計(jì)梅特勒-托利多公司；SP-2001分光光度計(jì) 美國Hoefer公司；DHG-9141A電熱鼓風(fēng)干燥箱 德國美墨爾特公司；5804R冰凍離心機(jī) 德國艾本德公司；純化水器 南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司；AP-01P真空抽濾裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；KQ-100TDE高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；JB300-D強(qiáng)力電動(dòng)攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；HH-4水浴鍋 金壇城東新瑞儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜葉菊采集 2018年5月15日完成甜葉菊譜星6號(hào)扦插苗的移栽定植，種植密度1萬株/666.7 m2，于7月24日（70 d）、8月7日（84 d）、8月21日（98 d）、9月4日（112 d）、9月18日（126 d）、10月2日（140 d）、10月16日（154 d）每隔14 d采摘1次葉片，每次選取高度相近的5個(gè)單株，采摘方式為全株采摘，5個(gè)葉樣本在55 ℃烘箱干燥24 h，每個(gè)葉樣本分別稱重和粉碎后過40目篩備用。

1.2.2 甜葉菊甲醇浸提液的制備 稱取不同時(shí)期采收制備的葉粉末0.50 g，加入30 mL甲醇，室溫超聲（80 kHz）輔助浸提30 min，6000 r/min離心6 min，取上清液，沉淀重復(fù)超聲浸提2次，合并上清液并用甲醇定容至100 mL，得到甲醇浸提液，用以考察甜葉菊中有效成分的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律。每個(gè)樣本同時(shí)取3份進(jìn)行超聲輔助浸提。

1.2.3 甜葉菊水提液制備溫度的考察 每份稱取大面積采收干葉制備的粉末15.00 g，加入300 mL純化水，分別在25、45、65、85 ℃溫度下攪拌浸提60 min，分別離心，取上清液，補(bǔ)足純化水至300 mL。測(cè)定各溫度條件下浸提液中指標(biāo)成分的含量，以選擇適宜的浸提溫度。每個(gè)溫度下取2份葉粉末同時(shí)攪拌浸提。

1.2.4 甜葉菊水提液的制備 取一定量的甜葉菊干葉（不粉碎），按料液比1:20（g/mL）加純化水，浸泡30 min，在65 ℃下攪拌浸提60 min，減壓抽濾，即得深褐色甜葉菊水提液。

1.2.5 最佳絮凝劑的選擇 設(shè)置5組，每組2份，每份甜葉菊水提液400 mL。25 ℃條件下，在每組水提液中分別加入1%殼聚糖季銨鹽水溶液16 mL、1%殼聚糖鹽酸鹽水溶液16 mL、白色聚合氯化鋁7.20 g、黃色聚合氯化鋁7.20 g、硫酸亞鐵3.60 g +氫氧化鈣1.80 g（pH9.50），先以300 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30 s，再以100 r/min攪拌20 min，靜置10 min，分別取各澄清液過濾，取濾液測(cè)定pH、吸光度和指標(biāo)成分含量。

1.2.6 殼聚糖鹽酸鹽投加量對(duì)澄清效果的影響 設(shè)置5組，每組2份，每份甜葉菊水提液400 mL。25 ℃條件下，每組水提液分別按0.35、0.45、0.55、0.65、0.75 g/L（殼聚糖鹽酸鹽質(zhì)量/水提液體積）的投加量加入殼聚糖鹽酸鹽溶液，按“1.2.5”項(xiàng)下的條件進(jìn)行澄清操作，計(jì)算澄清率。

1.2.7 體系溫度對(duì)殼聚糖鹽酸鹽澄清效果的影響設(shè)置5組，每組2份，每份甜葉菊水提液400 mL。每組水提液分別于25、35、45、55、65 ℃恒溫水浴中，按0.45 g/L投加量加入殼聚糖鹽酸鹽溶液中，按“1.2.5”項(xiàng)下的條件進(jìn)行澄清操作，計(jì)算澄清率。

1.2.8 SGs含量的測(cè)定 參照GB 8270-2014《食品添加劑 甜菊糖苷》規(guī)定的方法進(jìn)行含量的測(cè)定與計(jì)算[18]。色譜條件：色譜柱：Sepax GP-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A-NaH2PO4緩沖液（10 mmol/L，pH2.60），B-乙腈，A:B=68:32（V/V）；流速：0.9 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。用30%乙腈水溶液將精密稱量置于10 mL容量瓶中RD、RM、RA、ST、RC、RB、DA、Ru、SBio對(duì)照品溶解定容，得到混合對(duì)照品溶液，進(jìn)入高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）儀用于確定各糖苷在樣品中的相對(duì)保留時(shí)間。精密稱取RA和ST對(duì)照品各10 mg左右，置于25 mL容量瓶中，30%乙腈溶解定容，將制得混合對(duì)照品溶液進(jìn)入HPLC儀4針以上，記錄RA和ST的峰面積并計(jì)算各自峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD），當(dāng)RSD＜2%，將用30%乙腈水溶液稀釋成合適濃度的待測(cè)樣品溶液進(jìn)入HPLC儀進(jìn)行分析。RM與ST分子質(zhì)量比值為1.60。

1.2.9 綠原酸類和類黃酮含量測(cè)定 參照謝虹等[19]建立的方法，以外標(biāo)法計(jì)算甜葉菊中綠原酸類和類黃酮含量。色譜條件：色譜柱：Sepax GP-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序（0～5 min，95%～90% A；5～40 min，90%～66%A；40～45 min，66%～5%A；45～50 min，5%～95%A）；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長：330 nm；進(jìn)樣量：20 μL。因無木犀草素-7-O-蕓香糖苷的對(duì)照品，其含量的計(jì)算以木犀草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品的峰面積及濃度為基準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[19]的公式計(jì)算。

1.2.10 指標(biāo)成分含量的保留率計(jì)算 用HPLC分別對(duì)澄清前后溶液中的RA、ST、RC、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等指標(biāo)成分含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式如下：

水浸提樣品中，由于RD和RM極性較大，在C18色譜柱上保留時(shí)間短，不能與其他雜峰有效分離從而影響定量準(zhǔn)確性，因此以RA、ST和RC作為衡量SGs保留率的指標(biāo)成分。

1.2.11 甜葉菊水提液澄清率的計(jì)算 參照謝捷等[16]的方法測(cè)定水提液澄清率，以純化水為參比，測(cè)定經(jīng)過濾后的甜葉菊水提液在660 nm處的吸光度A0及絮凝劑處理的澄清液經(jīng)過濾后在660 nm處吸光度A1，計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft excel軟件和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行整理與分析，采用Origin 9軟件進(jìn)行畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊葉中有效成分和干物質(zhì)累積動(dòng)態(tài)

由圖1可知，甜葉菊譜星6號(hào)所含糖苷主要包括RD、RM、RA、ST和RC等5種。在取樣期內(nèi)，糖苷總量介于153.73～168.74 mg/g之間，其中RA含量介于101.28～115.20 mg/g之間；RD含量介于17.38～22.16 mg/g之間；RC含量介于14.08～17.33 mg/g之間；ST含量介于8.88～11.62 mg/g之間；RM含量介于5.26～9.03 mg/g之間。由上述結(jié)果和圖2a可知，甜葉菊葉中各糖苷和總糖苷含量相對(duì)穩(wěn)定、波動(dòng)小，羅慶云等[14]以5個(gè)品種甜葉菊葉為研究材料也得出RA和ST含量在生長發(fā)育階段變化幅度小的結(jié)論。與已有研究[14,20-23]采用的守田系列、新光3號(hào)、鑫農(nóng)4號(hào)、同心、綠源、菊隆、GT-1、GY系列、鑫豐3號(hào)、江甜3號(hào)、譜星1號(hào)、中山8號(hào)等甜葉菊品種中SGs相比，本研究選用的甜葉菊譜星6號(hào)中RA和RD的含量較高，這可能是由于甜葉菊品種的差異所導(dǎo)致的。甜葉菊中ST、RA、RD和RM均由起始底物甜菊醇經(jīng)UGTs（UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，UDPglycosyltransferases）多步糖苷化反應(yīng)而形成，首先形成ST，ST在UGT76G1催化下形成RA，RA在UGT 91D催化下形成RD，RD在UGT76G1催化形成RM[24]。ST含量于112 d升至最高，此后呈現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，而RA、RD和RM在140～154 d時(shí)段含量升至最高；ST、RA、RD和RM在甜葉菊中的動(dòng)態(tài)積累趨勢(shì)與它們的合成規(guī)律相一致。

圖1 甜葉菊葉中SGs HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of SGs in the leaf of Stevia rebaudiana Bertoni

圖2 甜葉菊葉中有效成分和干物質(zhì)動(dòng)態(tài)積累圖Fig.2 Dynamic accumulation charts of effective components and dry matter in the leaf of Stevia rebaudiana Bertoni

甜葉菊譜星6號(hào)所含綠原酸類主要包括3種單咖啡?？鼘幩幔ㄐ戮G原酸、綠原酸、隱綠原酸）和3種二咖啡酰奎寧酸（異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C）（圖3），與郭志龍等[11]和李云聰?shù)萚12]的研究結(jié)果相同；異綠原酸A占比最高為46.14%，其次是異綠原酸C和綠原酸，分別占22.21%和18.16%。在取樣期內(nèi)，甜葉菊中綠原酸類含量呈現(xiàn)降低-升高-穩(wěn)定-降低的變化趨勢(shì)（圖2b），綠原酸類總量介于40.99～73.78 mg/g之間，其中異綠原酸A含量介于19.13～34.04 mg/g之間；異綠原酸C含量介于11.05～19.19 mg/g之間；綠原酸含量介于5.53～13.40 mg/g之間；新綠原酸含量介于2.98～7.94 mg/g之間；異綠原酸B含量介于1.05～1.82 mg/g之間；隱綠原酸含量介于1.22～1.71 mg/g之間。由于1,3-二咖啡酰奎寧酸在取樣期內(nèi)含量較少為0.10～0.20 mg/g，未列入圖中。

圖3 甜葉菊葉中綠原酸類和類黃酮HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of chlorogenic acids and flavonoids in the leaf of Stevia rebaudiana Bertoni

甜葉菊譜星6號(hào)中主要含有9種類黃酮的糖苷衍生物（圖3），其中槲皮素-3-O-鼠李糖苷占比最高，為62.43%；其次是蘆丁，占比為15.25%。在取樣期內(nèi)，類黃酮總量同樣呈現(xiàn)降低-升高-穩(wěn)定-降低的變化趨勢(shì)（圖2c）。類黃酮總量介于11.20～14.88 mg/g，其中槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量介于6.64～9.29 mg/g；蘆丁含量介于1.83～2.29 mg/g；木犀草素-7-O-葡萄糖苷含量介于0.71～1.06 mg/g；山奈酚-3-O-鼠李糖苷含量介于0.55～0.66 mg/g；芹菜素-7-O-葡萄糖苷含量介于0.41～0.62 mg/g；槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量介于0.28～0.53 mg/g；木犀草素-7-O-蕓香糖苷含量介于0.32～0.52 mg/g；槲皮素-3-O-木糖苷含量介于0.18～0.35 mg/g；山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷的含量介于0.05～0.17 mg/g。

譜星6號(hào)綠原酸類和類黃酮含量變化趨勢(shì)的結(jié)果表明，甜葉菊中酚類積累與生長期密切相關(guān)。植物合成次生代謝產(chǎn)物是為了適應(yīng)環(huán)境的需要[25]，當(dāng)甜葉菊苗移栽成活后，應(yīng)立即打頂促進(jìn)側(cè)芽生長以增加分枝和葉片的數(shù)量。為了抵御微生物的侵染、植食性昆蟲及打頂造成的機(jī)械損傷，在70 d甜葉菊中酚類含量已達(dá)較高水平（68.95 mg/g）。從70 d之后，酚類含量呈現(xiàn)下降態(tài)勢(shì)，推測(cè)此時(shí)段初級(jí)代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)活躍，用于合成構(gòu)成細(xì)胞壁的半纖維素、纖維素和果膠等多糖物質(zhì)，因?yàn)楦扇~質(zhì)量從70 d 開始呈現(xiàn)增加趨勢(shì)（圖2d），在84～98 d時(shí)段維持在穩(wěn)定水平，而酚類含量在98 d降至最低。從98 d開始，干葉質(zhì)量和酚類含量快速增加，推測(cè)與木質(zhì)素合成相關(guān)酶的基因表達(dá)變化密切相關(guān)。木質(zhì)素是細(xì)胞次生壁主要組成成分，占生物量的25%～30%，以維持細(xì)胞一定機(jī)械強(qiáng)度[25]。木質(zhì)素、綠原酸和類黃酮均為苯丙素生物合成途徑的產(chǎn)物，為了合成木質(zhì)素，該途徑上游的催化酶例如苯丙氨酸解氨酶基因表達(dá)上調(diào)為下游分支途徑上綠原酸、類黃酮和木質(zhì)素等的合成提供大量的底物，從而導(dǎo)致三者在126～154 d時(shí)段內(nèi)積累達(dá)到最高量。因此，新疆巴州甜葉菊適宜的采收期在9月中旬至10月初時(shí)段。

研究表明，氮肥能夠促進(jìn)甜葉菊葉干物質(zhì)、SGs和酚類積累[1,26]，機(jī)械損傷亦能夠刺激植物酚類的合成[27]。8月中旬之后，干葉質(zhì)量和酚類含量快速增加，此時(shí)需給甜葉菊追肥，適當(dāng)增加氮肥的量；同時(shí)在甜葉菊的栽培過程中可以適當(dāng)增加打頂?shù)拇螖?shù)。當(dāng)前企業(yè)按照含水量＜10%、泥沙和枝條等雜質(zhì)含量＜10%、總糖苷含量＞13%的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收購甜葉菊干葉，本研究建議將綠原酸類含量納入企業(yè)收購干葉標(biāo)準(zhǔn)中。

2.2 甜葉菊水提液澄清工藝初探

2.2.1 不同溫度對(duì)甜葉菊中指標(biāo)成分浸提效率的影響 國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)通常采用常溫水浸提甜葉菊葉中的SGs，從表1可知，25 ℃水提液中RA、ST和RC的含量已達(dá)到85 ℃水提液中RA、ST和RC的含量的60%，但6種綠原酸類化合物的含量較低，表明低溫狀態(tài)下，綠原酸類化合物的浸提效率不高。隨著浸提溫度的升高，新綠原酸、綠原酸及隱綠原酸的含量逐漸增加，異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的含量也顯著增加（P＜0.05）。提高溫度可以增加甜葉菊中有效成分的浸出率，但相應(yīng)地增加了蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的溶出[28]。考慮生物活性成分在高溫下易變性失活的特性[29]，因此選擇在65 ℃條件對(duì)甜葉菊葉進(jìn)行水浸提。

表1 不同溫度水提液中指標(biāo)成分的含量Table 1 Contents of indicative components in water extract under different temperatures

2.2.2 不同絮凝劑對(duì)甜葉菊水提液澄清效果的影響從表2可知，SGs工業(yè)化生產(chǎn)中采用硫酸亞鐵和氫氧化鈣絮凝的澄清液淡黃清亮，澄清效果最好，但綠原酸類在澄清液中基本無保留。額爾敦巴雅爾等[30]的研究顯示采用硫酸亞鐵+氫氧化鈣絮凝方法去除甜葉菊水提液中綠原酸類和類黃酮物質(zhì)效果較為顯著，而趙磊等[17]的研究顯示甜葉菊絮凝廢渣中富含綠原酸和類黃酮化合物。因此，硫酸亞鐵+氫氧化鈣不適合作為從甜葉菊水提液中進(jìn)一步提取分離綠原酸類的絮凝劑。聚合氯化鋁屬于無機(jī)高分子絮凝劑，具有較高的電荷密度，通過電性中和及吸附橋架交聯(lián)作用促使膠體微粒絮凝沉淀[31]。白色聚合氯化鋁絮凝的澄清液中RA和ST的保留率較高，但RC和6種綠原酸類的保留率低；黃色聚合氯化鋁的澄清率雖然高于白色聚合氯化鋁的澄清率，但RA、ST和綠原酸類的保留率更低，尤其是異綠原酸基本無保留。殼聚糖作為陽離子線性高分子絮凝劑，通過螯合、電中和與吸附架橋作用除去植物浸提液中大量雜質(zhì)[16]。盡管RA、ST和RC在殼聚糖季銨鹽絮凝處理的澄清液中全部保留，但異綠原酸損失率較大；殼聚糖鹽酸鹽的澄清效果優(yōu)于殼聚糖季銨鹽的澄清效果，盡管ST和RC有一定的損失，6種綠原酸類基本保留在澄清液中。甜葉菊水提液pH為5.82，加入聚合氯化鋁和硫酸亞鐵+氫氧化鈣均使水提液pH產(chǎn)生較大變化。因此，選擇殼聚糖鹽酸鹽作為甜葉菊水提液的最適絮凝劑。

表2 25 ℃條件下不同絮凝劑對(duì)水提液的澄清效果Table 2 Clarification effects of different flocculants on water extract under 25 ℃

2.2.3 殼聚糖鹽酸鹽投加量對(duì)澄清效果的影響 從表3可知，25 ℃條件下，隨著絮凝劑加入量的增大，水提液的澄清率逐漸增加，當(dāng)添加量超過0.55 g/L時(shí)，雖有絮狀沉淀，但水提液由澄清變?yōu)椴煌该鳡顟B(tài)。這是因?yàn)檫^量的絮凝劑使膠粒表面發(fā)生二次吸附而覆蓋了一層絮凝劑，膠粒處于再穩(wěn)定狀態(tài)，溶液變渾濁[16]。因此，綜合考慮澄清效果和生產(chǎn)成本等因素，選擇殼聚糖鹽酸鹽的合適投加量為0.45 g/L。

表3 25 ℃條件下殼聚糖鹽酸鹽的投加量對(duì)澄清效果的影響Table 3 Effects of different dosages of chitosan hydrochloride on clarification rate under 25 ℃

2.2.4 體系溫度對(duì)殼聚糖鹽酸鹽澄清效果的影響由表4可知，當(dāng)水浴溫度低于55 ℃時(shí)，水提液中的雜質(zhì)微粒與絮凝劑分子相互碰撞的幾率增大，加速了絮凝沉淀的過程[16]，因此，在45 ℃條件下，當(dāng)加入絮凝劑攪拌2 min左右時(shí)，水提液出現(xiàn)明顯的絮狀沉淀且液體呈清亮狀態(tài)，澄清效果與硫酸亞鐵+氫氧化鈣組合的效果相當(dāng)；當(dāng)溫度升至55 ℃時(shí)，殼聚糖鹽酸鹽分子發(fā)生老化[16]，澄清率開始下降，65 ℃條件下水提液底部雖出現(xiàn)絮狀沉淀，但靜置30 min后液體仍呈渾濁狀態(tài)。因此，澄清操作溫度選擇在45 ℃左右為宜。

表4 體系溫度對(duì)殼聚糖鹽酸鹽澄清效果的影響Table 4 Effects of different flocculation temperatures of chitosan hydrochloride on clarification rate

3 結(jié)論

以甜葉菊葉為材料，測(cè)定了不同生長期甜葉菊中SGs、綠原酸類、類黃酮三類有效成分的含量。分析結(jié)果表明，各種糖苷以及總糖苷含量變化幅度??；甜葉菊中綠原酸類和類黃酮總量呈現(xiàn)降低-升高-穩(wěn)定-降低的變化趨勢(shì)，于126 d達(dá)到最高值后趨于穩(wěn)定。結(jié)合三類有效成分含量和產(chǎn)量因素分析，確定新疆巴州甜葉菊譜星6號(hào)葉采收的最佳時(shí)期為9月中旬～10月初。在甜葉菊的栽培過程中，可以適當(dāng)增加氮肥施量和打頂次數(shù)，以促進(jìn)葉中有效成分和生物量的積累。

以澄清率和水提液中RA、ST、RC、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C含量的保留率為考察指標(biāo)，采用不同的絮凝劑對(duì)甜葉菊水提液進(jìn)行澄清處理。研究結(jié)果表明，以殼聚糖鹽酸鹽絮凝處理的澄清液中，3種糖苷和6種綠原酸類物質(zhì)的保留率高，有利于后續(xù)工藝中大孔吸附樹脂分別從澄清液中選擇性吸附SGs和綠原酸類。溫度為45 ℃、殼聚糖鹽酸鹽的添加量為0.45 g/L的絮凝條件下，水提液的澄清效果與硫酸亞鐵+氫氧化鈣絮凝處理的澄清效果相當(dāng)。本研究為甜葉菊進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)。