響應(yīng)面優(yōu)化蒲公英橡膠草菊糖提取工藝及其MALDI-TOF MS分析

陳江艷，王維滔，董益陽, ，張繼川 ，胡孔新，馬 強(qiáng)

（1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100029；2.北京化工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院, 北京100029；3.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)檢所, 北京100176；4.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院工業(yè)品所, 北京100176）

菊糖，別名菊粉、土木香粉，是由D-呋喃果糖經(jīng)β-2,1-糖苷鍵聚合而成的鏈狀多糖[1]，末端為葡萄糖殘基, 聚合度（DP）范圍為2～60, 平均在10～12左右[2]。菊糖在自然界中廣泛存在，主要以儲備多糖的形式存在于多種植物中[3]，如雪蓮果塊莖、婆羅門參、大麗花、菊芋、菊苣等[4]。菊糖不僅具有獨(dú)特的凝膠特性和類似脂肪的口感[5]，還具有降糖降脂、預(yù)防癌癥[6]、調(diào)節(jié)腸道環(huán)境、促進(jìn)益生菌增殖、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收[7]等多種生理功能[8-9]，在食品領(lǐng)域主要用于生產(chǎn)高純度果糖、低脂食品、膳食纖維、糕點(diǎn)和甜食面團(tuán)的品質(zhì)改良劑等[10]。

橡膠草，又名俄羅斯蒲公英，為菊科蒲公英屬大角蒲公英組多年生草本植物[11]，橡膠草不僅可以合成天然橡膠，還可以合成大量的碳水化合物菊糖[12]，主要儲存在韌皮部附近的根細(xì)胞液泡中[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于蒲公英橡膠草的研究主要集中在橡膠的提取、定量、結(jié)構(gòu)表征等方面[14-15]，對于蒲公英橡膠草中菊糖的提取及結(jié)構(gòu)表征的研究未見報道。工業(yè)上多采用熱水浸提法從菊芋、菊苣中提取菊糖[16-17]，關(guān)于蒲公英橡膠草菊糖的提取優(yōu)化研究較少，其分子質(zhì)量及聚合度分布等研究也有待進(jìn)一步深入。本研究擬對蒲公英橡膠草菊糖的提取及分離純化工藝進(jìn)行研究，為蒲公英橡膠草的綜合開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲公英橡膠草 市售；考馬斯亮藍(lán)G-250 北京科華經(jīng)緯科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 北京化工廠；無水亞硫酸鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；濃硫酸、苯酚、四水酒石酸鉀鈉、乙醇 均為分析純。

Autoflex speed MALDI-TOF 布魯克（北京）科技有限公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BT-25S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SIGMA-3K15型離心機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；DZF-150型真空干燥箱 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；NanoDrop 2000C分光光度計 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菊糖提取工藝 蒲公英橡膠草根→洗凈→烘干→粉碎→超聲提取→離心→除蛋白→抽濾→脫色→旋蒸濃縮→醇沉（4～5次）→冷凍干燥→菊糖成品[18]。

將蒲公英橡膠草根洗凈后60 ℃烘干粉碎，取一定量的蒲公英橡膠草粉末于50 mL離心管中，加入一定量的去離子水，在一定的溫度、時間及功率下進(jìn)行超聲提取，隨后在8000 r/min條件下離心5 min，取上清液進(jìn)行純化（純化方法的選擇見1.2.6），純化后采用抽濾的方式除去沉淀，將所得的濾液采用大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色，控制流速為1 mL/min，收集流出液并定容后取樣在420 nm處測吸光度并計算其脫色效果[19]。將脫色后的菊糖提取液于60 ℃旋蒸濃縮至微量，然后加入4倍體積無水乙醇，于4 ℃冰箱靜置20 min后離心（8000 r/min，10 min），沉淀留存，將上清液再次進(jìn)行濃縮和醇沉[20]，反復(fù)沉淀4～5次直至無沉淀產(chǎn)生。將所得沉淀物在-20 ℃預(yù)凍12 h后，冷凍干燥約3 h得白色固體粉末狀菊糖成品。

1.2.2 菊糖單因素實(shí)驗(yàn) 采用控制變量法，分別探究超聲功率、液料比、超聲溫度、超聲時間對菊糖提取率的影響[21]。

1.2.2.1 超聲功率對菊糖提取率的影響 選取溫度：60 ℃[22]，時間：20 min，液料比：20:1 mL/g，分別在功率：120、180、240、300 W進(jìn)行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行菊糖含量測定，探究超聲功率與菊糖提取率的關(guān)系。

1.2.2.2 液料比對菊糖提取率的影響 選取溫度：60 ℃，時間：20 min，功率：240 W，分別在液料比：10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g進(jìn)行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行菊糖含量測定，探究液料比與菊糖提取率的關(guān)系。

1.2.2.3 超聲溫度對菊糖提取率的影響 選取時間：20 min，功率：240 W，液料比：20:1 mL/g，分別在溫度：40、50、60、70、75 ℃進(jìn)行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行菊糖含量測定，探究超聲溫度與菊糖提取率的關(guān)系。

1.2.2.4 超聲時間對菊糖提取率的影響 選取超聲溫度：60 ℃，功率：240 W，液料比：20:1 mL/g，分別在超聲時間：10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行超聲提取，8000 r/min離心5 min后取上清液進(jìn)行菊糖含量測定，探究超聲時間與菊糖提取率的關(guān)系。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，分別以液料比（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）、超聲時間（D）為考察因素，設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，全部試驗(yàn)共計29組，其中設(shè)置為5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用以估計試驗(yàn)誤差，設(shè)計結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.4 菊糖提取率及含量的測定 采用苯酚硫酸法在490 nm波長處測定吸光度[23]，代入總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程y=7.1083x-0.0253，R2=0.9987）計算出總糖含量；采用DNS法在540 nm波長處測定吸光度[24]，代入還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（回歸方程y=1.4987x-0.0451，R2=0.9988）計算出還原糖含量；分別利用公式（1）和（2）計算出菊糖提取率和菊糖含量[16]。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)，以牛血清白蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在595 nm處測定吸光度[25]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=5.1325x+0.1027，R2=0.9983），根據(jù)標(biāo)曲計算出菊糖提取液中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)公式（3）計算出菊糖損失率，根據(jù)公式（4）計算蛋白質(zhì)清除率。

1.2.6 菊糖純化方法的選擇

1.2.6.1 氫氧化鈣-磷酸法 工業(yè)上常用氫氧化鈣-磷酸法[26]進(jìn)行純化，取一定量的菊糖粗提液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Ca（OH）2溶液，使溶液pH為12[27]，在80 ℃下，邊加熱邊攪拌20 min，再用20% H3PO4溶液調(diào)節(jié)pH為6，保溫10 min后，4000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行測量。

1.2.6.2 三氯乙酸法 取一定量的菊糖粗提液，加入12.5 mL 9%的三氯乙酸，攪拌20 min后，靜置30 min[28]，待溶液不再渾濁后，5000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行測量。

1.2.6.3 Sevage法 Sevage試劑的配制：氯仿：正丁醇=4:1[29]。

取一定量的菊糖粗提液，按Sevage試劑：樣液=1:5的比例加入Sevage試劑，劇烈搖晃25 min后離心去掉下層和乳白色的中間層，繼續(xù)對上清液進(jìn)行處理，重復(fù)上述步驟5次，棄去沉淀后取上清液測量蛋白質(zhì)含量及菊糖含量。

1.2.7 MALDI-TOF MS表征 采用WANG等[26]的方法，將菊糖成品溶于0.01 mol/L氯化鉀水溶液混合制成樣品，以DHB作為基質(zhì)，基質(zhì)用乙醇和水混合液（乙醇:水=1:1）配制成10 mg/mL，再將基質(zhì)和樣品按1:1的比例混合進(jìn)行MALDI-MS分析，在線性模式和反射模式下進(jìn)行采集。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測定均設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)，利用Origin 2017進(jìn) 行 數(shù) 據(jù) 繪 制，利 用IBM SPSS Statistics 20對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，利用Design Expert 10.0.7軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英橡膠草菊糖的提取

2.1.1 蒲公英橡膠草菊糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 超聲功率對菊糖提取率的影響 由圖1可知，隨著超聲功率的增加，菊糖提取率先上升后下降，功率從180 W增加到240 W時，菊糖提取率顯著增加（P＜0.05），增加功率到300 W時提取率降低。原因是空化作用會隨著超聲功率的增強(qiáng)而增強(qiáng)，剪切效果也得到了增加，從而導(dǎo)致菊糖分子鏈的斷裂，使得菊糖提取率呈下降趨勢[20]。

圖1 超聲功率對蒲公英橡膠草菊糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extractability of inulin

2.1.1.2 液料比對菊糖提取率的影響 由圖2可知，在10:1～30:1 mL/g的范圍內(nèi)，菊糖提取率隨液料比的增加而顯著增加（P＜0.05），但液料比大于30:1 mL/g后，菊糖提取率隨液料比的減小緩慢降低。原因是液料比較小時，由于溶劑不夠，蒲公英橡膠草中的菊糖不能充分溶出，而液料比過大時，菊糖溶出則需要消耗更多時間和能量，因此菊糖提取率呈下降趨勢[20]。

圖2 液料比對蒲公英橡膠草菊糖提取率的影響Fig.2 Effect of solvent-solid ratio on extractability of inulin

2.1.1.3 超聲溫度對菊糖提取率的影響 由圖3可知，菊糖提取率隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，在50～60℃時，菊糖提取率顯著升高（P＜0.05），增加溫度到75℃時，菊糖提取率顯著降低（P＜0.05）。原因是隨著溫度的增加，樣品中的菊糖開始溶出，但溫度達(dá)到一定值時，菊糖已充分溶出，同時高溫會使菊糖發(fā)生分解，從而導(dǎo)致菊糖提取率的降低[30]。

圖3 超聲溫度對菊糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extractability of inulin

2.1.1.4 超聲時間的影響 由圖4可知，在10～30 min時，隨著超聲時間的增加，菊糖提取率也逐漸升高，超聲時間為30 min時，菊糖提取率達(dá)到最大，可能是因?yàn)槌晻r間不足時，菊糖未能充分溶出，但時間達(dá)到60 min時，提取率顯著下降（P＜0.05），可能是由于提取時間過長，導(dǎo)致菊糖發(fā)生了分解，使菊糖的提取率降低[31]。

圖4 超聲時間對菊糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extractability of inulin

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 利用Design Expert 10對蒲公英橡膠草中菊糖提取率進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。其中1～20為析因?qū)嶒?yàn)，21～25為5個中心實(shí)驗(yàn)[32]。

對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：菊糖提取率=-1.29+1.37×10-3A+2.94×10-3B+0.037C+2.06×10-3D+8.67×10-6AB+7.08×10-5AC-2.13×10-5AD-1.24×10-5BC-9.38×10-6BD+1.29×10-4CD-1.16×10-4A2-4.65×10-6B2-3.32×10-4C2-1.04×10-4D2。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 模型方差分析Table 3 Variance analysis of the model

由表3可知，模型的F值為9.33，P＜0.0001，模型極顯著，失擬項(xiàng)誤差不顯著（P=0.2363＞0.05），說明模型對響應(yīng)值擬合良好。模型決定系數(shù)R2=0.9032，R2Adj=0.8063,說明該模型擬合度良好。通過表中F值的大小可以得出各因素對蒲公英橡膠草菊糖提取率影響的大小為：C（超聲溫度）＞B（超聲功率）＞D（超聲時間）＞A（液料比）。

2.1.2.2 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化與分析 以提取率的回歸方程為依據(jù)，獲得了菊糖提取的響應(yīng)面圖和等高線圖，通過控制其中兩個因素不變，探究另外兩個交互因素與提取率之間的關(guān)系。

分析圖5～圖10，可看出超聲功率、液料比、超聲溫度與超聲時間四因素間的響應(yīng)曲面均為凸面且曲面均較為陡峭，說明四因素之間的交互作用對菊糖提取率的影響明顯。

圖5 超聲功率（B）和液料比（A）的交互作用Fig.5 The interaction of ultrasonic power and liquid-solid ratio

圖10 超聲時間（D）和超聲溫度（C）的交互作用Fig.10 The interaction of ultrasonic time and ultrasonic temperature

2.1.2.3 提取參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design Expert10軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，得到模型的最優(yōu)參數(shù)為液料比（mL/g）=29.87:1，超聲功率229.25 W，提取溫度60.54 ℃，提取時間33.98 min，在此條件參數(shù)下，模型預(yù)測提取率為20.23%。為了實(shí)驗(yàn)操作方便，將上述所得條件參數(shù)修正為液料比=30:1（mL/g）、功率：230 W、溫度：61 ℃、時間：34 min。在此條件下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)際提取率為20.14%±0.19%，與理論預(yù)測值非常接近，說明優(yōu)化后結(jié)果可靠。

圖6 超聲溫度（C）和液料比（A）的交互作用Fig.6 The interaction of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio

圖7 超聲時間（D）和液料比（A）的交互作用Fig.7 The interaction of ultrasonic time and liquid-solid ratio

圖8 超聲溫度（C）和超聲功率（B）的交互作用Fig.8 The interaction of ultrasonic temperature and ultrasonic power

圖9 超聲時間（D）和超聲功率（B）的交互作用Fig.9 The interaction of ultrasonic time and ultrasonic power

2.2 蒲公英橡膠草菊糖的純化

采用三種方法脫蛋白的結(jié)果見表4，根據(jù)蛋白清除率及菊糖損失率進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈣-磷酸法為最佳純化方法。

表4 菊糖脫蛋白所用的方法比較Table 4 Comparative study on methods of deproteinization of inulin

2.3 菊糖產(chǎn)品

將純化后的提取液通過大孔樹脂清除色素后[33]，檢測計算得出：脫色率：66.65%，菊糖損失率：16.83%，蛋白清除率：59.27%。將脫蛋白后的菊糖提取液經(jīng)大孔吸附樹脂脫色、旋蒸濃縮后醇沉5次，再經(jīng)過冷凍干燥得到白色固體粉末狀菊糖成品（圖11）。經(jīng)檢測，成品中菊糖含量為80.8%。

圖11 菊糖Fig.11 Inulin

2.4 MALDI-TOF MS表征結(jié)果

分別對菊糖樣品進(jìn)行了反射模式和線性模式采集，并對反射模式下的兩個分子量為1029和867的聚糖進(jìn)行二級圖譜分析，見圖12～圖15，在所設(shè)條件下,可以檢測到聚合度范圍為2～30，初步確定單體的分子量為162，為一個果糖脫去一分子水的分子量，端基的分子量和為179，與菊糖分子結(jié)構(gòu)信息相吻合[34]，如需進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)組成及聚合度，需要對菊糖進(jìn)行不同聚合度分離處理。

圖12 反射模式（900～4500）下菊糖的MALDI-TOF譜圖Fig.12 MALDI-TOF spectra of inulin in reflective mode（900～4500）

圖13 線性模式（2000～20000）下菊糖的MALDI-TOF譜圖Fig.13 MALDI-TOF spectra of inulin in linear model（2000～20000）

圖14 m/z=1029的二級質(zhì)譜圖Fig.14 MS/MS of m/z=1029

圖15 m/z=867的二級質(zhì)譜圖Fig.15 MS/MS of m/z=867

3 結(jié)論

以蒲公英橡膠草干根為菊糖提取原材料，采用超聲波法對蒲公英橡膠草根菊糖進(jìn)行提取；不僅分析了蒲公英橡膠草菊糖的提取、提純等工藝過程，還討論分析了超聲功率、超聲時間、超聲溫度和液料比對菊糖提取率的影響?；趩我蛩貙?shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行了響應(yīng)面試驗(yàn)，得到菊糖提取的最佳工藝條件：液料比（mL/g）=30:1、功率：230 W、溫度：61℃、時間：34 min，在此條件下，模型預(yù)測的菊糖提取率為20.23%，實(shí)際菊糖提取率為20.14%±0.19%，與預(yù)測值相比，相對誤差僅為0.45%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。經(jīng)超聲提取后的菊糖粗提液里面還含有大量雜質(zhì)，需經(jīng)純化除去，因此，本研究分別采用了三氯乙酸法、Sevage法、氫氧化鈣-磷酸法對菊糖粗提液進(jìn)行純化。根據(jù)純化后溶液的菊糖損失率及蛋白清除率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈣-磷酸法是最佳的純化方法，其蛋白清除率可達(dá)90.78%，菊糖損失率為26.44%。提取的成品中菊糖含量達(dá)80.8%，經(jīng)MALDI-TOF MS進(jìn)行分析，其雜質(zhì)較少，在所設(shè)條件下，單體的分子量為162，端基的分子量和為179，聚合度在2～30。

本研究為蒲公英橡膠草的進(jìn)一步綜合利用提供理論依據(jù)，為天然高分子聚合物相對分子質(zhì)量的測定提供參考，并為菊糖進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)，具有一定的指導(dǎo)價值和實(shí)踐意義。