響應面法優(yōu)化熏干草果油樹脂提取工藝及成分分析

林 毅，黃 梅，吳桂蘋 ，徐 飛，和俊才，友勝軍，高鵬慧，劉霖娜，侯梅芳 ，谷風林

（1.上海應用技術大學, 生態(tài)技術與工程學院, 上海 201418；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院香料飲料研究所, 海南萬寧 571533；3.海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質控制重點實驗室, 海南萬寧 571533；4.寧夏大學食品與葡萄酒學院, 寧夏銀川 750021；5.怒江綠色香料產(chǎn)業(yè)研究院, 云南怒江 673200；6.怒江州農(nóng)村科技與生產(chǎn)力促進中心, 云南怒江673200）

草果（Amomum tsaokoCrevost et Lemarie），姜科豆蔻屬多年生草本植物，又稱草果子、草果仁[1]，主要分布于我國的云南、廣西、貴州等地區(qū)，種植范圍達到全國90%以上[2]。在《本草品匯精要》中記載，草果形狀猶如橄欖，皮較薄且顏色為紫色，果仁和縮砂仁相似，全株具有辛香氣，喜在陰蔽、潮濕、土壤肥沃的環(huán)境中生長[3]。草果主要作為香辛料調味品，屬于藥食同源，不僅可以去除肉食腥、膻味，增加食品的香氣風味，還兼具調節(jié)胃腸功能、降脂減肥、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、防霉和抗炎鎮(zhèn)痛等功效[4]。熏干草果（SDAT）主要是以成熟草果鮮果為原料，對草果鮮果淋噴后采用傳統(tǒng)柴火加熱房烘干[5]，得到表面黑紅色SDAT。制備SDAT油樹脂，其風味和香氣成分要高于SDAT原料，并且SDAT油樹脂包含了草果揮發(fā)油，且香氣比揮發(fā)油更加豐富，又含有不易揮發(fā)的色素等成分[6]，使用范圍比揮發(fā)油廣。

近些年，隨著草果產(chǎn)量的增大，其貯藏和運輸成本不斷增加，因此，將草果鮮果采用熏干的處理方式進行加工干燥，以便于貯藏和運輸草果，從而降低草果生產(chǎn)成本。同時熏干的加工方式也會對草果化學成分的種類及含量產(chǎn)生不同的影響，有助于增加草果的香氣風味。胡智慧等[6]研究表明，在熏干處理中，草果的化學成分的種類及含量比鮮果高。因此，人們對不同香辛料植物的油樹脂進行提取，但尚未見直接以熏干處理后的草果為原料提取油樹脂的研究報道。目前，針對油樹脂的報道主要有DEVANI等[7]研究了超臨界二氧化碳萃取洋蔥油樹脂的工藝優(yōu)化。OLUSEGUM等[8]等采用加熱回流法提取辣椒油樹脂的工藝優(yōu)化。吳桂蘋等[9]采用超聲波-微波輔助溶劑對胡椒鮮果油樹脂進行工藝研究。因此，本實驗以SDAT為原料，采用熱回流法提取草果油樹脂，并對其工藝進行響應面優(yōu)化，以及對優(yōu)化后的SDAT油樹脂化合物成分進行分析鑒定，為開發(fā)SDAT附加值產(chǎn)品及深加工產(chǎn)業(yè)升級提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熏干草果原料 購自云南怒江州，采用物料粉碎機將SDAT粉碎成不同粒徑備用；無水甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、無水硫酸鈉 均為分析純。

YF-1000物料粉碎機 瑞安市永利制藥機械有限公司；ME4002E電子天平 上海梅特勒－托利多儀器有限公司；SHZ-D真空抽濾裝置 鞏義予華儀器有限責任公司；RV10 D S25高效旋轉蒸發(fā)儀 廣州儀科科技有限公司；7890B-LECO氣相色譜-飛行時間質譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 整粒熏干草果粉碎過篩，測得水分含量為11.7%，分別收集20、40、60、80目數(shù)的粉末樣品待測。

1.2.2 油樹脂提取工藝 參照包振偉等[10]方法，并稍作修改，精密稱取20.00 g的SDAT粉末樣品，置于圓底燒瓶中，進行熱回流實驗，然后進行過濾，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，直至不再有溶劑旋蒸出為止，然后冷卻稱其質量并計算得率。每組實驗平行三次。以SDAT油樹脂得率為考察指標，進行工藝優(yōu)化。油樹脂得率的計算公式：

油樹脂得率（%）=SDAT油樹脂質量（g）／SDAT粉末質量（g）×100

1.2.3 單因素實驗 通過單因素實驗，考察提取溶劑、提取溫度、料液比，提取時間、細度五個因素對SDAT油樹脂提取得率的影響。提取條件：保持提取溫度65 ℃，料液比為1:10 g/mL、提取時間為3 h、細度為20目的條件不變，比較不同提取溶劑（無水甲醇、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚和正己烷）對熏干草果油樹脂得率的影響。保持提取溫度為無水甲醇、料液比為1:10 g/mL、提取時間為3 h、細度為20目的條件不變，比較不同提取溫度（65、70、75和80 ℃）對熏干草果油樹脂得率的影響。保持提取溶劑為無水甲醇、提取溫度為75 ℃，提取時間為3 h、細度為20目的條件不變，比較不同料液比（1:10、1:15、1:20和1:25 g/mL）對熏干草果油樹脂得率的影響。保持提取溶劑為無水甲醇、提取溫度為75 ℃、料液比為1:20 g/mL，比較提取時間（3、5、7和9 h）對熏干草果油樹脂得率的影響。保持提取溶劑為無水甲醇、提取溫度為75 ℃、料液比為1:20 g/mL，提取時間7 h），比較細度（20、40、60和80目）對熏干草果油樹脂得率的影響。根據(jù)以上單因素條件，進行熏干草果油樹脂的提取。

1.2.4 響應面試驗 根據(jù)單因素實驗結果，利用Design Expert 8.0.5軟件進行響應面試驗設計，把SDAT油樹脂的提取溫度、料液比、提取時間作為響應面的三個實驗因素，并且根據(jù)響應面的分析方法，優(yōu)化三因素三水平提取草果油樹脂的工藝，并綜合考慮草果油樹脂得率對草果油樹脂提取工藝的影響，實驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 實驗的因素水平Table 1 Factor and level of Box-Behnken experiment

1.3 SDAT油樹脂風味物質分析鑒定

1.3.1 樣品測定 將SDAT油樹脂用二氯甲烷稀釋50倍，經(jīng)無水硫酸鈉脫除水分，用0.45 μm孔徑尼龍膜過濾于氣相色譜專用小瓶中，用于GC-TOFMS分析。GC-TOF-MS分析條件：參照吳桂蘋等[11]方法，并稍作修改。

1.3.2 GC分析條件 色譜柱為DB-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm，載氣為氦氣，流速為 1.0 mL/min；升溫程序為50 ℃保持 0.2 min，以 4 ℃/min的速率升至90 ℃，以2 ℃/min 的速率升至160 ℃，20 ℃/min的速率升至220 ℃，保持 2 min；進樣口溫度為250 ℃；解析5 min；進樣量1.0 μL，不分流，溶劑延遲360 s。

1.3.3 TOF-MS分析條件 EI離子源，電離能量：70 eV，離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃，質量數(shù)掃描范圍：35～450 m/z，采集速率：10 spec/s，溶劑延遲300 s。通過Mainlib和Replib 譜庫檢索數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法計算各化合物的相對百分比含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel，Origin8.6，SPSS23.0，Design Expert8.0.5軟件處理，通過模型方程的決定系數(shù)R2及方差進行分析判定，統(tǒng)計顯著性和回歸系數(shù)顯著性由F值來檢測，P值取0.05、0.01兩個不同水平。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗分析

2.1.1 不同溶劑對SDAT油樹脂得率的影響 由圖1可知，SDAT中的不同溶劑提取油樹脂得率具有明顯差異，其中，SDAT油樹脂在不同提取溶劑中的提取得率依次為：無水甲醇（6.48%）＞無水乙醇（5.68%）＞丙酮（4.53%）＞乙酸乙酯（4.23%）＞石油醚（1.42%）＞正己烷（1.18%）。當提取溶劑為無水甲醇時，SDAT油樹脂的提取得率最高，其次為無水乙醇。但是，提取溶劑為石油醚和正己烷時，油樹脂的提取得率最低。因為溶劑的極性具有不同的強度，當溶劑的極性越強時，提取物中原料的溶解能力越強，從而導致SDAT油樹脂的提取得率越高，并且極性較強的溶劑更易提取不揮發(fā)性成分。如樹脂、脂肪、抗氧化劑、色素等[12-13]。因此，后續(xù)單因素實驗均選取無水甲醇為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對草果油樹脂得率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent of on the yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.2 提取溫度對SDAT油樹脂得率的影響 由圖2可知，隨著提取溫度的升高，SDAT油樹脂得率呈先增加后緩慢下降的趨勢，當溫度從65 ℃上升到70 ℃時，SDAT油樹脂的提取得率從6.08%上升到7.25%，然后溫度繼續(xù)從75 ℃上升到80 ℃時，SDAT油樹脂的提取得率從7.35%下降至7.28%。當提取溫度為75 ℃時，SDAT油樹脂的得率達到最高。這是因為隨著溫度的初步上升，溶劑流速和傳質速度會隨著溫度升高而增大，導致SDAT粉中物質更易溶于無水甲醇中[14]，從而使SDAT油樹脂得率增加。但是隨著溫度不斷的升高后，油樹脂得率呈下降趨勢。這是因為隨著溫度持續(xù)升高，油樹脂中部分成分由于溫度較高，造成成分揮發(fā)損失[15]，導致SDAT油樹脂得率下降。在實際的生產(chǎn)過程中，應該適當選取提取溫度，因為當溫度過高時，提取溶劑易沸騰，造成一定的安全隱患以及SDAT油樹脂的提取得率下降，因此后續(xù)單因素實驗的選取提取溫度為75 ℃。

圖2 溫度對草果油樹脂得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature ratio on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.3 料液比對草果油樹脂得率的影響 由圖3可知，當SDAT油樹脂的提取溶劑過多或者不足時，都會給提取得率造成一定的影響。料液比對SDAT油樹脂得率存在顯著性影響（P＜0.05）。當料液比增加到1:20 g/mL時，SDAT油樹脂的得率為9.57%，然后繼續(xù)將料液比的體積至1:25 g/mL時，SDAT油樹脂的得率下降至8.98%。結果顯示，隨著料液比的增加，草果的油樹脂乳狀液得率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，料液比為1:20 g/mL時，SDAT油樹脂得率達到最高。由于料液比增大，固體基質到溶劑的傳質速率就會越快[16]。溶劑過少，SDAT粉易在萃取過程中結塊，溶劑無法穿透植物的細胞壁，導致油樹脂得率降低，但是過量溶劑會造成溶劑油樹脂擴散速度減慢，所以，當料液比過高時，主要傳質應該限制在料液比范圍內(nèi)，從而減少溶劑使用率和實驗成本[17]，因此后續(xù)單因素實驗的選取料液比為1:20 （g/mL）。

圖3 料液比對草果油樹脂得率的影響Fig.3 Effects of solid to solvent ratio on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.4 提取時間對草果油樹脂得率的影響 由圖4結果顯示可知，提取時間也是影響SDAT油樹脂得率的重要因素之一，不同提取時間下草果油樹脂的得率存在顯著性差異（P＜0.05）。當提取時間從3～5 h時，SDAT油樹脂的提取得率呈緩慢上升階段，SDAT油樹脂的提取得率從6.20%增加到7.05%。這可能由于SDAT粉表面的快速溶解的結果[18]。當在7 h時，SDAT油樹脂的提取得率達到7.10%，此時得率最高。因為SDAT粉與溶劑充分接觸，油樹脂得率達到最高。當提取時間達到9 h時，其得率為6.40%，隨著繼續(xù)延長提取時間，SDAT油樹脂的提取得率下降，這可能說明SDAT中的成分大多數(shù)已經(jīng)被完全提取，因為提取時間越長，部分油樹脂成分受到破壞，導致成分損失，造成SDAT油樹脂得率提取得率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，選擇最佳的提取時間是可以保證SDAT粉中的成分可以從植物基質中擴散出來，從而避免生物活性物質的降解[19]。所以，因此后續(xù)單因素實驗的選取提取時間為7 h。

圖4 提取時間對草果油樹脂得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.1.5 細度對草果油樹脂得率的影響 由圖5可知，當草果粉的細度在20～40目時，得率最高僅有6.53%，這可能是因為由于草果粉沒有充分粉碎，不利于有效物質提取，從而造成提取得率偏低。隨著細度的增大，SDAT油樹脂的得率不斷增加。在SDAT粉細度達到80目時，SDAT油樹脂得率達到7.55%，此時油樹脂得率最大。原料細度對草果油樹脂得率存在顯著性差異（P＜0.05）。這可能因為原料的細度越大時，提取溶劑可以與提取原料的表面積更加充分的接觸，植物的細胞壁破壞程度就越高，溶劑的穿透能力增大，有效物質更易提取，從而提高油樹脂的得率。由于草果自身硬度較硬，無法粉碎更大粒徑過100目篩。周雪敏等[19]的研究表明,胡椒油樹脂在提取時，隨著粒徑的不斷增大，其油樹脂的得率也在不斷增加，柳中等[20]研究表明，白胡椒油樹脂依然是隨著粒徑的目數(shù)增加，其油樹脂的得率也不斷增加，這和本文的研究一致。所以，因此單因素實驗的選取SDAT粉為80目。

圖5 原料細度對草果油樹脂得率的影響Fig.5 Effects of particle size on yield of Amomum tsaoko oleoresin

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗設計與結果 Box-Benhnken進行三因素三水平的試驗設計，考察提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）對SDAT油樹脂得率的影響，試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken

對回歸方程進行顯著性檢驗分析，結果如表3所示。由表3可以看出，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P=0.0787＞0.05），通過數(shù)據(jù)表明，回歸方程的擬合度較好，模型實驗的誤差不顯著。因此，可以將回歸方程作為油樹脂得率預測與分析的依據(jù)。得到的多元二次回歸模型為：SDAT油樹脂得率=9.43+0.77A-0.38B-0.11C-0.31AB-0.075AC+0.063BC-0.75A2-0.94B2-1.26C2，其 中 模 型 的A、B2、C2為 極顯著(P＜0.0001)，B、A2、AB為顯著(P＜0.05)。由提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）3個影響因素的F值可知，各單因素對草果油樹脂得率影響的大小依次為：A＞B＞C；交互項對草果油樹脂得率影響的大小依次為AB＞AC＞BC。模型中回歸方程的相關系數(shù)R2＝0.9841，說明模型精確度高，可準確地對試驗結果進行預測和分析，變異系數(shù)C.V.%=2.71，表明試驗結果與真實值存在2.71%的偏差，模型可靠性較高。調整系數(shù)R2adj=0.9638，說明通過調整系數(shù)可以較好的解釋96.38%的響應值變化，從而論證了回歸方程的擬合度良好，精確度較高，實驗誤差不顯著，重復性好的優(yōu)點。

2.2.2 各因素間的相互作用 利用 Design Expert 繪制因子間的響應曲面圖，對擬合的響應面形狀進行分析，以及各因素之間的交互作用對SDAT油樹脂得率的影響，其響應曲面見圖6。

2.2.3 SDAT油樹脂的響應面圖分析 在響應面中，最高點就是等高線圖中的最小橢圓的圓心，并且響應面圖中的陡峭形狀反應兩兩因素之間交互作用對響應值的變化情況。當響應面圖的曲面越陡峭，兩兩因素的交互作用就越明顯。相反，當響應面圖的曲面越平緩，兩兩因素的交互作用就越不顯著，等高線的形狀就越趨于橢圓形，表明兩個因素之間交互作用顯著，反之則不顯著[21]。由圖6可知，各圖均開口向下，凸形曲面，都存在極值。AB的交互作用對響應值影響較大，整個曲面陡峭程度較為明顯，等高線的形狀也接近橢圓，從而說明兩兩因素的交互作用較為顯著。由圖6a可知，提取溫度對SDAT油樹脂得率的影響大于料液比；由圖6b可知，提取溫度對SDAT油樹脂得率的影響大于提取時間；由圖6c可知，料液比對SDAT油樹脂得率的影響大于提取時間。因此，各因素影響SDAT油樹脂得率依次為A（提取溫度）＞B（料液比）＞C（提取時間），其結果與方差分析結果相同，證明了該模型可靠性高。

圖6 因素間交互作用對熏干草果油樹脂得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour of interaction effects of factors on smoked Amomum tsaoko

2.2.4 驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6 對回歸方程求解，得出SDAT油樹脂提取最佳條件：提取溫度為76.11 ℃，料液比為21.11 g/mL，提取時間為6.73 h。在此條件下SDAT油樹脂得率的理論值為9.57%?？紤]實際操作可行性，將最佳工藝條件修正為：提取溫度75 ℃，料液比為1:20 g/mL，提取時間7 h。經(jīng)三次平行試驗驗證，SDAT油樹脂平均得率為9.48%，結果與理論值相差不大，由此表明試驗模型可靠，實驗結果理想。

2.3 草果油樹脂的GC-TOF-MS分析

對最佳工藝條件提取SDAT油樹脂進行GCTOF-MS分析，其總離子流圖如圖7所示。經(jīng)質譜工作站檢索、人工譜圖解析，并查對有關質譜圖集資料[22]，鑒定SDAT草果油樹脂中的化學成分，用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，結果如表4所示。

圖7 草果油樹脂揮發(fā)性風味物質GC-TOF-MS總離子流圖Fig.7 The TIC of volatile flavor substances extracted from smok Amomum tsaoko by GC-TOF-MS

由表4可知，采用GC-TOF-MS對草果油樹脂中的香氣成分進行檢測分析，共鑒定出58種香氣成分。主要包括醇類（23種）、醛類（13種）、烯類（4種）、酮類（6種）、酯類（7種）、酚類（5種）。

由表4和圖7可知，草果油樹脂中，醇類占總化合物相對含量的31.59%、醛類占21.13%、烯類占1.23%、酮類占1.56%、酯類占2.38%、酚類占0.79%。其主要化合物成分相對含量最高的有1,8桉葉醇（9.28%）、香葉醇（8.4%）、反式檸檬醛（5.78%）、2-甲基-3-苯基丙醛（6.33%）、α-萜品醇（3.55%）等，相對含量較高的還有順式檸檬醛（2.70%）、α-甲基肉桂醛（1.46%）、順-2-癸醛（1.44%）、橙花醇乙酸酯（1.40%）等。其中大多數(shù)成分可在臨床上用于治療呼吸道疾病以及具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[23-24]。

表4 SDAT油樹脂的化合物成分Table 4 The aroma components of smok Amomum tsaoko oleoresin

3 結論

本研究采用加熱回流提取技術對SDAT油樹脂進行提取，通過不同溶劑提取熏干草果油樹脂，采用響應面試驗對提取時間、料液比、提取溫度三個重要變量進行了工藝優(yōu)化，得到了SDAT油樹脂的最佳提取條件為：提取溫度為75 ℃，料液比為1:20（g/mL），提取時間為7 h，此時SDAT油樹脂得率為9.48%。在最佳的工藝條件下，采用GC-TOF-MS對SDAT油樹脂進行了成分測定。根據(jù)測定結果可知，共鑒定出58種化合物，相對總含量為58.68%。其中醇類化合物（31.59%）和醛類化合物（21.13%）的含量最高，占總化合物的52.72%。并且，在SDAT油樹脂中的醇類、醛類、烯類、酮類、酯類、酚類的化合物之比分別為1:0.67:0.04:0.05:0.08:0.03。其中主要化合物相對含量最高的有1,8桉葉醇、香葉醇、反式檸檬醛、2-甲基-3-苯基丙醛、α-萜品醇，分別之比為1:0.91:0.62:0.68:0.38。提取的油樹脂中1,8桉葉醇相對含量最高為9.28%。因此，根據(jù)SDAT油樹脂的提取工藝及成分研究，可以為后期草果油樹脂的營養(yǎng)成分以及生物活性提供理論依據(jù)，為開發(fā)草果附加值產(chǎn)品及深加工產(chǎn)業(yè)升級奠定理論基礎。

續(xù)表 4