雪地茶甲醇提取物體外抑菌活性及其穩(wěn)定性研究

任國(guó)媛，郭啟新，王 靜，丁海燕,

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 大理大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所, 云南大理 671000；2.大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心, 云南大理 671000）

雪地茶（Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W. Culb.）又名太白茶、石白茶，地茶科地茶屬植物，在云南地區(qū)主要分布于迪慶、麗江、大理蒼山等海拔4000 m以上的高寒地區(qū)，當(dāng)?shù)鼐用癯Ｒ运宸蚺莶栾嬘弥委熤惺?、心煩口渴、肺熱咳嗽、咽喉腫痛、陰虛潮熱、癲癇、失眠、目疾、高血壓等癥[1]。近年來(lái)，雪地茶抗氧化、抗衰老、抗炎、減肥等功效[2-4]逐漸被報(bào)道，其廣泛的生理作用得益于它豐富的代謝產(chǎn)物[5]。雪地茶次生代謝產(chǎn)物來(lái)源于其共生菌，多為水不溶性，主要包括萜類(lèi)、甾醇類(lèi)以及乙酸酯-多聚丙二酸酯途徑形成的蒽醌類(lèi)、縮酚酸類(lèi)及其衍生物等，其中縮酚酸及其衍生物是地衣生物所特有的化學(xué)成分，如壩巴酸、松蘿酸、富馬原島衣酸、扁枝衣二酸等多種地衣酸都被證實(shí)具有良好的抑菌活性[6-9]。前人研究表明，雪地茶中包含甲基苔色酸、雪茶素、4-甲基-2,6-二羥基苯甲醛等19種酚酸、縮酚酸及衍生物[10]，然而其抑菌活性卻無(wú)人探究。隨著人們對(duì)飲食健康的重視，尋找、研究、開(kāi)發(fā)新的毒副作用小的防腐劑已成為目前急需解決的問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)以雪地茶為研究對(duì)象，探究其水和甲醇提取物的抑菌活性及外界環(huán)境因素對(duì)其抑菌穩(wěn)定性的影響，為雪地茶開(kāi)發(fā)成抗菌素和天然防腐劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雪地茶（Thamnolia subuliformis（Ehrh.） W. Culb.）采集于云南省香格里拉地區(qū)，經(jīng)大理大學(xué)生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室張德全副教授進(jìn)行植物學(xué)鑒定后保存于4 ℃冰箱；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus cereusATCC 6633）、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeriCICC 21671）、甲型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi-A BNCC 336664）、乙型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi-B BNCC 103169）、白色念珠菌（Candida albicansATCC 10231）、表面葡萄球菌（Staphylococcus epidermidisATCC 12228）、伊氏李斯特氏菌（Listeria monocytogenesCICC 21663）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenesCMCC 21633）、大腸埃希菌（Escherichia coliCMCC（B）441027）、福氏志賀菌（ShigellaflexneriCMCC 21534）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniaeATCC 4352）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosaATCC 27853）、酵母菌（SaccharomycesBNCC 142268） 由大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心提供；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯等常規(guī)試劑 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

T6新世紀(jì)型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Scientz-ND型系列冷凍干燥機(jī)、SB-5200DTDN型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；VS-1300L-U型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)泰安公司制造；GHP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、DKZ-3型震蕩水槽、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GZX-9160MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ZW20S19W型紫外燈 江陰市飛揚(yáng)器械有限公司；4500Qtrap型質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司；Ultimate3000型超高效液相色譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雪地茶提取物體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 雪地茶提取物的制備 雪地茶甲醇提取物的制備：參考汪瓊等[11]的方法加以修改。雪地茶清洗經(jīng)過(guò)鼓風(fēng)干燥機(jī)50 ℃烘10 h后干燥至樣品變脆后粉碎，過(guò)60目篩。按照料液比1:10 g/mL加入75%甲醇溶液，超聲浸提30 min后抽濾，重復(fù)浸提后收集上清液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL后-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h（冷阱溫度降到-25 ℃，真空度設(shè)置為50 Pa）成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

雪地茶甲醇分級(jí)提取物的制備：參考鄧云霞等[12]的方法加以修改。將兩次超聲提取的甲醇提取物上清液減壓濃縮至一定體積，使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積分別萃取，直至萃取劑無(wú)色。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL后-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h（冷阱溫度降到-25 ℃，真空度設(shè)置為50 Pa）成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

雪地茶水提物的制備：參考付長(zhǎng)華[13]的方法加以修改。取過(guò)60目篩粉碎好的雪地茶粉末，按料液比1:10 g/mL加入蒸餾水，80 ℃水浴浸提30 min，抽濾，重復(fù)浸提后收集上清液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL后置于-20 ℃冷凍3 h成固體，真空冷凍干燥12 h成粉末，置于-20 ℃冰箱避光密封保存。

1.2.1.2 雪地茶提取物體外抑菌活性 采用平板打孔法[14]探究雪地茶提取物的體外抑菌活性，甲醇提取物使用甲醇進(jìn)行溶解，水提物使用無(wú)菌水溶解。刮取斜面保存菌體于無(wú)菌蒸餾水中，采用麥?zhǔn)媳葷岱ǎ褂脽o(wú)菌水調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL備用。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和106CFU/mL的菌液，按每20 mL培養(yǎng)基中加入1 mL菌液比例混勻。用100 μL的槍頭在凝固的瓊脂上打孔，挑出孔內(nèi)的瓊脂，每個(gè)孔中加入20 μL的100 mg/mL雪地茶提取物，陽(yáng)性對(duì)照使用5 mg/mL的左氧氟沙星，陰性對(duì)照為水和甲醇。每組設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，4 ℃擴(kuò)散2 h后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h觀(guān)察抑菌圈的形成。參考LI等[15]的研究對(duì)雪地茶抑菌活性進(jìn)行判斷：抑菌圈直徑大于6 mm判斷為有抑菌活性，小于等于6 mm為無(wú)抑菌活性；3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均達(dá)到有抑菌活性結(jié)果者判為合格；陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌圈，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。抑菌圈直徑大于6 mm小于8 mm為低度敏感；大于8 mm小于14 mm為中度敏感；大于14 mm小于20 mm為高度敏感；大于20 mm為極度敏感。

1.2.2 雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

1.2.2.1 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）的測(cè)定 采用二倍稀釋法[16]，將20 mg甲醇提取物用3%二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO） 0.06 mL復(fù)溶制成待測(cè)液，用無(wú)菌LB肉湯稀釋樣品至一定濃度梯度（10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020 mg/mL）。不同濃度樣品接種2% （V/V）活化后的菌液（106CFU/mL），置于37 ℃110 r/min的恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)24 h，以加入等體積的3% DMSO代替提取物作為空白對(duì)照。

1.2.2.2 雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響 從斜面上刮取菌體，接種到5 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 110 r/min振蕩培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，稀釋到106CFU/mL?？傮w積為30 mL，對(duì)照組為3% DMSO，實(shí)驗(yàn)組為MIC（提取物的終濃度為0.625 mg/mL）和2 MIC（提取物的終濃度為1.250 mg/mL），迅速混勻置于37 ℃靜置培養(yǎng)。雪地茶提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)選擇0、2、4、6、8、10、12、14、24、26、28、30、33 h等13個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以加入等體積的3% DMSO代替提取物作為空白對(duì)照，每組設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn)，采用分光光度計(jì)600 nm檢測(cè)雪地茶提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響[17]。繪制吸光度-時(shí)間曲線(xiàn)，從而獲得金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的變化趨勢(shì)。

1.2.3 雪地茶抑菌活性的穩(wěn)定性探究實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 溫度對(duì)雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響參考YIN等[18]的方法并進(jìn)行一定修改。將雪地茶甲醇提取物100 mg/mL原液分別在室溫（對(duì)照組，18 ℃）、40、60、80、100 ℃的水浴中處理30 min，采用1.2.1.2方法測(cè)定體外抑菌活性。

1.2.3.2 pH對(duì)雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響參考ZANGENEH等[19]的方法并進(jìn)行一定的修改。分別用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH將雪地茶提取物100 mg/mL原液的pH調(diào)整為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，以未調(diào)節(jié)pH的提取物為對(duì)照（pH4.83），采用1.2.1.2方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.3.3 短波紫外線(xiàn)對(duì)雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響 參照劉海燕等[20]的方法進(jìn)行一定修改。將雪地茶甲醇提取物100 mg/mL原液置于紫外燈下（20 W，紫外燈距樣品25 cm）分別照射10、20、30、40、50 min，以未進(jìn)行照射的提取物為對(duì)照，采用1.2.1.2方法測(cè)定抑菌活性。

1.2.4 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸含量的測(cè)定

1.2.4.1 松蘿酸標(biāo)品和樣品的制備 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：精密稱(chēng)取松蘿酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0500 g，用50%甲醇水定容50 mL，得到濃度1000 μg/mL儲(chǔ)備液，用50%甲醇水分別稀釋成2、5、10、25、50、100、200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=54121.4x-14121.9 （r=0.99966）。

樣品的制備：稱(chēng)取樣品10.000 mg，用10%甲醇水定容至100 mL，再稀釋10倍得到待測(cè)液。

1.2.4.2 液相條件和質(zhì)譜條件 超高效液質(zhì)聯(lián)用法（Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS）條件：色譜柱Waters Acquility UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）,流動(dòng)相A：水；B：甲醇；洗脫程序（以流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)表示）：0～0.5 min，10%；0.5～2 min，10%～30%；2～7 min，30%～95%；7～9 min，95%；9～20 min，10%，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5.0 μL，柱溫40 ℃。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-）；離子噴霧電壓（Ionspray voltage）：-4500 V；氣簾氣（Curtain gas）：30 L/h；碰 撞 氣（Collision Gas）：Medium；脫溶劑溫度：550 ℃；霧化氣1（Ion Source Gas1）：50 L/h[21]。其他見(jiàn)表1。

表1 松蘿酸的UPLC-MS/MS測(cè)定參數(shù)Table 1 Determination parameters of usnic acid by UPLC-MS/MS

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 8.0和SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，P＜0.01表明具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪地茶水提物和甲醇提取物的抑菌活性

本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，探究雪地茶水提物和甲醇提取物的抑菌活性，如圖1所示，雪地茶水提物對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)明顯抑菌作用，而甲醇提取物則呈現(xiàn)出一定的抑菌作用。結(jié)果表明雪地茶的主要抑菌成分溶于有機(jī)溶劑甲醇，在水中的溶解度較小，這一結(jié)果與KOSANI?MARIJANA[22]、房敏峰等[23]研究結(jié)果一致，證實(shí)地衣類(lèi)植物的多數(shù)抑菌成分難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。同時(shí)，汪瓊等[11]對(duì)雪地茶甲醇提取物的成分組成進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)其甲醇提取物中含有鱗片衣酸、壩巴酸、松蘿酸等物質(zhì)，這些具有抗菌活性的地衣酸類(lèi)物質(zhì)均易溶于有機(jī)溶劑而不溶于水[24]，進(jìn)一步佐證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖2可知將雪地茶甲醇提取物進(jìn)一步使用不同極性有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取物的抑菌圈較大（17.2 mm），石油醚相無(wú)抑菌圈，正丁醇相有抑菌圈但相對(duì)較小（10.4 mm），因此推斷甲醇提取物中的抑菌成分基本鎖定在乙酸乙酯相中。

圖1 雪地茶提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of Thamnolia subuliformis extract on Staphylococcus aureus

圖2 不同有機(jī)溶劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of different organic solvent extracts on Staphylococcus aureus

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了雪地茶甲醇提取物對(duì)多種致病性革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、斯氏李斯特菌、表面葡萄球菌、伊氏李斯特氏菌、單增李斯特菌）、革蘭氏陰性菌（甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌）以及真菌（白色念珠菌、酵母菌）的抑菌活性，結(jié)果如表2所示，單增李斯特菌、大腸埃希菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、酵母菌無(wú)抑菌效果，6種致病性細(xì)菌對(duì)雪地茶甲醇提取物高度敏感（抑菌圈直徑大于14 mm小于20 mm），且其敏感性排序?yàn)椋航瘘S色葡萄球菌＞伊氏李斯特氏菌＞乙型副傷寒桿菌＞枯草芽孢桿菌＞斯氏李斯特菌＞甲型副傷寒桿菌，表面葡萄球菌、白色念珠菌為極度敏感（抑菌圈直徑＞20 mm），說(shuō)明雪地茶甲醇提取物具有較為廣泛的廣譜抑菌效果，具有可開(kāi)發(fā)為廣譜抑菌藥物和天然防腐劑的潛力。目前對(duì)地衣活性抑菌物質(zhì)的抑菌機(jī)制研究較為深入的是松蘿酸，被證實(shí)可通過(guò)破壞致病微生物包膜物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能、抑制其大分子生命物質(zhì)的合成、抑制其正常的生理代謝等方面抑制病原微生物的生長(zhǎng)和繁殖[25]。松蘿酸可以通過(guò)改變耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞膜通透性，干擾其蛋白質(zhì)代謝來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，破壞其固有形態(tài)，在亞抑菌濃度就能夠抑制生物被膜的形成，對(duì)于白色念珠菌主要通過(guò)改變成熟菌體的生物膜厚度來(lái)發(fā)揮其抑菌作用[26]。MONIKA等[27]發(fā)現(xiàn)松蘿酸可以通過(guò)阻礙金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌RNA的合成來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。然而對(duì)于雪地茶的抑菌活性及其機(jī)理暫無(wú)報(bào)道，為拓展其資源的開(kāi)發(fā)利用，進(jìn)一步闡明其抑菌作用機(jī)制十分必要。

表2 雪地茶甲醇提取物抑菌作用Table 2 Antibacterial effect of methanol extract from Thamnolia subuliformis

2.2 雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性

在確定了雪地茶甲醇提取物的抗菌活性后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以食品中常見(jiàn)且致病性較高的金黃色葡萄球菌為對(duì)象，對(duì)其MIC及MBC進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明（表3）雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較強(qiáng)，MIC和MBC分別為0.625和10 mg/mL。與其他中草藥相比，雪地茶甲醇提取物的作用濃度較低且抑菌活性較強(qiáng)，崔新潔等[28]對(duì)24種中藥的水提和醇提物進(jìn)行抑菌活性研究，其中14種中藥提取物的MIC大于200 mg/mL，6種中藥的MIC在100～200 mg/mL，僅4種中藥的MIC小于100 mg/mL，其中活性最高的為五倍子水提液（MIC：0.390 mg/mL）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明雪地茶甲醇粗提物的抑菌活性較高，具有較高的開(kāi)發(fā)潛力，但其主要活性物質(zhì)的鑒定及體內(nèi)作用濃度還有待進(jìn)一步探究。

表3 雪地茶甲醇提取物的最低抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of methanol extract of Thamnolia subuliformis

為進(jìn)一步驗(yàn)證雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響，實(shí)驗(yàn)采用MIC和2MIC的樣品濃度處理觀(guān)察其對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響（圖3）。在0～2 h內(nèi)，對(duì)照和處理組菌體的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差別，2～8 h對(duì)照組菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期，8 h以后基本處于穩(wěn)定期；而加樣處理組的菌體在2～33 h生長(zhǎng)速率明顯較慢，且濃度越大，抑制效果越明顯，該現(xiàn)象與高飛雄等[29]用植酸處理沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似。說(shuō)明樣品中某些物質(zhì)的存在抑制了金黃色葡萄球菌的正常生長(zhǎng)繁殖，使其菌體數(shù)量顯著下降；導(dǎo)致菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短、生長(zhǎng)速率緩慢，從而達(dá)到抑菌作用。

圖3 雪地茶甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響Fig.3 Effect of methanol extract of Thamnolia subuliformis on growth curve of Staphylococcus aureus

2.3 雪地茶甲醇提取物抑菌活性的穩(wěn)定性探究

2.3.1 溫度對(duì)雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響為探究雪地茶甲醇提取物的抑菌穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)采用不同溫度、pH和紫外照射處理雪地茶甲醇提取物，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，雪地茶甲醇提取物經(jīng)不同溫度處理后，與對(duì)照相比其抑菌活性沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，即使用100 ℃高溫處理30 min后也保持較高的抑菌活性，說(shuō)明雪地茶甲醇提取物有較好的熱穩(wěn)定性。地衣類(lèi)生物可能存在的潛在抑菌活性物質(zhì)酚酸類(lèi)物質(zhì)的熔點(diǎn)沸點(diǎn)較高，在100 ℃下的溫度不易發(fā)生分解[30]，因此常規(guī)操作溫度更不會(huì)對(duì)其造成影響。另外，其他中草藥中獲取的多種抑菌物質(zhì)也是一樣，丁香提取物和訶子的水提物在高溫處理下，也不會(huì)影響其抑菌效果[31-32]。雪地茶甲醇提取物的熱穩(wěn)定性是其后續(xù)資源開(kāi)發(fā)利用的前提和保障。

2.3.2 pH對(duì)雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響 雪地茶甲醇提取物對(duì)供試菌在較寬的pH范圍內(nèi)都有抑菌活性，但是隨pH的變化有所波動(dòng)（圖4B），具體表現(xiàn)為隨著處理pH的升高（2.0～10.0）其抑菌活性先升高后降低，當(dāng)pH為6.0時(shí)（接近其本身pH4.83）時(shí)抑菌活性達(dá)到最大。在酸性條件（pH2.0、4.0）下，其抑菌活性較對(duì)照組分別降低34.15%和23.17%，堿性條件下（pH8.0、10.0）其抑菌活性較對(duì)照組下降了26.83%和35.98%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外界pH影響雪地茶甲醇提取物的穩(wěn)定性，在弱酸環(huán)境下，其抑菌活性較為穩(wěn)定，此結(jié)果與酚類(lèi)物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果相一致[33]，在堿性環(huán)境下，其潛在的抑菌活性物質(zhì)酚酸類(lèi)化合物的酚羥基被破壞，水解生成醌類(lèi)物質(zhì)，導(dǎo)致其抑菌活性降低[34]。

圖4 溫度、pH、紫外線(xiàn)對(duì)雪地茶甲醇提取物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of temperature, pH and UV on the antibacterial activity of methanol extract of Thamnolia subuliformis

2.3.3 紫外線(xiàn)對(duì)雪地茶甲醇提取物的抑菌活性影響不同紫外照射時(shí)間對(duì)雪地茶甲醇提取物的影響見(jiàn)圖4C，與對(duì)照相比，當(dāng)處理時(shí)間為10、20、30 min時(shí)，其抑菌活性比較穩(wěn)定，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)（40、50 min），其抑菌活性略有下降，但仍為對(duì)照組的90%以上。前人研究表明，一些功能性植物提取物如原花青素[35]、黃酮[36]、多酚[37]等物質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間紫外輻射的環(huán)境中其含量持續(xù)降低，說(shuō)明目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生了分解。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè)雪地茶甲醇提取物中的抑菌活性成分經(jīng)紫外線(xiàn)處理后受到了一定的破壞。

2.4 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸的含量測(cè)定

由圖5和圖6可知，雪地茶甲醇提取物中的松蘿酸含量為0.8613%，其乙酸乙酯萃取物中的松蘿酸含量為0.9379%，乙酸乙酯萃取物中松蘿酸的含量高于甲醇提取物中的松蘿酸含量。乙酸乙酯提取物的抑菌圈也大于甲醇提取物，但二者之間是否有必然聯(lián)系，還需進(jìn)一步的分離純化來(lái)驗(yàn)證抑菌活性。

圖5 雪地茶甲醇提取物中松蘿酸的定量離子MRM圖Fig.5 Quantitative ion MRM diagram of usnic acid in methanol extract of Thamnolia subuliformis

圖6 雪地茶乙酸乙酯萃取物的松蘿酸定量離子MRM圖Fig.6 Quantitative ion MRM diagram of usnic acid in ethyl acetate extract of Thamnolia subuliformis

3 討論與結(jié)論

本研究制備雪地茶甲醇粗提物的目的是得到包含更多有效抑菌成分的提取物，對(duì)于雪地茶是否具有抗菌作用及抗菌穩(wěn)定性進(jìn)行初步探索。結(jié)果顯示，雪地茶甲醇提取物具有較好的抑菌活性，水提物無(wú)抑菌活性，說(shuō)明雪地茶抑菌活性物質(zhì)主要溶于甲醇，并且甲醇提取物具有廣譜的抑菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都有抑菌活性，其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。以金黃色葡萄球菌為指示菌，探究其抑菌穩(wěn)定性，熱處理對(duì)雪地茶提取物的抑菌活性無(wú)明顯影響；pH在接近強(qiáng)酸和強(qiáng)堿時(shí)，提取物抑菌活性呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01），但仍然有抑菌活性；紫外照射在40 min以上，抑菌活性也會(huì)略微下降。結(jié)果表明食品加工過(guò)程中，常見(jiàn)的熱處理不會(huì)對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生影響，在紫外光滅菌處理時(shí)，盡量不超過(guò)30 min。其抑菌活性物質(zhì)在溫度、pH、紫外線(xiàn)的照射的影響下，都比較穩(wěn)定。進(jìn)一步對(duì)甲醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取，發(fā)現(xiàn)抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中，根據(jù)前人研究以松蘿酸為代表的縮酚酸及其衍生物可能為抑菌主要活性成分[7]，測(cè)定甲醇提取物及乙酸乙酯萃取物中的松蘿酸含量，乙酸乙酯提取物的抑菌圈直徑大于甲醇提取物直徑，乙酸乙酯提取物中的松蘿酸含量大于甲醇提取物的含量，推測(cè)抑菌活性可能與松蘿酸含量有關(guān)，但需要進(jìn)一步分離純化驗(yàn)證。本研究為雪地茶甲醇提取物應(yīng)用于食品防腐、抑菌提供了理論依據(jù)，目前對(duì)于雪地茶抑菌的研究甚少，本研究為雪地茶抑菌活性物質(zhì)的分離純化、抑菌機(jī)理的探究提供了數(shù)據(jù)支撐。