基于釀酒酵母體系的人參皂苷抗衰老活性篩選及評(píng)價(jià)

陳靜靜，白雪媛，邊 帥，吉世禹，王思明

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院,吉林長(zhǎng)春130000）

釀酒酵母是抗衰老研究中最為簡(jiǎn)單的生物模型[1]，也是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng)。其正常細(xì)胞的衰老新陳代謝反應(yīng)機(jī)制與人體正常細(xì)胞的衰老新陳代謝反應(yīng)機(jī)制很相似[2]。它生長(zhǎng)周期短、易大規(guī)模培養(yǎng)，具有相對(duì)較短、易于測(cè)量的時(shí)間和復(fù)制壽命，并已完成基因組測(cè)序，有完整的核苷酸序列[3]，并與哺乳動(dòng)物有高度的同源性。釀酒酵母衰老模型作為一種單細(xì)胞生物模型，不僅能夠高通量篩選藥物活性，更能夠進(jìn)一步從細(xì)胞水平探尋衰老的機(jī)制[4]。目前國(guó)內(nèi)外用釀酒酵母作為研究衰老的模式生物已有30余年，基于酵母模式生物，相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多酚白藜蘆醇和天然多胺亞精胺可作為潛在的抗衰老劑[5]。酵母細(xì)胞同哺乳動(dòng)物類似，其中存在著超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等抗氧化酶[6-11]。蛋白質(zhì)組學(xué)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此可以獲得蛋白水平上的關(guān)于釀酒酵母衰老發(fā)生及給藥后細(xì)胞的整體而全面的認(rèn)識(shí)[12]。

人參被譽(yù)為“百草之王”，具有很大的藥用價(jià)值[13]。人參皂苷是人參中的重要活性成分之一，它也已經(jīng)被證明是具有抗衰老作用的藥物之一，在抗衰老過(guò)程中起非常重要的作用[14-16]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，最終確定選用較多人使用研究的和人參中含量較高的人參皂苷單體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此前期篩選使用了八種人參皂苷Rb1、Rb2、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rd[17-19]。然而人參皂苷抗衰老涉及到多種作用機(jī)制，目前尚不清楚，其中，具有明顯抗衰老作用的單體皂苷也不甚明晰，本實(shí)驗(yàn)旨在探究人參皂苷減弱氧化應(yīng)激從而達(dá)到延緩釀酒酵母衰老的作用及確定出效果最為明顯的一種或多種單體皂苷對(duì)其進(jìn)行活性評(píng)價(jià)[20]。

以往研究人參皂苷的抗衰老作用，用動(dòng)物或細(xì)胞作為研究模型較多，但研究不夠深入，未清楚其作用機(jī)制[21]，以釀酒酵母作為抗衰老模型，不僅可說(shuō)明人參皂苷在不同物種上的保守性，也能為后期人參皂苷的作用機(jī)制研究提供方便。本文以釀酒酵母作為模型生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為人參皂苷更進(jìn)一步的有效使用提供一定參考。以比較有代表性的SOD作為抗氧化指標(biāo)，篩選出較為有效的單體皂苷。后面再通過(guò)ROS含量、MDA含量以及多種抗氧化酶活性進(jìn)行驗(yàn)證人參皂苷是否具有抗氧化作用從而達(dá)到抗衰老作用。通過(guò)對(duì)釀酒酵母的正常組及給藥組的蛋白質(zhì)組比較分析，找到某些“衰老特異性的蛋白質(zhì)分子”與藥物產(chǎn)生抗衰老作用的主要途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母BY4742 淼靈生物公司；YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，溶于蒸餾水中，121 ℃滅菌20 min，YPD固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品 源葉生物科技有限公司；酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、MTT、二甲基亞砜、DNS、卡那霉素、磷酸鹽緩沖液、愈創(chuàng)木酚、TCA、過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒 索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒 碧云天生物試劑公司；SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所。

EYELA恒溫培養(yǎng)箱 東京理化公司；infinite M200PRO酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；SCIENTZ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物有限公司；SX-700蒸汽滅菌器 日本Tomy Digital Biology公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；innova40全溫振蕩培養(yǎng)箱 德國(guó)Eppendorf公司；KQ-600E型超聲清洗器 昆山超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母活化與培養(yǎng) 將購(gòu)買的菌種在YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線或涂布，于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h活化[22]。再進(jìn)行單克隆培養(yǎng)即挑單菌落于滅完菌的小體積YPD液體培養(yǎng)基里擴(kuò)大培養(yǎng)，再進(jìn)行大體積的二次擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃、180 r/min，每次培養(yǎng)24 h即可連續(xù)傳代培養(yǎng)使用。培養(yǎng)基中均加入卡那霉素50 mg/mL作抗生素，避免染菌[23]。

1.2.2 酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制及降糖能力測(cè)定取經(jīng)兩次擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液，以2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中置于合適條件下培養(yǎng)，將此時(shí)記為0 h（初始接種期），每隔4 h從中取樣，用MTT法測(cè)定OD600值。菌濃度以O(shè)D600值表示。取樣測(cè)定繪制釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線[24]。

采用二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定菌液中的殘?zhí)呛?，先繪制出葡萄糖標(biāo)曲，測(cè)定OD540值，用空白管進(jìn)行調(diào)零，即可繪制出檢測(cè)還原糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：取發(fā)酵液1 mL，8000 r/min離心10 min取上清液，加入0.75 mL的DNS混勻，煮沸5 min，立即冷卻，加入蒸餾水稀釋到10 mL，測(cè)定OD540值，將結(jié)果帶入標(biāo)曲即可得到各時(shí)間點(diǎn)菌液的殘?zhí)呛?。若OD值不在標(biāo)曲內(nèi)，可以先稀釋樣品找出合適的濃度。

1.2.3 釀酒酵母不同時(shí)期凝絮能力比較 根據(jù)1.2.2的生長(zhǎng)曲線，選出分別處于穩(wěn)定前期、穩(wěn)定中期和衰老期的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將菌液濃度用生理鹽水稀釋至2.0×104～3.0×104CFU/mL，搖勻，取等體積稀釋后樣品1 mL于Ep管中，用PBS定容至20 mL，室溫靜置，每隔30 min從管中取樣，測(cè)定其OD600值。

1.2.4 最適給藥濃度篩選 查閱文獻(xiàn)，選出藥物濃度為100、150、180、200、250 μg/mL給藥[25-26]，確定較合適的給藥濃度。進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每隔6 h取樣測(cè)定，繪制給藥后酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，與未給藥的正常生長(zhǎng)曲線進(jìn)行對(duì)比，觀察是否延長(zhǎng)酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命，實(shí)驗(yàn)做三組平行。

1.2.5 有效人參皂苷初步篩選 根據(jù)前期藥物濃度篩選確定藥物濃度，于酵母菌剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)進(jìn)行，分別給藥人參皂苷Rb1、Rb2、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rd。之后隔12 h取樣，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定細(xì)胞濃度，繪制生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行比較。同時(shí)在將要進(jìn)入衰老期時(shí)測(cè)定不同皂苷作用的酵母菌抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）含量，以確定效果較好的人參皂苷單體進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 不同時(shí)期酵母細(xì)胞的形態(tài)觀察 取經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌2次的酵母細(xì)胞，用PBS稀釋細(xì)胞懸液到適當(dāng)濃度，置于干凈的聚酰胺玻片上，進(jìn)行爬片，洗滌，固定，用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7 粗酶液制備 取1 mL菌液，用反復(fù)凍融加超聲波破碎細(xì)胞法進(jìn)行處理，3000 r/min離心6 min得到的細(xì)胞沉淀用PBS洗滌三次，再加入0.5 mL PBS，功率300 W，工作3 s，間歇9 s，置于冰水浴中持續(xù)10 min進(jìn)行超聲處理。得到的細(xì)胞破碎液于4 ℃，12000 r/min的條件下離心10 min，取上清即得到粗酶液。由于蛋白易降解失活，要將粗酶液置于-20 ℃下并分裝保存，避免反復(fù)凍融。

1.2.8 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

1.2.8.1 ROS含量的測(cè)定 采用熒光探針DCFHDA檢測(cè)法[9]進(jìn)行測(cè)定。YPD液體培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA探針使終濃度為10 μmol/L，收集細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為1.0×106～2.0×106CFU/mL，37 ℃孵育20 min，PBS清洗三次，使用熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定。

1.2.8.2 POD酶活性的測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚法[9]進(jìn)行測(cè)定。依次加入2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液、0.1 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液、0.1 mL的粗酶液、1.0 mL的2% H2O2，充分搖勻，在37 ℃水浴保溫15 min，立即加入2%的TCA溶液 2 mL終止反應(yīng)，混勻，用雙蒸水調(diào)零，在470 nm處測(cè)吸光度值，以每分鐘吸光度值變化0.01為一個(gè)酶活單位（U）。使用BCA試劑盒測(cè)定粗酶液中的蛋白含量。

式中：ΔA470表示樣品在470 nm下的吸光度值；N表示加酶量，mL；C表示蛋白濃度，mg prot/mL；T表示反應(yīng)時(shí)間，1 min。

1.2.8.3 SOD 酶活性的測(cè)定 采用WST-1法[23]進(jìn)行測(cè)定。取1.2.7得到的粗酶液稀釋10倍，測(cè)定孔接20 μL稀釋好的粗酶液，再加入酶工作液20 μL和200 μL底物應(yīng)用液，混勻后，37 ℃孵育20 min，450 nm測(cè)吸光度A。測(cè)定空白孔同測(cè)定孔用酶稀釋液代替酶工作液，其余步驟相同。在反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位（U）。按公式計(jì)算SOD抑制率：

式中：Ah表示對(duì)照孔450 nm下的吸光度值；Ai表示空白對(duì)照孔450 nm下的吸光度值；Aj表示測(cè)定孔450 nm下的吸光度值；Ak表示空白測(cè)定孔450 nm下的吸光度值；K表示反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)；C待測(cè)表示待測(cè)樣本蛋白濃度，mg prot/mL。

1.2.8.4 CAT 酶活性的測(cè)定 采用微量法[23]進(jìn)行測(cè)定。取30 μL菌液加1 mL CAT提取液，超聲破碎，離心取上清（與1.2.7相同）。取10 μL粗酶液加入190 μL檢測(cè)工作液，記錄每min樣品在240 nm下的吸光度變化值。使用BCA試劑盒測(cè)定粗酶液中的蛋白含量。CAT活力計(jì)算公式如下：

式中：ΔA表示每分鐘樣品在240 nm下的吸光度變化值；V總表示反應(yīng)總體積，mL； εH2O2表示H2O2的摩爾消光系數(shù)，43.6 L/mol/cm；d表示孔板光徑，0.6 cm；Cpr表示樣品蛋白濃度，mg prot/mL；V樣表示樣品體積，mL；T表示反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.8.5 MDA含量測(cè)定 TBA顯色法[27]。取1.2.7得到的粗酶液100 μL，加入0.2 mL MDA檢測(cè)工作液，混勻，沸水浴15 min，水浴冷卻至室溫，1200 r/min離心10 min后取200 μL上清加入到96孔板中，隨后用酶標(biāo)儀在535 nm測(cè)定吸光度。由此通過(guò)比色法對(duì)樣品中的MDA進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.2.9 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 取68 h的給藥與空白樣品各3個(gè)，離心回收沉淀，清洗兩次，液氮研磨成細(xì)胞粉，加入四倍體積裂解液，超聲三次，收集上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，再以1:50的比例進(jìn)行胰酶酶解，再用TMT肽段標(biāo)記，標(biāo)記的肽段用高pH反向液相色譜進(jìn)行分離，質(zhì)譜檢測(cè)分子量進(jìn)行成分分析和結(jié)構(gòu)分析，最后進(jìn)行蛋白質(zhì)的定性與定量分析。

1.2.9.1 TMT標(biāo)記及肽段分級(jí) 將各樣品得到的所有蛋白進(jìn)行酶解，肽段定量。按照TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書，每份樣品分別取100 μg肽段進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記試劑解凍后用乙腈溶解，與肽段混合后室溫孵育2 h，標(biāo)記后的肽段混合后除鹽，真空冷凍干燥。首先采用乙腈和0.1%三氟乙酸 （TFA） 進(jìn)行柱平衡，然后將混合的標(biāo)記肽段樣品上樣，將其脫鹽處理、梯度洗脫、真空干燥后用適量0.1% FA溶液復(fù)溶凍干樣品，在吸光度280 nm處測(cè)定肽段濃度。

1.2.9.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析 采用納升流速的HPLC 液相系統(tǒng)對(duì)每份分級(jí)樣品進(jìn)行分離；樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，正離子檢測(cè)方式，母離子掃描范圍300～1800 m/z。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采集方式：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜（MS2 scan，HCD）。

1.2.9.3 蛋白質(zhì)鑒定和定量分析 LC-MS/MS質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)使用軟件Mascot 2.2和 Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析，最后生物信息學(xué)分析得到差異蛋白篩選和GO功能集分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均采用Prism 8軟件作圖，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)用ANOVA方法作差異分析（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)均做3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線和殘?zhí)亲兓?/h3>

由圖1可知，釀酒酵母的遲滯期為0～4 h，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期在4～16 h，并在16 h進(jìn)入穩(wěn)定期（靜止期），說(shuō)明這個(gè)時(shí)期的酵母菌個(gè)體形態(tài)及生理指標(biāo)都較為穩(wěn)定，是菌種采樣留種的好時(shí)期。在68 h開(kāi)始進(jìn)入衰亡期（也叫衰老期）。與此對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基殘?zhí)亲兓脖砻髟趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期16 h之前殘?zhí)呛靠焖傧陆?，說(shuō)明此時(shí)酵母菌生長(zhǎng)消耗大量的葡萄糖，16～68 h進(jìn)入穩(wěn)定期，殘?zhí)呛肯陆稻徛?，說(shuō)明隨著釀酒酵母培養(yǎng)時(shí)間的增加，酵母細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝能力逐漸變慢，當(dāng)培養(yǎng)到68 h時(shí)，殘?zhí)菨舛认陆禈O度緩慢基本保持不變，由此可見(jiàn)細(xì)胞衰老使得釀酒酵母對(duì)糖的代謝能力減弱。

圖1 釀酒酵母的生長(zhǎng)曲線和殘?zhí)亲兓瘓DFig.1 Growth curve and residual sugar diagram of Saccharomyces cerevisiae

2.2 不同時(shí)期的酵母菌凝絮能力變化

凝絮能力測(cè)定要選用比較有代表性的時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因此選用了剛到達(dá)穩(wěn)定期的16 h、穩(wěn)定期中點(diǎn)的44 h和進(jìn)入衰亡期的68 h的菌液進(jìn)行絮凝能力對(duì)比實(shí)驗(yàn)，由圖2可知，16 h的釀酒酵母凝絮曲線斜率為0.0006，44 h凝絮曲線的斜率為0.001，68 h斜率為0.0015。隨著酵母細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加，其絮凝速率明顯加快，這可能是由于酵母在衰老過(guò)程中，細(xì)胞經(jīng)多次出芽繁殖，表面細(xì)胞壁褶皺程度增加，導(dǎo)致了細(xì)胞間表面粘附力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了細(xì)胞聚集引起絮凝速率加快，也有可能是由于菌體在衰老過(guò)程中胞內(nèi)活性氧積累，脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞絮凝速率加快[28]。還有可能是細(xì)胞衰老過(guò)程中，細(xì)胞活力下降，導(dǎo)致絮凝能力增強(qiáng)。

圖2 釀酒酵母不同時(shí)間凝絮能力變化Fig.2 Changes of flocculation ability of Saccharomyces cerevisiae at different time

2.3 篩選最適給藥濃度

使用人參皂苷Rg1根據(jù)酵母菌的生長(zhǎng)曲線篩選出最適的給藥濃度。根據(jù)圖3生長(zhǎng)曲線結(jié)果得出當(dāng)給藥濃度是150、180、200 μg/mL時(shí)，均在84 h進(jìn)入衰亡期，有明顯延長(zhǎng)酵母菌穩(wěn)定期的作用。而濃度為100 μg/mL、250 μg/mL和空白組一樣于72 h進(jìn)入衰老期，但由結(jié)果可知180 μg/mL時(shí)對(duì)酵母還具有明顯的增殖效果，說(shuō)明當(dāng)給藥濃度為180 μg/mL時(shí)，既能延長(zhǎng)酵母的穩(wěn)定期同時(shí)具有明顯增殖效果，作用最佳。因此選定給藥濃度為180 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同給藥濃度的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of different drug concentration

2.4 不同人參皂苷對(duì)釀酒酵母作用結(jié)果

據(jù)圖4可以比較直觀的得出人參皂苷Rb1、Rb2、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1均有延緩酵母衰老的作用，均延長(zhǎng)了釀酒酵母進(jìn)入衰老拐點(diǎn)的時(shí)間：空白組是在72 h附近開(kāi)始有菌濃度下降的趨勢(shì)，而給藥組Rg1在96 h附近開(kāi)始下降，Rb2是在84 h處出現(xiàn)下降趨勢(shì)。同時(shí)，Rg3有非常明顯的酵母菌增殖效果，Rb1、Rg2、Rh1也都有一定的增殖作用。為了使結(jié)果更清楚，選用了拐點(diǎn)附近的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)64、68、70、72、76 h進(jìn)行抗氧化酶SOD活性的檢測(cè)，以便觀察哪些藥物有明顯增強(qiáng)抗氧化酶活性的效果。由圖5可以得出，人參皂苷Rg1、Rg3有明顯增強(qiáng)抗氧化的作用，在各時(shí)間點(diǎn)均增大SOD活力（P＜0.05）。人參皂苷Rb1、Rb2、Rh1也有增加抗氧化酶活性的作用，但效果不如Rg1和Rg3。人參皂苷Rg3造價(jià)較為昂貴且效果較Rg1稍低。由此，結(jié)合這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定使用人參皂苷Rg1進(jìn)行接下來(lái)的活性研究實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同人參皂苷作用下的酵母菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of yeast under the action of different ginsenosides

圖5 不同人參皂苷作用下的酵母細(xì)胞SOD活力比較Fig.5 Comparison of SOD activity in yeast cells under different ginsenosides

2.5 人參皂苷Rg1給藥組與空白組的生長(zhǎng)曲線對(duì)比

由圖6 給藥組與空白組比較可知，給藥后顯著延長(zhǎng)了酵母細(xì)胞的時(shí)序壽命，約延長(zhǎng)了24 h。空白組在84 h時(shí)已經(jīng)進(jìn)入衰老期，而給藥組還處于穩(wěn)定期，且給藥組于96 h進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞濃度較空白組有較顯著提升（P＜0.01）。由此可以看出給藥人參皂苷Rg1使釀酒酵母穩(wěn)定期延長(zhǎng)，進(jìn)入衰老期的時(shí)間點(diǎn)延緩，且菌濃度較未給藥的正常培養(yǎng)的酵母菌濃度較高，說(shuō)明人參皂苷Rg1具有延緩釀酒酵母衰老的作用并能夠促進(jìn)酵母增殖。

圖6 給藥與未給藥的生長(zhǎng)曲線對(duì)比圖Fig.6 Comparison of growth curve between drug administration and non drug administration

2.6 不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)對(duì)比

圖7 是不同時(shí)期的酵母細(xì)胞掃描電鏡圖。A是正常對(duì)照組在剛進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，其形態(tài)穩(wěn)定，細(xì)胞呈不規(guī)則球狀，表面光滑無(wú)皺褶。B是正常對(duì)照組在剛進(jìn)入衰亡期的細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次出芽生殖，表面粗糙產(chǎn)生大量絮狀物，表面褶皺增加，出現(xiàn)核仁碎片，細(xì)胞有明顯衰亡痕跡。C是在正常培養(yǎng)基礎(chǔ)上給藥人參皂苷Rg1，同樣是68 h的細(xì)胞狀態(tài)，從圖中可以看出細(xì)胞正在進(jìn)行分裂，細(xì)胞表面雖有芽痕，但細(xì)胞形態(tài)保留較為完好，與未給藥組對(duì)比有明顯改善，因此可知人參皂苷Rg1在一定程度上可以改善酵母細(xì)胞的衰老情況。

圖7 釀酒酵母不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)Fig.7 Cell morphology of Saccharomyces cerevisiae at different stages

2.7 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量越高，說(shuō)明抗氧化能力越弱。POD和CAT是主要的抗氧化酶之一，含量越高，說(shuō)明抗氧化能力越強(qiáng)。SOD水平與自由基含量呈負(fù)相關(guān)，其水平的高低可間接反映機(jī)體內(nèi)自由基的含量。測(cè)定MDA含量即可得到細(xì)胞氧化脂質(zhì)的情況[29]。由圖8可以看出，空白組釀酒酵母隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，胞內(nèi)活性氧含量出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，而給藥組能明顯降低酵母的活性氧含量，特別在剛給藥后存在極顯著差異（P＜0.0001）。POD也是酵母中的主要抗氧化酶之一，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，POD出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，同時(shí)給藥后顯著提升酵母細(xì)胞內(nèi)的POD活性（P＜0.01）。由圖c可知釀酒酵母SOD活力隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)，給藥后能使酵母細(xì)胞SOD活性更強(qiáng)，結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05）。CAT同POD一樣，都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，進(jìn)入衰老期后抗氧化酶活力便開(kāi)始下降。由圖e可知MDA含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，在68 h進(jìn)入衰老期后細(xì)胞數(shù)減少所以MDA含量總體有所減少，但給藥后能顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量，說(shuō)明細(xì)胞抗氧化能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。從圖中可以看出，給藥后不僅細(xì)胞中的活性氧含量有所降低，各抗氧化酶的活力增強(qiáng)，在酵母進(jìn)入衰老期抗氧化酶活力開(kāi)始下降后也能抵御活性氧或超氧陰離子帶來(lái)的氧化損傷，尤其是POD和SOD酶活力有明顯增強(qiáng)，MDA含量也有明顯降低。因此可以說(shuō)明人參皂苷Rg1具有延緩釀酒酵母衰老的作用，并且可以降低釀酒酵母的活性氧含量，同時(shí)增加胞內(nèi)抗氧化酶的活力，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化率，可為后續(xù)的研究提供數(shù)據(jù)支撐。人參皂苷Rg1可能是通過(guò)抗氧化達(dá)到抗衰老的目的。

圖8 給藥與未給藥的抗氧化酶活性及活性氧含量對(duì)比圖Fig.8 Comparison of antioxidant enzymes and reactive oxygen content between drug administration and non drug administration

2.8 蛋白組學(xué)分析結(jié)果

在差異蛋白質(zhì)篩選中，以表達(dá)倍數(shù)＞1.5 倍（上調(diào)大于1.5倍或下調(diào)小于0.67倍）且P-value＜0.05（Ttest）為標(biāo)準(zhǔn)，得到比較組間的上調(diào)、下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目。將比較組間蛋白質(zhì)以表達(dá)差異倍數(shù)和Pvalue（T-test）兩個(gè)因素為標(biāo)準(zhǔn)繪制火山圖（圖9），無(wú)差異的蛋白質(zhì)為灰色，顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)以藍(lán)色標(biāo)注（FC＜0.67 且P＜0.05），下調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為10個(gè)。顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)以紅色標(biāo)注（FC＞1.5且P＜0.05），上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)量為4個(gè)，人參皂苷延緩釀酒酵母衰老可能與14個(gè)顯著差異蛋白有關(guān)。

圖9 釀酒酵母的差異蛋白篩選Fig.9 Screening of differential protein in Saccharomyces cerevisiae

為了全面了解蛋白在生物體中的功能、定位及參與的生物學(xué)途徑，通過(guò)基因本體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋。GO 是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的功能分類體系，GO 功能注釋主要分為 3 類：生物過(guò)程，分子功能和細(xì)胞組分。蛋白質(zhì)可以根據(jù)ID序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的蛋白的功能以及組成。根據(jù)圖10發(fā)現(xiàn)它們主要包含細(xì)胞、細(xì)胞器等細(xì)胞組分（CC），具有結(jié)合和催化活性等分子功能（MP），并參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和代謝等生物過(guò)程（BP）。一般情況下，某一功能類別對(duì)應(yīng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)目越多，說(shuō)明該功能越重要，需要重點(diǎn)關(guān)注或者進(jìn)行后續(xù)深入的機(jī)制探討，為后續(xù)的研究提供思路。因此，釀酒酵母的差異蛋白在細(xì)胞組分和分子功能的改變中較多，可能與細(xì)胞代謝有密切關(guān)系。

圖10 釀酒酵母差異表達(dá)蛋白GO的分類及注釋Fig.10 Classification and annotation of differentially expressed protein GO in Saccharomyces cerevisiae

3 討論與結(jié)論

釀酒酵母的壽命包括時(shí)序壽命和復(fù)制壽命，此次實(shí)驗(yàn)以其時(shí)序壽命為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)以釀酒酵母體系為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停诮湍竸傔M(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)進(jìn)行給藥，篩選確定藥物濃度為180 μg/mL。查閱文獻(xiàn)可知很多藥物均被證明有抗衰老作用，例如姜黃素衍生物（500 μg/mL），柳樹(shù)提取物（0.1%）等[30-31]，相比較來(lái)說(shuō)，人參皂苷Rg1的給藥濃度（180 μg/mL）要更小一些也具有抗衰老作用。本文篩選的人參皂苷Rb1、Rb2、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1均有延緩酵母衰老的作用，但人參皂苷Rg1的效果最為顯著，據(jù)酵母生長(zhǎng)曲線得出Rg1可明顯延緩酵母進(jìn)入衰老期時(shí)間。結(jié)合釀酒酵母空白組和給藥人參皂苷Rg1組的生長(zhǎng)曲線圖對(duì)比結(jié)果以及電鏡下的細(xì)胞狀態(tài)對(duì)比，加上給藥組與空白組的抗氧化指標(biāo)對(duì)比結(jié)果，可以證明人參皂苷Rg1有顯著的延緩釀酒酵母衰老作用。

ROS水平可以決定不同的生物學(xué)結(jié)果。低水平的ROS可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和適應(yīng)氧化，而高水平的ROS可促進(jìn)衰老，造成DNA、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和疾病[32]。在釀酒酵母培養(yǎng)過(guò)程中添加人參皂苷Rg1，可顯著提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶類SOD、CAT 及 POD 活性并且降低活性氧的含量，減少脂質(zhì)氧化，從而降低胞內(nèi)活性氧對(duì)細(xì)胞的氧化損傷情況。說(shuō)明人參皂苷Rg1是通過(guò)上調(diào)了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)組成部分CAT、POD與SOD的酶活水平并且降低了酵母細(xì)胞內(nèi)的ROS和MDA含量，從而達(dá)到有效減緩氧化應(yīng)激，延長(zhǎng)酵母的存活時(shí)間的目的[33]。結(jié)果也表明人參皂苷Rg1既可抑制自由基的產(chǎn)生，也可直接對(duì)抗自由基對(duì)組織及細(xì)胞的損傷作用，或直接清除自由基，還可增強(qiáng)機(jī)體本身抗氧化系統(tǒng)的功能，從多個(gè)環(huán)節(jié)阻斷自由基的損傷作用。蛋白組學(xué)分析結(jié)果的差異蛋白篩選和GO富集分析為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證研究人參皂苷Rg1抗衰老提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。人參皂苷延緩釀酒酵母衰老可能與14個(gè)顯著差異蛋白有關(guān)，并且藥物通過(guò)作用在細(xì)胞組分和細(xì)胞器中產(chǎn)生療效，同時(shí)很大部分作用在代謝過(guò)程中。

因此人參皂苷Rg1用來(lái)作為抗衰老藥物前景較好，具有治療各種氧化或衰老所致疾病的巨大潛力，也可以用來(lái)作為某些藥物的輔助藥物來(lái)使用。本實(shí)驗(yàn)也為抗衰老與抗氧化之間的關(guān)系依據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)也為人參藥物、保健、美容等系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論指導(dǎo)。