低分子量褐藻多糖的制備及其活性分析

闕 斐，陶文靖，馮文婕

（1.浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程學(xué)院，浙江杭州 310018；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

褐藻多糖，又名褐藻多糖硫酸酯、褐藻膠，主要來源于海帶、巨藻、泡葉藻、墨角藻等海藻，集中于褐藻植物細胞壁中，是一種含有硫酸基團的高分子量的雜多糖，具有抗氧化、降尿酸、抗腫瘤、抗病毒、抗炎等生理功能[1?3]，在功能性食品、果蔬保鮮等方面具有較大應(yīng)用潛力。然而，由于天然褐藻多糖存在著分子量大、粘度高，滲透性差，不利于吸收等問題，其應(yīng)用受到很大限制。研究表明，通過一定方式降解多糖，獲得低分子量多糖，能夠提高多糖的生物活性和生物利用率[4?5]。Zhao等[6]以海帶為原料制備的低分子量巖藻多糖對超氧自由基、羥自由基等有較強的體外清除作用。Xue等[7]研究表明低分子量的硫酸多糖對低密度脂蛋白的氧化作用強于粗巖藻糖。任立士等研究發(fā)現(xiàn)通過利用自由基降解法制備的海藻寡糖，具有良好的清除自由基的能力[8]。因此，通過適當(dāng)方法降低褐藻多糖分子量，是發(fā)揮其生理活性的重要途徑。

目前，低分子量褐藻多糖的制備方法可分為物理法、化學(xué)法、生物酶解法[7]。生物酶解法條件溫和且分子量較易控制，但酶制劑價格昂貴且不易獲得[9]。硫酸基團對褐藻多糖活性的發(fā)揮起到很重要的作用，Wang等、Mohsin等研究發(fā)現(xiàn)，低分子量褐藻多糖自由基清除能力、抗凝血活性與硫酸根含量成正相關(guān)[10?11]。Anastyuk等[12]研究發(fā)現(xiàn)，由于硫酸酯基及α-1，4-巖藻糖苷鍵的存在，低分子量褐藻糖對人體惡性黑色素瘤細胞系SK-MEL-28表現(xiàn)出了較好的抑制性。Shao等[13]研究表明，體外抗癌活性與褐藻多糖分子中的硫酸根含量有關(guān)。同時，硫酸化的褐藻多糖被報道具有抑制單純形皰疹病毒（HSV）和人類免疫缺陷病毒（HIV）的能力[14?15]，甚至被推斷具有抗新冠病毒（coronavirus disease 2019，COVID-19）的能力[16]。因此在選擇方法的時候應(yīng)著重注重對硫酸基團的保護，但化學(xué)方法對硫酸基團的破壞較為嚴(yán)重，不適合應(yīng)用。作者前期實驗表明，利用自由基法可有效降解褐藻多糖，同時不會過度破壞硫酸基團。

因此，本實驗利用抗壞血酸輔助過氧化氫法對褐藻多糖進行降解，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)進行降解條件優(yōu)化。利用超濾系統(tǒng)對降解的多糖進行分級，對比不同分子量段降解多糖的DPPH自由基清除率、保濕性以及酪氨酸酶抑制活性，分析其分子量及化學(xué)組成，以期為褐藻多糖在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褐藻多糖 山東潔晶集團股份有限公司；瓊脂糖凝膠 青島源葉生物技術(shù)公司；透明質(zhì)酸 廣州高良生物科技有限公司；DPPH 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫、抗壞血酸等 均為市售國產(chǎn)分析純。

真空冷凍干燥機 德國CHREIST公司；DU-800型紫外-可見分光光度計 美國貝克曼公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；超濾膜分離系統(tǒng) 美國賽默飛公司；十八角度激光光譜散射儀 美國Wyatt公司；DGU-20A5R高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐藻多糖的降解 配制1%的褐藻多糖溶液，加入一定體積的30%過氧化氫和抗壞血酸，在一定溫度下降解一段時間后，用0.01 mol/L氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)溶液pH至中性，采用200 Da透析袋，蒸餾水透析3 d，凍干后得降解產(chǎn)物。褐藻多糖降解產(chǎn)物得率計算公式如下：

式中，Y—褐藻多糖降解產(chǎn)物得率（%），W2—降解后多糖質(zhì)量 （g），W1—降解前多糖質(zhì)量 （g）。

1.2.2 褐藻多糖降解單因素及正交試驗 以褐藻多糖降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為指標(biāo)，使用過氧化氫結(jié)合抗壞血酸的方法降解褐藻多糖[17?18]。配制1%的褐藻多糖溶液，以實驗條件H2O2-VC濃度15 mmol/L（向100 mL褐藻多糖溶液中添加153 μL 30%過氧化氫溶液和0.26 g VC）、降解溫度35 ℃、降解時間3 h為固定因素水平，按照5、10、15、20、25 mmol/L，25、35、45、55、65 ℃，1、2、3、4、5 h的因素水平進行單因素實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計3因素3水平正交試驗，具體方案見表1，以褐藻多糖降解產(chǎn)物DPPH自由基清除率為指標(biāo)確定最佳降解條件。

表1 正交試驗因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levels used in orthogonal experiment

1.2.3 DPPH自由基清除率的測定 參照姜美云等[19]的方法，并稍作修改。DPPH自由基清除率的測定方法見表2，反應(yīng)液充分混勻，室溫黑暗處靜置反應(yīng)30 min，在517 nm下測定吸光值A(chǔ)。降解產(chǎn)物溶液濃度配制為1%，用0.025 mg/mL VC做陽性對照，以蒸餾水做空白，DPPH自由基清除率公式計算如下：

表2 DPPH自由基清除率測定方法Table 2 Determination of DPPH radical scavenging rate

1.2.4 凝膠電泳分析 采用Shi等[20]的凝膠電泳方法，分析褐藻多糖的降解情況。上樣緩沖液與樣品比例為1:4，上樣量為10 μL。電泳條件中電壓為80 V，時間45 min。

1.2.5 褐藻多糖降解產(chǎn)物的分級分離 利用超濾膜系統(tǒng)對褐藻多糖降解產(chǎn)物按照分子量進行分級，采用5、10和30 kDa的超濾膜，將降解產(chǎn)物分為小于5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa和大于30 kDa四個組分，分別記為S1、S2、S3、S4，凍干備用。

1.2.6 不同分子量段多糖DPPH自由基清除率測定將S1、S2、S3、S4四種組分以及褐藻多糖配制成1%溶液，按照1.2.3的方法測定DPPH自由基清除率。

1.2.7 保濕性測定方法 保濕性測定參照屈義[21]的方法，略有修改。在干燥器底部加入200 g變色硅膠。將樣品與平板置于干燥箱中，50 ℃干燥至質(zhì)量恒定。準(zhǔn)確稱S1、S2、S3、S4以及褐藻多糖各0.1 g，分別加水10 mL。配制完成的溶液均敞口置于恒溫密閉硅膠干燥器中，用透明質(zhì)酸（HA）做對照。分別放置3、6、12、24、36 h后，稱量其質(zhì)量變化，按下式計算保濕率：

式中，Y—保濕率（%）；M0—放入干燥器前樣品溶液的質(zhì)量（g），Mt—干燥后樣品溶液的質(zhì)量（g）。

1.2.8 酪氨酸酶抑制活性的測定 參照Chen等[22]的方法。將S1、S2、S3、S4四種組分以及褐藻多糖配制成1%溶液，作為樣品。在反應(yīng)體系中分別加入樣品、L-酪氨酸及PBS緩沖液，在37 ℃中水浴反應(yīng)15 min，再加入500 U/mL的酪氨酸酶，37 ℃條件下反應(yīng)15 min，放置冰浴中結(jié)束反應(yīng)，在475 nm下測量吸光值。具體加樣步驟見表3。酪氨酸酶抑制率計算公式如下：

式中，A1、A2、B1、B2分別表3中相應(yīng)反應(yīng)體系的吸光值。

表3 抑制酪氨酸酶活性反應(yīng)體系Table 3 Reaction system for inhibiting tyrosinase activity

1.2.9 單糖組成的測定 單糖組成的測定采用柱前衍生高效液相色譜法，具體參照 Chen的方法[22]，混合標(biāo)準(zhǔn)品由葡萄糖、巖藻糖、木糖、半乳糖、葡萄糖醛、甘露糖、甘露糖醛酸等7種單糖混合乳糖組成。測定條件設(shè)置如下：色譜柱：Agilent EC-C18（3.5 μm，4.6 mm×250 mm），紫外檢測波長：254 nm，流動相為乙腈：磷酸鹽緩沖液（15:85），流速：1 mL/min，進樣量20 μL，以各種標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中各單糖含量。

1.2.10 分子量的測定 將樣品用蒸餾水配置為10 mg/mL，采用GPC-十八角激光光散射聯(lián)用進行分子量分布的分析。色譜儀：Agilent 1260，分析柱：TSK G2500PW（8.0 mm×300 mm，8 μm），流動相為H2O，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為50 μL，選擇示差檢測器檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS16.0軟件，組間差異經(jīng)t檢驗分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。所有實驗均進行三次重復(fù)，實驗結(jié)果用±s表示，圖形使用GraphPad Prism5（GraphPad Software公 司，2365 Northside Dr. Suite 560 San Diego, 美國加州）繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

如圖1A所示，隨H2O2-VC用量增加，清除率從40.2%升至56.1%，清除率升高可能與多糖分子量減小和活性多糖片段增多有關(guān)[23]，H2O2-VC用量為20 mmol/L之后清除率開始下降，這可能是由于H2O2含量過高時，自由基氧化反應(yīng)劇烈，產(chǎn)物脫硫現(xiàn)象和脫羧反應(yīng)較為嚴(yán)重[24?25]，因此，H2O2-VC的最適用量為20 mmol/L。

一般來說，溫度的升高會導(dǎo)致反應(yīng)速率的增加，更高的溫度意味著更高的分子平均動能和單位時間內(nèi)更多的碰撞[26]。如圖1B所示，隨著溫度的升高，清除率快速升高，當(dāng)溫度到45 ℃時，清除率達到最大，為54.1%，因此，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度有利于活性增強。當(dāng)溫度高于45 ℃時，清除率開始下降，原因可能是當(dāng)溫度過高時，VC活性降低并且H2O2部分分解，導(dǎo)致降解多糖的能力降低，清除率下降[27]，因此最適溫度為45 ℃。

如圖1C所示，隨著反應(yīng)時間的延長，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后平緩趨勢，當(dāng)降解時間為3 h時，清除率達到最大值為48.9%。原因可能隨著時間的延長，多糖分子量不再減小或者分子量減小趨勢變緩[27?28]，使DPPH自由基清除率趨于平緩，因此，最適降解時間為3 h。

圖1 褐藻多糖降解單因素實驗結(jié)果Fig.1 Single factor experiment results for degradation of brown algae polysaccharide

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取H2O2-VC濃度、降解溫度和降解時間三個因素，每個因素各取三個水平，結(jié)果如表4所示。由表4可知，各因素對抗氧化活性的影響程度依次為H2O2-VC濃度>降解時間>降解溫度，H2O2-VC的用量對褐藻多糖降解后DPPH清除率影響最大，最佳組合是A2B2C2，即H2O2-VC濃度為20 mmol/L、降解溫度45 ℃、降解時間3 h。隨后進行了最佳組合驗證實驗，所得降解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為61.23%±0.55%，高于正交試驗中的最高值，證明正交試驗結(jié)果有效，此條件下降解產(chǎn)物得率為73.16%。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results

2.3 褐藻多糖降解效果的凝膠電泳分析

利用上述最佳降解條件降解褐藻多糖，通過凝膠電泳分析褐藻多糖的降解效果。圖2為褐藻多糖以及降解產(chǎn)物（降解產(chǎn)物1、2為兩個平行）的電泳結(jié)果。由圖2可知，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現(xiàn)在低分子量區(qū)，說明褐藻多糖中高分子量的組分被降解成相對分子量較低的組分，兩個平行樣品平行性較好。這與Asha等[29]的研究效果一致，證明自由基降解法能夠穩(wěn)定并有效地降解多糖。

圖2 褐藻多糖降解產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig.2 Gel electrophoresis analysis of the degradation products of brown algae polysaccharides

2.4 不同分子量段多糖DPPH自由基清除率對比

通過超濾系統(tǒng)，將降解后的多糖分為S1、S2、S3、S4四種組分，并配制成1%的溶液，各組分多糖DPPH自由基清除率如圖3所示，隨著多糖分子量的減小，DPPH自由基清除率顯著增高（P<0.05），S1（<5 kDa）的DPPH自由基清除率最高，為59.27%±0.99%，與S2、S3、S4以及多糖組差異顯著（P<0.05）。這與支梓鑒[30]研究結(jié)果相似，利用超聲結(jié)合Fe2+和H2O2降解果膠多糖，降解后的果膠多糖具有更強的抗氧化性，且分子量較低的降解多糖抗氧化能力更強。

圖3 不同分子量段多糖DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of polysaccharides with different molecular weight

2.5 不同分子量段多糖保濕性效果對比

由圖4可知，各樣品保濕率隨時間下降，截止60 h，HA的保濕率最高，達到74.61%±0.98%，與S1（73.18%±0.83%）無顯著差異。60 h時，S1、S2、S3、S4的保濕率具有顯著差異（P<0.05），其保濕順序依次為S1>S2>S3>S4（圖5）。屈義等[21]研究顯示，在24 h內(nèi)，殼聚糖分子量越小，其保濕效果越好；Wang等[31]研究發(fā)現(xiàn)低分子量海帶多糖（8 kDa）的保濕效果顯著地強于海帶多糖（87 kDa），甚至比HA效果更好，其可能的原因之一是多糖在降解過程中，糖苷鍵斷裂，使更多的親水基團暴露，更容易與水分子親和；另一方面，低分子多糖的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的保留能力可能更強[32]。

圖4 不同分子量多糖的保濕率Fig.4 Moisture retention of polysaccharides with different molecular weight

2.6 酪氨酸酶抑制活性對比

由圖5可知，1%濃度的S1、S2、S3、S4組分的酪氨酸酶抑制活性均顯著高于褐藻多糖（P<0.05），不同分子量段多糖的酪氨酸酶抑制活性依次為S1>S2>S3>S4，且具有顯著差異（P<0.05）。Park等[33]研究顯示，通過輻射降解得到的褐藻寡糖，其分子量越低，酪氨酸酶抑制活性越強；李玉芬[9]研究結(jié)果表明，褐藻三糖對酪氨酸酶的抑制活性高于褐藻酸鈉。

圖5 不同分子量褐藻多糖對酪氨酸酶的抑制活性Fig.5 Tyrosinase inhibiting activity of polysaccharides with different molecular weight

2.7 單糖組成分析

褐藻多糖降解產(chǎn)物經(jīng)超濾系統(tǒng)分級后的S1組分單糖組成見表5。二者單糖組成和多糖基本相同，主要包括巖藻糖（Fuc），半乳糖（Gal），葡萄糖醛酸（GlcA）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man），甘露糖醛酸（ManA）和葡萄糖（Glc），與多糖相比，S1組分的巖藻糖含量略高，由30.21%升高至32.26%。與多糖相比，其葡萄糖醛酸含量相對減少，由13.44%降至11.43%，有學(xué)者[34?36]同樣發(fā)現(xiàn)降解導(dǎo)致糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，并表明在降解過程中，糖醛酸結(jié)構(gòu)可能變化成內(nèi)酯，從而導(dǎo)致了糖醛酸的損失。

表5 不同分子量褐藻多糖的單糖組成Table 5 Monosaccharide composition of low molecular weight brown algal oligosaccharides

2.8 S1組分分子量分布的測定

經(jīng)過超濾系統(tǒng)分級后得到S1組分（<5 kDa），經(jīng)過GPC-十八角激光光散射儀測定后，分子量分布見圖6、表6。結(jié)果表明S1組分主要含有五個組分，分子量分別為4.126×103、2.968×103、2.140×103、1.768×103、1.006×103Da，以4.126×103和2.140×103Da的組分為主。其中2.140×103Da含量最高，達到29.6%，其次是4.126×103Da組分，占比為24.1%。后續(xù)可以研究哪個組分在抑制酪氨酸酶活性上發(fā)揮了決定性作用，進一步揭示構(gòu)效關(guān)系。

圖6 S1組分的分子量分布圖Fig.6 Molecular weight distribution diagram of S1

表6 S1組分的分子量及含量Table 6 Molecular weight and content of S1

3 結(jié)論

本研究以DPPH自由基清除率為評價指標(biāo)，建立了以H2O2-VC自由基法降解褐藻多糖的方法，正交試驗優(yōu)化得到最佳降解條件為H2O2-VC濃度為20 mmol/L、降解溫度45 ℃以及降解時間3 h，最佳條件下降解產(chǎn)物得率為73.16%，DPPH自由基清除率為61.23%。凝膠電泳結(jié)果表明，降解后的褐藻多糖的條帶明顯出現(xiàn)在低分子量區(qū)，說明該降解法穩(wěn)定并有效。通過超濾系統(tǒng)將此產(chǎn)物降解分為<5 kDa、5~10 kDa、10~30 kDa、>30 kDa四段，DPPH自由基清除率、保濕性、以及酪氨酸酶抑制活性研究表明，<5 kDa分子量段的組分的活性顯著高于其它組分（P<0.05）。進一步測定了<5 kDa分子量段組分的單糖組成與分子量分布，結(jié)果表明，與多糖相比，該組分的巖藻糖含量略高，葡萄糖醛酸含量相對減少；經(jīng)測定，該組分主要含有五個組分，其中2.140×103Da含量最高，達到29.6%，其次是4.126×103Da組分，占比為24.1%。研究結(jié)果可為低分子量褐藻多糖的在功能性食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，下一步可以在低分子量褐藻多糖的構(gòu)效關(guān)系方面開展更深入的研究。