銀耳多糖對淀粉消化酶的抑制作用及其機理研究

杜沁嶺，楊 芳,2，徐 文，繆 婷，曹俊杰，賈冬英,

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065；2.百事食品（中國）有限公司，上海 200023；3.成都巨龍生物科技股份有限公司，四川成都 611131）

多糖是銀耳的主要活性成分，占其干重的60%~70%，具有抗衰老[1]、降血糖[2]、降血脂[3]、調(diào)節(jié)免疫[4]等作用，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[5]。小腸內(nèi)淀粉的消化是在兩種淀粉消化酶，即α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的催化下逐步水解成葡萄糖的過程，其中前者可催化淀粉水解成麥芽糖、α-極限糊精和少量葡萄糖，是淀粉水解的先決條件；后者可將麥芽糖和α-極限糊精進一步水解成為葡萄糖，是控制葡萄糖釋放的關(guān)鍵酶[6]。因此，抑制淀粉消化酶就能減少食物中淀粉的消化，延緩餐后血糖的升高。研究表明，活性多糖可通過抑制α-淀粉酶和α-葡糖糖苷酶的活性降低淀粉消化速率[7?8]。

動物實驗研究結(jié)果顯示，銀耳多糖（Tremella fuciformispolysaccharide, TP）具有降血糖作用。Cho等[9]研究表明銀耳胞外多糖可顯著降低小鼠的血糖水平，提高其口服葡萄糖耐量，激活PPAR-γ的表達；銀耳胞外多糖可能通過調(diào)節(jié)PPAR-γ-介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝發(fā)揮明顯的降血糖和增強胰島素敏感性的作用。田春雨等[10]研究了銀耳多糖對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響，發(fā)現(xiàn)該多糖可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平，并能緩解糖尿病所引起的多食、多尿、體重減輕等癥狀。然而，目前有關(guān)銀耳多糖的降血糖作用機制尚不明確，并且關(guān)于其延緩淀粉體外消化的研究也鮮見報道?；诖?，本文中研究了銀耳多糖對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用，分析了其對該兩種酶結(jié)構(gòu)的影響和可能的抑制作用機理。研究結(jié)果既可豐富銀耳多糖的降血糖作用理論，還能為其精細化利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干銀耳 福建古田袋料栽培銀耳，市售；葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)品（分子量范圍2.5~5348 kDa） 色譜純，美國Sigma公司；牛血清蛋白 上海阿拉丁試劑有限公司；瓜爾膠 山東廣浦生物科技有限公司；豬胰α-淀粉酶（>10 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（50 U/mg） 上海源葉生物科技公司；DEAE纖維素-52、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG） 北京索萊寶科技公司；其它化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV6000PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Synergy H1型全功能微孔板檢測儀 美國Biotek公司；F-7000熒光分光光度計 日立高新技術(shù)公司；J-1500-150型圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀耳多糖的制備 參考并適當(dāng)修改Lu等[11]報道的堿法提取銀耳多糖。將1.0 g干銀耳放入80 mL的去離子水中，于室溫下浸泡20 min后打漿，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整其pH至12.0，50 ℃下提取4 h，過濾后以8000 r/min離心15 min，收集上清液。在25 mL上清液中加入3%（w/v）木瓜蛋白酶，混勻后以1 mol/L HCl調(diào)節(jié)其pH至6.5，于55 ℃下酶解2 h，沸水浴10 min，冷卻至室溫后于8000 r/min離心20 min，將所得上清液依次進行透析、濃縮、醇沉和真空干燥，得到脫蛋白銀耳多糖。將其配制成濃度為5 mg/mL溶液，取10 mL上樣，采用DEAE-52柱層析對其進行純化，先用去離子水洗脫，然后依次以0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫，收集峰面積最大的洗脫液，將其合并后依次進行透析、真空濃縮、冷凍干燥，得到白色絮狀的純化銀耳多糖（TP）。經(jīng)測定，TP總糖含量為92.45%，蛋白質(zhì)含量為0.22%。

1.2.2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用的測定 適當(dāng)修改Ademiluyi等[12]的方法測定TP對α-淀粉酶活性的抑制作用。移取不同濃度TP溶液（1、2、4、6、8和10 mg/mL）100 μL，加入1%（w/v）馬鈴薯淀粉溶液100 μL，于25 ℃孵育10 min后加入0.5 mg/mL胰α-淀粉酶溶液100 μL，繼續(xù)孵育10 min，振蕩后加入3,5-二硝基水楊酸試劑200 μL，沸水浴5 min，冷卻至室溫后加入去離子水2 mL，混勻后測定反應(yīng)液在540 nm處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對照。按照以下公式計算樣品對胰α-淀粉酶的抑制率。

將Li等[13]的方法適當(dāng)修改后測定TP對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。移取不同濃度TP溶液（1、2、4、6、8和10 mg/mL）40 μL，加入0.1 U/Lα-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混勻后于37 ℃孵育5 min，加入5 mmol/L PNPG溶液20 μL，混勻后繼續(xù)孵育30 min，加入0.2 mol/L碳酸鈉溶液50 μL，混勻后室溫孵育5 min，測定反應(yīng)液在405 nm處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對照。按照以下公式計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

樣品對該兩種酶的抑制率計算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光度；A2為樣品背景組吸光度（以等體積0.1 mol/L、pH6.9磷酸鹽緩沖液PBS替代酶液）；A3為對照組吸光度（以等體積PBS替代樣品液）；A4為對照背景組吸光度（以等體積PBS替代樣品和酶液）。

1.2.3 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用及其結(jié)合位點測定 參考并適當(dāng)修改的Jin等[14]報道的方法測定TP對胰α-淀粉酶熒光猝滅作用。以20 mmol/L PBS（pH6.9）配制濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶溶液，使用0.2 μm水系濾膜過濾后取3份2 mL酶液，分別將其與8 mL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL）混勻，得到混合液1。

參考并適當(dāng)修改的Wang等[7]報道的方法測定TP對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅作用。以20 mmol/L PBS（pH6.9）配制濃度為0.75 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，將3份1.5 mL酶液分別與1.5 mL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL）混勻后于30 ℃下孵育10 min，得到混合液2。

設(shè)置激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5 nm，分別記錄上述2種混合液在300~400 nm范圍的熒光光譜。

TP與酶之間的猝滅效率符合Stern-Volmer方程[15]：

式中：F0和F分別為酶與TP作用前后的熒光強度；[Q]為TP濃度（mol/L）；Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)；Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τ0為無猝滅劑熒光物質(zhì)的平均壽命，約為10?8s。

TP與酶之間的結(jié)合位點數(shù)（n）通過以下公式計算：

式中：F0和F分別為酶與TP作用前后的熒光強度；Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)；C為TP濃度。

1.2.4 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)的影響 參考并適當(dāng)修改Wang等[7]報道的方法。分別吸取100 μL的5 mg/mL胰α-淀粉酶和1.4 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，加入100 μL不同濃度TP溶液（2、4和8 mg/mL），混勻后于37 ℃孵育15 min，得到待測樣品。采用圓二色光譜儀在190~250 nm范圍內(nèi)對待測樣品進行掃描，橫坐標(biāo)為波長（nm），縱坐標(biāo)為圓二色性（mdeg），繪制色譜圖譜，并計算兩種酶的二級結(jié)構(gòu)含量變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

小腸中淀粉的消化先經(jīng)由胰α-淀粉酶將其水解為麥芽糖、α-極限糊精和少量葡萄糖，然后麥芽糖和α-極限糊精進一步被小腸細胞分泌的α-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。因此，胰α-淀粉酶是淀粉消化的先行條件，其活性高低可影響淀粉消化反應(yīng)進程。阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床用于輔助治療糖尿病的一種有效藥物，可通過減少小腸對消化產(chǎn)物葡萄糖的釋放來降低患者的餐后血糖水平[16]。

TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用如圖1所示。可以看出，隨著TP濃度升高，其對該兩種淀粉消化酶的抑制作用逐漸增大，尤其是對胰α-淀粉酶活性的抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。該結(jié)果與麥麩多糖[17]和番荔枝多糖[18]對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用相似。本實驗中提取的銀耳多糖主要由甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖等單糖構(gòu)成，并且其阿拉伯糖和木糖含量豐富，該兩種單糖可較好抑制α-葡萄糖苷酶活性[19]。

圖1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of TP on pancreatic α-amylase and α-glucosidase

將TP濃度與其對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率進行擬合，得到擬合方程，計算其50%抑制作用濃度（IC50），結(jié)果見表1?？梢钥闯觯琓P對胰α-淀粉酶的IC50為7.6835 mg/mL，略高于阿卡波糖（5.1870 mg/mL），但明顯低于桑葚多糖[20]（>19.31 mg/mL）；對α-葡萄糖苷酶的IC50為16.9306 mg/mL，顯著（P<0.05）高于阿卡波糖（0.2 μg/mL）。這說明TP是良好的胰α-淀粉酶抑制劑，其對胰α-淀粉酶的抑制作用明顯強于α-葡萄糖苷酶。阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率顯著（P<0.05）高于TP，這可能與二者對該酶的結(jié)合位點不同有關(guān)。α-葡萄糖苷酶上具有與寡糖及雙糖相結(jié)合的位點，阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似于寡糖，因此可競爭性地與α-葡萄糖苷酶上的結(jié)合位點結(jié)合而抑制其活性，是一種特異性葡萄糖苷酶抑制劑[21]。TP是一種多糖組分，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用位點不同于阿卡波糖。有關(guān)TP與該酶的具體結(jié)合位點還有待于進一步探討。

表1 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制作用濃度（IC50）Table 1 Half maximal inhibition concentrations of TP on pancreatic α-amylase and α-glucosidase (IC50)

綜上所述，TP可抑制胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，并且其對前者的抑制作用明顯強于后者，這樣就能有效抑制淀粉消化的起始速率。

2.2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在賦予淀粉消化酶內(nèi)源熒光性，其中色氨酸與酪氨酸殘基在280 nm波長時被激發(fā)，并且這兩種殘基所處的微環(huán)境還會影響其產(chǎn)生的熒光強度與位置[22]。

不同濃度TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶內(nèi)源熒光強度的影響如圖2所示。在發(fā)射波長為300~400 nm時，胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均具有較強的熒光強度，最大發(fā)射峰在340 nm附近。隨著TP濃度增大，該兩種酶的熒光強度逐漸降低，其中胰α-淀粉酶的變化更為顯著，且發(fā)生紅移，這與曾傲瓊[23]關(guān)于條斑紫菜多糖的研究結(jié)果一致。說明胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光主要源于其中的色氨酸和酪氨酸殘基，TP可與胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸殘基發(fā)生靜電引力或氫鍵作用，改變胰α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其活性降低，但其對α-葡萄糖苷酶的作用則較微弱[24]。TP與胰α-淀粉酶的相互作用引起酶中色氨酸或酪氨酸殘基的極性變化，微環(huán)境由親水性變?yōu)槭杷?，?dǎo)致熒光氨基酸殘基發(fā)生去折疊和熒光猝滅[25]。此外，隨著TP濃度增加，胰α-淀粉酶的熒光曲線發(fā)生了紅移，說明TP對該酶的構(gòu)象中其它部分也產(chǎn)生了影響。

圖2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用Fig.2 Fluorescence quenching effects of TP on pancreatic αamylase and α-glucosidase

2.3 TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅類型

熒光猝滅作用可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，其中動態(tài)猝滅是由于酶與猝滅劑因熱運動相互碰撞而引起。假定TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅作用為動態(tài)猝滅，其猝滅常數(shù)Ksv為5.3094×1010L/mol，雙分子猝滅過程速率常數(shù)Kq為5.3094×1018L/mol·s，遠大于最大碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/mol·s。因此，TP對胰α-淀粉酶的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，由此可推斷TP與胰α-淀粉酶可能通過靜電引力或氫鍵等非共價鍵產(chǎn)生相互作用并形成復(fù)合物，這可能與TP提高粘度、延緩或減少胰α-淀粉酶與底物淀粉的接觸有關(guān)。

2.4 TP與胰α-淀粉酶結(jié)合位點數(shù)

靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)發(fā)生相互作用、形成基態(tài)的猝滅劑-熒光物質(zhì)復(fù)合物的過程。通過公式計算出TP與胰α-淀粉酶結(jié)合位點數(shù)n=1.2334，接近1，表明TP與胰α-淀粉酶存在1個結(jié)合位點。由于胰α-淀粉酶分子中具有ASP197、GLU233和ASP300多個重要活性位點[26]，因此關(guān)于二者具體結(jié)合位點尚待進一步研究。

2.5 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)的影響

圓二色光譜是一種可定量的光譜技術(shù)，能靈敏反映蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化，已被廣泛用于蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究[27]。不同濃度TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示?？梢钥闯?，TP可導(dǎo)致兩種消化酶的圓二色譜峰高和峰形發(fā)生變化。其中，胰α-淀粉酶組在200 nm處峰形明顯高于空白組，在215 nm處峰形則明顯低于空白組，而α-葡萄糖苷酶組峰形與空白組相比變化則不明顯。隨著TP濃度的增加，該兩種酶在215 nm處的圓二信號強度增大，胰α-淀粉酶組變化明顯，說明TP的添加對胰α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，而對α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)影響不明顯。

圖3 TP與胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用的圓二色譜圖Fig.3 Circular dchroism spectra of interactions between TP and pancreatic α-amylase and α-glucosidase

胰α-淀粉酶由496個氨基酸殘基、1個鈣離子、1個氯離子和3個水分子組成[28]，其中100~168號氨基酸組成了8個α-螺旋和8個β-折疊交替出現(xiàn)的（β/α）8的結(jié)構(gòu)模體，且該酶的活性中心位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中[29]。采用CDPro軟件處理數(shù)據(jù)，通過SELCON3算法得到該酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的相對含量，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯STP濃度升高，胰α-淀粉酶中的α-螺旋和β-折疊比例增加，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲比例減少。α-螺旋比例逐漸增大，不利于酶活性中心形成，從而限制酶與底物的結(jié)合，使其進一步失去活性。這與條斑紫菜多糖[23]對胰α-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)影響的研究結(jié)果一致。α-螺旋和β-折疊中含有大量氫鍵，二者共同維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的剛性。TP導(dǎo)致胰α-淀粉酶中的β-折疊增多，從而增強酶的剛性[30]。此外，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲比例減少則表明酶的柔性減弱。

表2 TP對胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of TP on the secondary structures of pancreatic α-amylase and α-glucosidase

由表2可知，加入TP后α-葡萄糖苷酶的各構(gòu)象比例變化很小，說明TP對該酶構(gòu)象影響不大。由此推測，TP與α-葡萄糖苷酶的相互作用微弱，對其二級結(jié)構(gòu)影響極小。

3 結(jié)論

TP能夠抑制胰α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，且其對前者的抑制作用顯著強于后者。TP與胰α-淀粉酶的結(jié)合位點數(shù)為1，二者之間發(fā)生了靜態(tài)猝滅作用，這種猝滅作用改變了胰α-淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)，使其剛性增強、柔性減弱，結(jié)構(gòu)變得更為緊密，影響了酶活性中心的形成，從而抑制了該酶的活性。TP與α-葡萄糖苷酶之間發(fā)生了微弱的相互作用，這種作用對該酶的二級結(jié)構(gòu)影響甚微。TP可通過抑制淀粉消化酶的活性影響淀粉的消化，延緩葡萄糖的釋放。本研究結(jié)果可為銀耳多糖在降血糖保健食品和藥品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。