基于光譜和分子模擬研究半乳甘露聚糖和人血清白蛋白的相互作用

王靖蕊，彭佳敏，代 成，李 雁，解新安

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

半乳甘露聚糖（C18H32O16，Galactomannan）是一種由D-甘露糖和D-半乳糖單體組成的多糖[1]，主要來源于種子的胚乳（例如豆科）或微生物[2]。有研究表明半乳甘露聚糖具有抗腫瘤[3]和對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生影響的免疫調(diào)節(jié)活性[4]，對(duì)參與人體先天性和獲得性免疫的重要免疫細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用[5]。它還可以與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合以激活各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞因子或抗體的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)人體的免疫功能[6]。作為一種功能性多糖，由于其特殊的抗腫瘤性和免疫調(diào)節(jié)功能，使得其受到越來越多研究學(xué)者的關(guān)注[7]。

人血清白蛋白（Human Serum Albumin, HSA）是一條由585個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽鏈[8]，分子量約為66 kDa[9]，其形狀類似于心型[10]。HSA共有3個(gè)同源結(jié)構(gòu)域[11]，分別為Domain Ⅰ（1-195）、DomainⅡ（196-383）、Domain Ⅲ（384-585）[12?13]。每個(gè)結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步分為兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（IA，IB，IIA，IIB，IIIA和IIIB），其中的亞域以槽口相對(duì)的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)[14]，幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒腔內(nèi)，形成疏水腔[15]。HSA在各種外源和內(nèi)源性化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和遞送，以及物質(zhì)的排泄中起著重要作用[16]，是人體內(nèi)最合適的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]。研究半乳甘露聚糖與HSA結(jié)合，不僅有利于了解半乳甘露聚糖在人體的吸收、運(yùn)輸、分布和代謝[18]，闡明它們相互作用的機(jī)制，而且對(duì)于探索功能性多糖的性質(zhì)具有重要意義。

為了進(jìn)一步研究半乳甘露聚糖與HSA作用機(jī)理，本文采用紫外-可見光吸收法（Ultraviolet-visible absorption spectroscopy, UV-Vis）、熒光光譜法（Fluorescence spectrometry, RF）、圓二色光譜法（Circular dichroism spectroscopy, CD）和分子對(duì)接法（Molecular docking），探索半乳甘露聚糖與HSA相互作用的機(jī)理。其中，紫外-可見光吸收法靈敏度和選擇性較好，且設(shè)備使用簡(jiǎn)便，易于操作，它被廣泛地用于蛋白質(zhì)的定性及定量分析[19]。通過分析蛋白質(zhì)與分子結(jié)合前后，蛋白質(zhì)的紫外可見光吸收光譜中吸光值的變化，能判斷它們之間是否存在相互作用[20]。在研究蛋白質(zhì)與分子的相互作用過程中，熒光光譜可以測(cè)定熒光強(qiáng)度、發(fā)射光譜等[21]，得到如熒光的發(fā)射峰的特征、結(jié)合常數(shù)、猝滅常數(shù)和作用力類型等信息，從而分析結(jié)合前后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)周圍環(huán)境的變化等[22?23]。圓二色光譜對(duì)于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)很敏感，是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象及其變化較為有效的方法，能夠測(cè)定和分析相互作用過程中所引起的構(gòu)象變化并對(duì)其進(jìn)行定量分析，是研究蛋白質(zhì)構(gòu)型及其分子間相互作用的重要光譜手段之一[24?25]。分子對(duì)接是一種利用計(jì)算機(jī)技術(shù)和理論相結(jié)合而產(chǎn)生的新方法，通過計(jì)算機(jī)程序模擬分子間的結(jié)合過程，能更觀地呈現(xiàn)出分子與蛋白質(zhì)相互作用的過程和結(jié)果[26?27]。本實(shí)驗(yàn)通過分析光譜所得參數(shù)，計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)和猝滅常數(shù)等信息。利用三種光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行分析比較，使它們的結(jié)論相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，從而達(dá)到實(shí)驗(yàn)和理論共同驗(yàn)證半乳甘露聚糖和HSA相互作用的目的。進(jìn)一步闡明半乳甘露聚糖與HSA相互作用的機(jī)理，為半乳甘露聚糖在醫(yī)學(xué)和食品化學(xué)的發(fā)展提供可靠的科學(xué)依據(jù)，并為半乳甘露聚糖在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸鹽緩沖液顆粒（PBS）（分析純）、人血清白蛋白（純度>95%） 北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉 分析純，廣東光華科技股份有限公司；半乳甘露聚糖 純度>95%，上海源葉生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水。

FA1004N分析天平 上海拓西電子科技有限公司；HJ-6B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州市萬合儀器制造有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；UV-1750紫外可見分光光度計(jì)、RF-6000熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；Chriascan數(shù)字式圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司；pHS-3C pH計(jì) 上海雷磁儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 HSA溶液：將HSA溶于PBS緩沖溶液中，配制成濃度7.0×10?6mol/L的HSA儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱保存在暗處備用；半乳甘露聚糖溶液：用超純水配制，濃度分別為0.5、4.0、8.0、10.0、20.0、34.0、52.0、76.0×10?6mol/L。然后按照1:1的比例混合HSA溶液與半乳甘露聚糖溶液，室溫下靜置0.5 h后使用，所有溶液現(xiàn)配現(xiàn)用[28?29]。

1.2.2 紫外可見吸收光譜 取3組試管每組9支，精密量取3 mL濃度為7.0×10?6mol/L的HSA溶液置于其中，再向其中依次加入等比的半乳甘露聚糖溶液濃度分別為0、0.5、4.0、8.0、10.0、20.0、34.0、52.0×10?6mol/L，最后一組只含有半乳甘露聚糖濃度為76.0×10?6mol/L，充分混勻后，在室溫下靜置0.5 h。以相同條件下的空白試劑（PBS緩沖溶液）為參比，放在1 cm石英吸收池內(nèi)，在200~400 nm區(qū)間內(nèi)，單色器狹縫寬度設(shè)置為1 nm，在室溫下使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描[30]。以上操作重復(fù)三次，取其平均值。

1.2.3 熒光光譜 取3組試管每組9支，分別加入7.0×10?6mol/L的HSA溶液和等比的半乳甘露聚糖溶液，濃度分別為0、0.5、4.0、8.0、10.0、20.0、34.0、52.0×10?6mol/L，最后一組只含有濃度為76.0×10?6mol/L半乳甘露聚糖。充分混勻后，將第一組混合溶液于20 ℃靜置0.5 h，第二組于25 ℃恒溫水浴0.5 h，第三組于30 ℃恒溫水浴0.5 h，第四組于37 ℃恒溫水浴0.5 h，使用熒光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。熒光光譜參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm，石英比色皿1 cm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，發(fā)射光譜記錄在290~500 nm之間，以相同條件下的空白試劑（PBS緩沖溶液）作為對(duì)照[31?32]。以上操作重復(fù)三次，取其平均值。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)濾熒光效應(yīng)的校正，使用校正后的數(shù)據(jù)作圖。

1.2.4 圓二色光譜 用pH7.40的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為7.0×10?6mol/L的HSA溶液，依次向溶液中加入等量的半乳甘露聚糖溶液，濃度分別為0、0.5、4.0、8.0、10.0、20.0、34.0、52.0、76.0×10?6mol/L，充分混勻后，在室溫下靜置0.5 h，使用圓二色光譜儀進(jìn)行光譜掃描。圓二色光譜參數(shù)設(shè)置為，掃描速率100 nm/min，樣品池的光徑為0.2 cm，響應(yīng)時(shí)間0.5 s，分辨率0.1 nm，累積次數(shù)3次，掃描的波長(zhǎng)范圍為190~260 nm[33?34]。以上操作重復(fù)三次，取其平均值。

1.2.5 分子對(duì)接 使用軟件Discovery Studio 2016（DS）進(jìn)行分子對(duì)接模擬，首先從Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（RCSB）下載HSA的晶體結(jié)構(gòu)文件（ID：1H9Z）；再從PubChem下載半乳甘露聚糖的3D晶體結(jié)構(gòu)文件（CID：439336）。對(duì)HSA進(jìn)行預(yù)處理，除去所有水分子，添加氫原子，再計(jì)算電荷。利用ChemBio3D Ultra 12.0軟件對(duì)半乳甘露聚糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，使其處于能量最低、構(gòu)象最優(yōu)的狀態(tài)。使用DS中的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接，半乳甘露聚糖作為配體，HSA作為受體，選擇整個(gè)蛋白作為潛在的結(jié)合位點(diǎn)，使用盲對(duì)接方法。根據(jù)所得-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值判定最優(yōu)構(gòu)象。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文運(yùn)用軟件Excel和Origin 2018計(jì)算光譜實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及畫圖，獲得半乳甘露聚糖與HSA相互作用的猝滅機(jī)理、結(jié)合常數(shù)、猝滅常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)。使用軟件CDPro分析圓二色光譜數(shù)據(jù)，得到相互作用前后HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外可見吸收光譜分析

紫外可見吸收光譜法是一種簡(jiǎn)單有效的技術(shù)，可以判斷配體-蛋白質(zhì)之間是否有新的復(fù)合物形成，還可以檢測(cè)配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合而引起的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，因此它可以用于研究配體與蛋白質(zhì)的相互作用[35]。半乳甘露聚糖和HSA的UV-Vis光譜如圖1所示。在實(shí)驗(yàn)條件下，半乳甘露聚糖幾乎沒有UV吸收，而HSA在227和278 nm處具有很強(qiáng)的吸收率。半乳甘露聚糖添加后，HSA的吸光度明顯下降，半乳甘露聚糖-HSA吸收光譜發(fā)生藍(lán)移?？梢院侠淼亟忉?，在227 nm處的峰對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)中肽鍵的吸收，觀察到的藍(lán)移表示與半乳甘露聚糖相互作用后HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的減色效果，使吸收強(qiáng)度減弱[36]。HSA在278 nm處顯示的吸收帶，主要是由HSA固有芳香族氨基酸殘基——色氨酸殘基（Trp）、酪氨酸殘基（Tyr）和苯丙氨酸殘基（Phe）的芳香π系統(tǒng)中的π-π*電子躍遷，這與陳蓉蓉[37]的研究結(jié)果相一致。

圖1 HSA和半乳甘露聚糖相互作用的UV-Vis光譜圖Fig.1 UV-Vis spectrum of the interaction between HSA and galactomannan

2.2 熒光光譜分析

HSA具有三種固有的熒光團(tuán)，包括Trp、Tyr和Phe殘基。HSA的固有熒光主要由Trp殘基貢獻(xiàn)，因?yàn)镻he殘基的量子產(chǎn)率非常低。當(dāng)Tyr離子被氨基、羧基或Trp接近或離子化時(shí)，Tyr的熒光幾乎被猝滅[38]。由于HSA的固有熒光對(duì)微環(huán)境非常敏感，所以當(dāng)HSA的局部環(huán)境稍有變化時(shí)，其固有熒光將顯著降低。如蛋白質(zhì)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，生物分子的結(jié)合以及變性等都是造成熒光強(qiáng)度下降的原因[39]。

四種溫度下，HSA的熒光發(fā)射光譜如圖2所示，HSA的最大發(fā)射波長(zhǎng)為328 nm，半乳甘露聚糖的加入引起熒光發(fā)射光譜的巨大變化，隨著半乳甘露聚糖加入的濃度增大，導(dǎo)致HSA內(nèi)源熒光的猝滅，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出有規(guī)律的下降。半乳甘露聚糖導(dǎo)致HSA固有熒光的猝滅，但沒有改變HSA的最大值和峰的形狀。根據(jù)張麗嬌[40]的研究，該結(jié)果表明半乳甘露聚糖可以與HSA結(jié)合，從而猝滅蛋白質(zhì)的固有熒光。

圖2 四種不同溫度下HSA和半乳甘露聚糖相互作用的熒光光譜圖Fig.2 RF spectrum of the interaction between HSA and galactomannan at 4 different temperature

用于研究熒光猝滅的一種經(jīng)典模型名為斯特恩沃爾默（Stern-Volmer）方程（1），可分析配體對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅機(jī)理，以計(jì)算出配體與蛋白質(zhì)的猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點(diǎn)數(shù)[41]。利用（1）方程和推導(dǎo)公式（2）計(jì)算雙分子猝滅速率常數(shù)Kq和猝滅常數(shù)KSV，判斷半乳甘露聚糖對(duì)HSA的熒光猝滅類型；采用雙對(duì)數(shù)方程（3）計(jì)算半乳甘露聚糖與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。計(jì)算公式如下：

式中：F0是不存在猝滅劑時(shí)的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度；F是存在猝滅劑時(shí)的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度；KSV是斯特恩-沃爾默猝滅常數(shù)；[Q]是猝滅劑的濃度；kq是雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0是不存在猝滅劑的熒光壽命，此處為不含半乳甘露聚糖的HSA的熒光壽命，約為10?8s[42]。

計(jì)算結(jié)果如圖3和表1，隨著半乳甘露聚糖的加入，HSA熒光強(qiáng)度顯著降低，吸收光譜有了明顯的變化，并且其最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生微小藍(lán)移，表明半乳甘露聚糖對(duì)HSA的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，也說明半乳甘露聚糖與HSA發(fā)生了相互作用使其構(gòu)象發(fā)生改變[43]。結(jié)合Yadzi等[44]的研究，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)Ksv減小，表明半乳甘露聚糖與HSA的熒光猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅。而且從表1可以看出，Kq大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)（2.0×1010L·mol?1·s?1），這也能表明靜態(tài)猝滅作用占主導(dǎo)地位。

圖3 四種不同溫度下HSA和半乳甘露聚糖相互作用的斯特恩沃爾默圖Fig.3 Stern-Volmer plots for the quenching of HSA by galactomannan at 4 different temperatures

表1 HSA與半乳甘露聚糖在四種不同溫度下相互作用的猝滅常數(shù)KSV、猝滅速率常數(shù)KqTable 1 Quenching constants KSV, and biomolecular quenching rate constant (Kq) for the interaction of HSA with galactomannan at 4 different temperatures

使用改良的Stern-Volmer雙對(duì)數(shù)回歸方程（3）來計(jì)算半乳甘露聚糖與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）。計(jì)算公式如下：

式中：Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

四種溫度下半乳甘露聚糖與HSA相互作用的雙對(duì)數(shù)結(jié)果見圖4。半乳甘露聚糖與HSA相互作用的Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n見表2。由圖4和表2可知，隨著溫度的升高，半乳甘露聚糖與HSA相互作用的Ka值雖然從1.069×106減小到1.191×105L/mol，但它們均達(dá)到104數(shù)量級(jí)，這說明半乳甘露聚糖與HSA相互作用的熒光猝滅類型均以靜態(tài)猝滅為主，動(dòng)態(tài)猝滅可以忽略不計(jì)[45]，也能進(jìn)一步說明半乳甘露聚糖與HSA能形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這與Afrin[46]所得結(jié)論一致。從表2可知，不同溫度條件下，半乳甘露聚糖與HSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均接近1，說明它們的結(jié)合比例約為1:1[47]。

表2 HSA與半乳甘露聚糖在四種不同溫度下相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Binding constants Ka and binding sites n for the interaction of HSA with galactomannan at four different temperatures

圖4 四種不同溫度下HSA和半乳甘露聚糖相互作用的雙對(duì)數(shù)圖Fig.4 Double logarithmic plot of the interaction between HSA and galactomannan at 4 different temperatures

然后使用熱力學(xué)方程（4）和（5）分別計(jì)算半乳甘露聚糖與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)（自由能變?chǔ)，焓變?chǔ)和熵變?chǔ)）。計(jì)算公式如下：

式中：T為熱力學(xué)溫度（K）；Ka為不同溫度下相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)；R是熱力學(xué)常數(shù)，其值為8.314 J·mol?1·K?1；ΔG是自由能變；ΔH是焓變；ΔS是熵變[46?47]。

通過熱力學(xué)方程（4）和（5）計(jì)算半乳甘露聚糖與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG見表3。由表3可知，不同溫度條件下（293.15、298.15、303.15和310.15 K），半乳甘露聚糖與HSA相互作用過程中的ΔG分別為?33.027、?31.922、?30.816和-29.269 kJ/mol，均小于0，則說明半乳甘露聚糖與HSA的結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。根據(jù)Eftink等[48?50]研究可知，當(dāng)ΔH<0，ΔS<0時(shí)，主要作用力為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔH<0或ΔH≈0，ΔS>0時(shí)，主要作用力為靜電作用力；當(dāng)ΔH>0，ΔS>0時(shí)，主要作用力為疏水相互作用。半乳甘露聚糖與HSA相互作用的ΔS和ΔH值分別 為?221.061 J/mol·K?1和?97.831 kJ/mol，均小于0，這說明半乳甘露聚糖與HSA相互作用過程中的主要作用力為氫鍵和范德華力。

表3 HSA與半乳甘露聚糖在四種不同溫度下相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interaction between HSA and galactomannan at 4 different temperatures

2.3 圓二色光譜分析

圓二色光譜是一種敏感的技術(shù)，通常用于表征蛋白質(zhì)的定量結(jié)構(gòu)，特別是用于二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，以監(jiān)測(cè)HSA和HSA-半乳甘露聚糖復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化和改變[51]。HSA的CD光譜的主要特征是在約208和222 nm處有兩個(gè)負(fù)帶和在193 nm處有正帶，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征[52]。從圖5可以看出，CD光譜的峰值隨著半乳甘露聚糖的添加而變化，表明HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。通過軟件CD Pro計(jì)算半乳甘露聚糖添加前后HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化，發(fā)現(xiàn)游離的HSA包含約54.4%的α-螺旋，18.8%的β-折疊，14.0%的β-轉(zhuǎn)角和13.3%的無規(guī)卷曲。而與10.0 μmol/L的半乳甘露聚糖相互作用后，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量分別增加到21.4%、15.4%和16.8%，而α-螺旋減少到46.7%。然而，CD譜圖中的形狀或峰位置沒有變化，這表明和半乳甘露聚糖結(jié)合后HSA的基本結(jié)構(gòu)得以保持。HSA的部分排列導(dǎo)致了α-螺旋的減少，這表明半乳甘露聚糖和HSA的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并降低了α-螺旋的穩(wěn)定性[53]。這與很多研究結(jié)果相一致[54?56]，HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，α-螺旋的含量減少，無規(guī)卷曲的含量增加，這主要是由于多糖和蛋白質(zhì)的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)解開并轉(zhuǎn)變成無規(guī)卷曲。

圖5 HSA和半乳甘露聚糖相互作用的CD光譜圖Fig.5 Circular dichroism spectra of the interaction between HSA and galactomannan

2.4 分子對(duì)接分析

在圖6中，分子對(duì)接結(jié)果表明半乳甘露聚糖結(jié)合在HSA的亞結(jié)構(gòu)域IIB的結(jié)合口袋內(nèi)。根據(jù)CDOCKER協(xié)議，給出最高能量得分（-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY）的姿勢(shì)被認(rèn)為是最穩(wěn)定的構(gòu)象，半乳甘露聚糖與HSA的最大-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY為13.3549 kcal/mol。

圖6 HSA和半乳甘露聚糖相互作用的分子對(duì)接圖Fig.6 Molecular docking diagram of the interaction between HSA and galactomannan

輸出的3D和2D示意圖（圖6）清楚地表明，半乳甘露聚糖已插入HSA的活性位點(diǎn)并與氨基酸殘基相互作用，它與氨基酸殘基Pro 379、Leu 380、Thr 352和Glu 376相互作用，這是半乳甘露聚糖與HSA之間的相互作用位點(diǎn)。在半乳甘露聚糖和Glu 376氨基酸殘基之間發(fā)現(xiàn)了氫鍵和范德華力，其長(zhǎng)度為3.49?和5.26?，表明HSA-半乳甘露聚糖主要通過氫鍵和范德華力（表4）相互作用形成新的穩(wěn)定配合物。通過圖6A~6B，比較結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)，可以推斷半乳甘露聚糖和HSA的構(gòu)象在相互作用后都發(fā)生了不同程度的變化。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化與2.2中討論的熱力學(xué)參數(shù)分析一致。結(jié)合Ermakova等[57]、Chugh等[58]的研究以及對(duì)接結(jié)果的分析，可以得出結(jié)論，半乳甘露聚糖和HSA的相互作用發(fā)生在HSA亞結(jié)構(gòu)域IIB內(nèi)，主要結(jié)合作用力為氫鍵和范德華力。

表4 參與HSA與半乳甘露聚糖分子對(duì)接的氨基酸殘基以及作用力類型Table 4 Types of molecular docking force and amino acid residue between HSA and galactomannan

3 結(jié)論

本文利用光譜法和分子對(duì)接技術(shù)，研究了半乳甘露聚糖與HSA的結(jié)合機(jī)理及HSA構(gòu)象的變化。結(jié)果表明：半乳甘露聚糖的加入會(huì)導(dǎo)致HSA的特征吸收峰強(qiáng)度和吸光度發(fā)生改變，還伴隨著藍(lán)移。半乳甘露聚糖會(huì)導(dǎo)致HSA的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，結(jié)合比例約為1:1，其結(jié)合常數(shù)遠(yuǎn)大于104數(shù)量級(jí)，說明半乳甘露聚糖能與HSA較好的相互作用。半乳甘露聚糖添加后，HSA的α-螺旋減少，半乳甘露聚糖和HSA的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并降低了α-螺旋的穩(wěn)定性。分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證了光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)半乳甘露聚糖與HSA的最佳結(jié)合位點(diǎn)在亞結(jié)構(gòu)域IIB，主要結(jié)合作用力為氫鍵和范德華力，以及參與相互作用的氨基酸殘基，使相互作用的過程和結(jié)果可視化。本研究為深入理解半乳甘露聚糖在體內(nèi)的相互作用機(jī)理和運(yùn)輸儲(chǔ)藏過程奠定了基礎(chǔ)，為半乳甘露聚糖在食品化學(xué)的發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)和參考價(jià)值。