70株室間質(zhì)量評價菌株鑒定差異及其糾正方法探討

馬 爽，湯鳳珍，杜利軍，伍國達(dá)，馮 峰，程 璐，馬 翔

1.廣東省廣州市花都區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510800；2.廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510899；3.廣東省江門市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東江門 529030；4.廣東省廣州市花都人愛醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510800

隨著自動化微生物鑒定儀、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)的廣泛應(yīng)用，極大地提高了臨床微生物的鑒定能力。由于臨床微生物的種、屬繁多，存在多樣性、復(fù)雜性，選擇的鑒定特征可能難以代表全部的被鑒定菌株，特別是少見菌、疑難菌、分類“未明確菌”。當(dāng)“試驗(yàn)組合”不是所鑒定菌屬、菌種“獨(dú)有的”特征時，會出現(xiàn)不明確、不能鑒定、近緣菌株不能區(qū)分的“不確定”結(jié)果。自動化微生物鑒定系統(tǒng)根據(jù)“固定的”生理生化特征，不能自動補(bǔ)充鑒別試驗(yàn)，是導(dǎo)致菌株鑒定為復(fù)合群、低分辨率或者不能鑒定的原因之一。顯色培養(yǎng)基雖具有快速篩查目標(biāo)菌的優(yōu)勢，但對于產(chǎn)生類似色素的菌株還需要進(jìn)一步鑒別。志賀菌屬、沙門菌屬、大腸埃希菌O157、霍亂弧菌等經(jīng)過生化特征鑒定后，還需要血清學(xué)的確認(rèn)。微生物的藥敏試驗(yàn)需要根據(jù)菌株種類選擇藥物[1]，因此鑒定結(jié)果的錯誤可能影響到藥敏結(jié)果的判讀和臨床用藥。為此，筆者探討了“不確定”菌株的進(jìn)一步鑒定，以得到明確的病原菌鑒定結(jié)果[2-8]，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株 對國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心及廣東省臨床檢驗(yàn)中心提供的室間質(zhì)量評價菌株進(jìn)行鑒定，將其中經(jīng)自動化微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為“不確定”菌和在不同顯色平板上產(chǎn)生類似色素的菌(非目標(biāo)菌)共70株作為試驗(yàn)菌株。

1.2儀器與試劑 全自動微生物分析儀Vitek 2 Compact、革蘭陽性菌鑒定卡(GP卡)、革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN卡)和MALDI-TOF MS Vitek MS均購自法國生物梅里埃公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。用于念珠菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌和沙門菌鑒定的顯色平板，采用法國科瑪嘉公司生產(chǎn)的干粉配制；顯色平板及哥倫比亞血平板均從廣州迪景微生物試劑有限公司購進(jìn)。微生物生化鑒定微量管以及氧化酶紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，丁酸酯酶紙片購自Remel公司，3%過氧化氫試劑自配。志賀菌屬、大腸埃希菌O157:H7、沙門菌屬診斷血清購自丹麥國家血清研究院、中國蘭州生物制品研究所。儀器設(shè)備均按說明書操作，所有試劑均在使用有效期內(nèi)。

1.3方法 取試驗(yàn)菌株35 ℃孵育18～24 h的血平板生長物進(jìn)行革蘭染色，革蘭陽性菌補(bǔ)充過氧化氫酶試驗(yàn)，革蘭陰性菌補(bǔ)充氧化酶、葡萄糖氧化/發(fā)酵(O/F)和動力試驗(yàn)。凡菌株在Vitek 2 Compact、Vitek MS上鑒定為“不確定”菌的，行補(bǔ)充試驗(yàn)鑒別。對在顯色平板上產(chǎn)生類似色素的菌株，同時采用Vitek 2 Compact、Vitek MS鑒定；對出現(xiàn)鑒定差異的菌株行補(bǔ)充試驗(yàn)確認(rèn)。志賀菌屬、大腸埃希菌O157:H7和沙門菌屬菌株采用特異性血清學(xué)鑒定(均做鹽水對照)。

2 結(jié) 果

2.1試驗(yàn)菌株自動化微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果 70株試驗(yàn)菌株經(jīng)Vitek 2 Compact、Vitek MS鑒定出現(xiàn)“不確定”菌共計(jì)32株，見表1。其中Vitek 2 Compact能夠鑒定志賀菌屬與大腸埃希菌O157:H7菌株共11株(均經(jīng)過特異性的血清學(xué)鑒定)，其他21株“不確定”菌需要進(jìn)一步鑒別到種，占65.6%(21/32)；Vitek MS能夠鑒定鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、新洋蔥伯克霍爾德菌、快速生長分枝桿菌、諾卡菌共13株，其他19株“不確定”菌需要進(jìn)一步鑒別到種，占59.4%(19/32)；部分菌株在兩種鑒定系統(tǒng)間出現(xiàn)鑒定差異。從鑒定的菌種比對看出，Vitek MS較Vitek 2 Compact可鑒定的微生物種類增多，具有對Vitek 2 compact不能鑒定菌株鑒定的優(yōu)勢，但是，其對于志賀菌屬菌株、大腸埃希菌O157:H7不能明確鑒定。

表1 自動化微生物鑒定系統(tǒng)的“不確定”菌

2.2“不確定”菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結(jié)果的差異及鑒別 通過不同鑒定系統(tǒng)及表型特征的互補(bǔ)、結(jié)合血清學(xué)試驗(yàn)，均可以鑒定到種/型。通過同一菌株在不同系統(tǒng)上的鑒定比對，大多數(shù)菌種的鑒定結(jié)果是相符合的，但少數(shù)菌種有差異，見表2。

表2 “不確定”菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結(jié)果的差異及鑒別

2.3試驗(yàn)菌株顯色平板篩選結(jié)果 70株試驗(yàn)菌株在不同顯色平板上產(chǎn)生類似色素的菌有38株，均確定為非目標(biāo)菌(包含自動化鑒定系統(tǒng)鑒定的同種菌株)，見表3。

表3 不同顯色平板篩選的非目標(biāo)菌

續(xù)表3 不同顯色平板篩選的非目標(biāo)菌

2.4非目標(biāo)菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結(jié)果的差異及鑒別 都柏林念珠菌在念珠菌顯色平板也是綠色菌落，對于此平板上生長的綠色菌落的菌株需要鑒別；氣單胞菌在CIN平板也是紅色菌落，根據(jù)氧化酶試驗(yàn)(+)即可排除小腸結(jié)腸炎耶爾森菌；在沙門菌顯色平板上為紅色菌落的非沙門菌包括多個菌屬，通過氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、動力、MUG等試驗(yàn)鑒別，見表4。

表4 非目標(biāo)菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結(jié)果的差異及鑒別

2.5新洋蔥伯克霍爾德菌鑒定 新洋蔥伯克霍爾德菌在血平板上35 ℃孵育24 h，菌落細(xì)小，延長孵育時間菌落增大，圓形、凸起、光滑、濕潤。該菌為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)(+)、葡萄糖O/F試驗(yàn)為氧化型。洋蔥伯克霍爾德菌群種間的表型特征非常相似，即使補(bǔ)充試驗(yàn)鑒別，菌種的鑒定仍然困難，MALDI-TOF MS有鑒別優(yōu)勢。新洋蔥伯克霍爾德菌在Vitek 2 Compact上的鑒定結(jié)果為洋蔥伯克霍爾德菌群(置信度94.0%)；Vitek MS質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果為新洋蔥伯克霍爾德菌(置信度99.9%)。如果需要進(jìn)一步鑒定到種水平，其鑒別特征見表5。

表5 洋蔥伯克霍爾德菌群種間鑒別特征

3 討 論

任何微生物鑒定系統(tǒng)都有鑒定菌種的范圍，實(shí)驗(yàn)室人員要了解應(yīng)用系統(tǒng)的鑒定菌譜。通常自動化微生物鑒定系統(tǒng)能夠?qū)Υ蠖鄶?shù)臨床常見菌株鑒定到種，但對少部分菌株只能鑒定到復(fù)合群，需要補(bǔ)充鑒別試驗(yàn)才能鑒定到種水平，這關(guān)系到藥敏試驗(yàn)的結(jié)果解釋。同一菌株在不同系統(tǒng)上進(jìn)行鑒定比對，少數(shù)菌株有差異，這會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間、或者實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用不同的鑒定系統(tǒng)的結(jié)果不符合，因此，微生物實(shí)驗(yàn)室需要重視類似菌株的鑒別，做到準(zhǔn)確基礎(chǔ)上的可比。Vitek 2 Compact操作手冊指出了一些菌屬、菌群的菌株需要進(jìn)一步鑒別。

不同菌屬的培養(yǎng)條件、菌落形態(tài)、色素、氣味以及染色性質(zhì)、菌體形態(tài)、動力等不盡相同，甚至有“獨(dú)特性”，這是自動化微生物鑒定系統(tǒng)尚不能替代的。細(xì)菌的革蘭染色是全自動微生物分析儀鑒定的重要方向性試驗(yàn)，如果革蘭陰性菌錯用GP卡可能有鑒定結(jié)果，但得到的結(jié)果南轅北轍，反之亦然。而顯色平板是專為目標(biāo)菌的快速“篩選”研制的，其根據(jù)微生物特定的酶水解底物顯色，且目標(biāo)菌在此培養(yǎng)基上生長良好，顯色快、顏色鮮艷而容易識別。雖然顯色平板中的抑菌劑會抑制“雜菌”的生長，但是，本試驗(yàn)在念珠菌等3種顯色平板上觀察到38株產(chǎn)生類似色素的菌株，其鑒定的結(jié)果都不是目標(biāo)菌株。因此，不能僅僅根據(jù)在顯色平板上菌落的色素而未經(jīng)鑒定就直接發(fā)出報(bào)告，還需要進(jìn)行鑒定確認(rèn)，謹(jǐn)防誤報(bào)。因此，對于自動化微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為“不確定”、或者顯色培養(yǎng)基“篩查”的菌株，需通過不同的方法互補(bǔ)，提高微生物鑒定的質(zhì)量?？焖偕L分枝桿菌、諾卡菌根據(jù)培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)、菌體抗酸染色特征，可以初步識別。

MALDI-TOF MS尚不能準(zhǔn)確鑒定志賀菌屬細(xì)菌、大腸埃希菌O157，可能對患者的診治造成影響。對于來自糞便標(biāo)本報(bào)告的大腸埃希菌，要做進(jìn)一步甄別，報(bào)告正確的病原學(xué)結(jié)果，其對臨床治療有重要意義。

本研究對70株試驗(yàn)菌株的鑒定結(jié)果與國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心及廣東省臨床檢驗(yàn)中心反饋的鑒定結(jié)果一致。本研究列舉了“不確定”菌的鑒定及鑒別，但存在鑒定差異的菌株不僅限于此[9-10]，由于試驗(yàn)菌株數(shù)量有限，有待進(jìn)一步觀察。下列菌株鑒定錯誤可能影響疾病的診斷與治療。

病例概況1：福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、痢疾志賀菌2型及宋內(nèi)志賀菌從不潔飲食腹瀉患者的糞便中檢出，部分菌株也從健康帶菌者糞便中檢出。志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，引起人類細(xì)菌性痢疾，嚴(yán)重感染時可出現(xiàn)全身中毒癥狀。

病例概況2：大腸埃希菌O157:H7從一名14歲男性腹痛患兒的血便中檢出。大腸埃希菌O157為高致病性細(xì)菌，能導(dǎo)致出血性腸炎、甚至嚴(yán)重的溶血性尿毒癥綜合征。

病例概況3：新洋蔥伯克霍爾德菌從一名84歲女性呼吸機(jī)相關(guān)性肺部感染患者的吸痰標(biāo)本中檢出。新洋蔥伯克霍爾德菌是此菌屬最常見的菌種之一，肺部感染難以治療，由于感染的患者術(shù)后預(yù)后差，將其感染視為肺移植術(shù)的絕對禁忌證。

病例概況4：鶉雞腸球菌從一名78歲女性腎盂腎炎患者的尿液中分離出來。鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌還可引起腹腔、盆腔及膽管等部位感染。鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌均對萬古霉素天然低水平耐藥，而糞腸球菌和屎腸球菌對萬古霉素是獲得性耐藥，這2類腸球菌的鑒別對臨床治療有重要意義。

綜上所述，通過不同鑒定方法的互補(bǔ)，可以提高臨床微生物的鑒定質(zhì)量。