廣東省茂名地區(qū)新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變型研究

李富，陳海玲，聶俊瑋，唐玉芬，藍(lán)金生

茂名市婦幼保健院遺傳優(yōu)生優(yōu)育科，廣東 茂名 525000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是一種伴X-連鎖不完全顯性遺傳病，一般情況下患者并不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀，但在特定誘因下，如感染、食用蠶豆或服用具有氧化作用的相關(guān)藥物(磺胺類、伯氨喹啉類等)時，患者可出現(xiàn)急性溶血性貧血、黃疸等癥[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)G6PD缺乏癥發(fā)病率達(dá)4.9%，并表現(xiàn)出明顯的地域差異，在我國呈“南高北低”分布[3-4]。廣東省是G6PD缺乏癥高發(fā)地區(qū)[5]，茂名地區(qū)2008—2018年新篩中心篩查數(shù)據(jù)顯示，G6PD陽性率達(dá)7.58%，但目前茂名地區(qū)新生兒G6PD基因突變特點(diǎn)尚未見諸報道。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)多色探針熒光溶解曲線法(multicolor melting curve analysis，MMCA)對廣東省茂名市新生兒G6PD基因突變進(jìn)行檢測，以期了解本地區(qū)新生兒G6PD基因突變類型及特點(diǎn)，為本地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥診斷和防治提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年11月茂名市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心篩查的G6PD可疑陽性新生兒785例，其中男性560例，女性225例；年齡8 h～22 d，平均(8.31±2.53)d；臨床表現(xiàn)為病理性黃疸、ABO溶血、貧血等；在獲取監(jiān)護(hù)人充分知情同意后，同時進(jìn)行G6PD酶活性檢測(采用G6PD/6PGD熒光比值法)和基因突變檢測(采用MMCA法)。

1.2 方法 (1)標(biāo)本采集：新生兒入院后于足跟外側(cè)或內(nèi)側(cè)處采血，滴加在S&S903采血濾紙上，共采集3個直徑不小于8 mm的血斑，自然晾干后，行G6PD/6PGD熒光比值法檢測G6PD酶活性；剩余血斑放入清潔塑料袋內(nèi)密封，于4℃條件下保存，待進(jìn)行新生兒G6PD基因突變檢測。(2)G6PD酶活性檢測：采集足跟靜脈血，采用G6PD/6PGD熒光比值法檢測G6PD酶活性，使用Auto TRFIA-2自動熒光免疫分析儀進(jìn)行檢測，試劑盒購自廣州市豐華生物工程有限公司，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行檢測。結(jié)果判定：G6PD/6PGD≥0.95為正常，0.7≤G6PD/6PGD＜0.95為輕度缺乏，0.5≤G6PD/6PGD＜0.7為中度缺乏，G6PD/6PGD＜0.5為重度缺乏。(3)MMCA法檢測G6PD基因突變：采集的干血斑使用打孔器打下2個3 mm紙片，采用Lab-Aid 824型全自動核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)提取DNA樣本，DNA試劑盒為配套試劑盒，按說明書步驟嚴(yán)格執(zhí)行。提取樣本采用實時熒光PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增后，應(yīng)用G6PD基因突變檢測試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)檢測。參照試劑盒說明書對樣本基因型進(jìn)行判讀，該試劑盒可用于檢測中國人群常見的16種G6PD基因突變類型。

1.3 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采取χ2檢驗，所有檢驗均采取雙側(cè)檢驗，檢驗水平α=0.05。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 G6PD酶活性檢測結(jié)果 785例新生兒中檢出酶活性缺乏者625例，占79.62%，男性和女性酶活性正常、中度缺乏和重度缺乏新生兒比例比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 男性和女性G6PD酶活性檢測結(jié)果比較[例(%)]

2.2 茂名地區(qū)新生兒G6PD基因突變情況 茂名地區(qū)785例新生兒樣本中共檢出706例G6PD基因突變樣本，男性499例，女性207例，總突變率為89.94%(706/785)；共檢出10種單一基因突變類型，占97.17%(686/706)；共檢出14種復(fù)合基因突變，占2.83%(20/706)；其中占比排前三位的分別是c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G，合計占78.90%(557/706)，見表2。

表2 706例新生兒G6PD基因突變情況(例)

2.3 G6PD基因突變新生兒的基因型和表型一致性分析 499例男性G6PD基因突變樣本，均表現(xiàn)為G6PD酶活性缺乏，207例女性G6PD基因突變樣本中，56.04%(116/207)的表現(xiàn)為G6PD酶活性缺乏，43.96%(91/207)的G6PD酶活性正常。

3 討論

G6PD缺乏癥主要起因于G6PD基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致酶活性缺乏，是新生兒高膽紅素血癥的主要致病原因，并以病理性黃疸、溶血性貧血等為主要臨床癥狀。目前臨床上G6PD缺乏癥主要以預(yù)防癥狀發(fā)生和對癥治療為主。因此，對高發(fā)地區(qū)新生兒G6PD缺乏癥進(jìn)行篩查、明確診斷，進(jìn)而通過積極預(yù)防、控制誘因以期盡可能減少疾病對患兒健康的損害。酶活性檢測法由于操作便捷，是目前臨床上多數(shù)醫(yī)院診斷G6PD缺乏癥的方法之一，但該方法受較多因素影響，對于女性雜合子的敏感性較低，存在一定漏診率[6]。目前G6PD缺乏癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是直接明確突變的位點(diǎn)和性質(zhì)，為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，也可指導(dǎo)患兒避免接觸易導(dǎo)致溶血的食物和藥物，有效地避免了急性溶血性貧血及由此導(dǎo)致的高膽紅素血癥的發(fā)生。

近年來，G6PD基因突變檢測中MMCA法應(yīng)用日益增多，該方法對國人常見的16種G6PD基因突變類型檢測具有較高的靈敏度、特異度，同時其批量檢測能力、短時耗、結(jié)果易判讀等特點(diǎn)提高了檢測效率[7-8]。本研究采用MMCA法從785例疑似G6PD缺乏癥新生兒中檢出706例G6PD基因突變樣本，其中499例男性突變患兒全為G6PD酶活性缺乏，男性患兒的基因型和表型100%吻合；而檢出G6PD基因突變的207例女性患兒中，116例表現(xiàn)為G6PD活性缺乏，余91例則表現(xiàn)為正常G6PD活性，且均為雜合突變，提示G6PD基因型和表型一致性存在明顯的性別差異，在男性患兒明顯更高，與劉秀蓮等[9]研究結(jié)果相符，這種差異由G6PD缺乏癥的遺傳特點(diǎn)決定，女性雜合子既可表現(xiàn)為G6PD活性缺乏，也可表現(xiàn)為G6PD活性正常[10]，由此可見單一的酶活性檢測易導(dǎo)致此類患者漏診，增加后代患病風(fēng)險。另外，本研究中酶活性重度缺乏的患兒占比較高，主要由于c.1388 G＜A、c.1376G＞T、c.95A＞G和c.871G＞A等Ⅱ類變異占主導(dǎo)地位，合計占87.39%，根據(jù)世界衛(wèi)生組織G6PD基因突變相關(guān)表型分類，通常Ⅱ類變異導(dǎo)致的G6PD殘留酶活性不足10%[11]。

據(jù)相關(guān)報道，c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G是國人G6PD基因突變的最常見類型[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)廣東茂名地區(qū)也同樣如此，在所有突變類型中，此三者按由高至低順序居前三位，且合計占總突變?nèi)藬?shù)的78.9%，與彭瑛等[14]報道的中國西南三區(qū)G6PD主要突變情況相一致，但茂名地區(qū)c.1388 G＞A、c.1376G＞T突變型占比相比更高；此外，與唐芳等[15]報道的廣州地區(qū)G6PD主要突變情況較為一致，但茂名地區(qū)復(fù)合突變比例較高。從性別方面考慮，不論男性或是女性患兒，c.1388 G＞A和c.1376G＞T突變型均處于前兩位，而第三位有所不同，男性為c.871G＞A，而女性患兒為c.95A＞G，相關(guān)研究指出性別可能是G6PD基因突變類型的影響因素[16]，當(dāng)然本研究也可能由于檢測樣本有限，可考慮進(jìn)行擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究論證。另外，本研究中有10例酶活性缺乏的患者并未檢測出G6PD基因突變，這可能與這些樣本的基因突變不在試劑盒檢測參數(shù)范圍內(nèi)有關(guān)，因此在條件允許情況下可考慮通過基因測序來確定新的或少見的G6PD基因突變類型。

綜上所述，c.1388 G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G是茂名地區(qū)G6PD缺乏癥的熱點(diǎn)突變，G6PD基因型和表型一致性存在明顯的性別差異，在男性患兒明顯更高；單獨(dú)酶活性檢測易導(dǎo)致女性雜合突變漏診，結(jié)合該病為X連鎖不完全顯性遺傳的特點(diǎn)，應(yīng)在高發(fā)地區(qū)女性孕產(chǎn)婦中增加G6PD基因突變檢測，以預(yù)防新生兒高膽紅素的發(fā)生。