沙利度胺對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響探討

劉 恒

（沈陽(yáng)市第九人民醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110020）

宮頸癌是現(xiàn)代女性群體發(fā)生率較高的一種惡性腫瘤，人乳頭狀瘤（HPV）感染是誘發(fā)宮頸癌的主要原因，宮頸癌具有惡性程度高、臨床預(yù)后差等特征[1-3]。Hela細(xì)胞是由人宮頸癌組織分離出的細(xì)胞株，Hela細(xì)胞增殖、凋亡與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，且已有研究表明[4]，宮頸癌的高侵襲性和Hela細(xì)胞高度表達(dá)有關(guān)侵襲因子存在相關(guān)性。THD是一種非巴比妥類藥物，其作用機(jī)制是抑制血管生成及抗凋亡、抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等，當(dāng)下本品藥物在黑色素瘤、結(jié)腸癌等領(lǐng)域中均有應(yīng)用，在抗腫瘤生成過程中發(fā)揮良好效能[5]。本次研究使用不同程度的THD對(duì)人宮頸癌進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)Hela細(xì)胞周期形成的影響，具體如下。

1 材料與方法

1.1 使用的材料 本試驗(yàn)內(nèi)人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞均從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提取，選擇Gibco公司生產(chǎn)的RPMI-1640培養(yǎng)基，THD由Selleck公司購(gòu)進(jìn)，CCK-8試劑的提供單位是Sigma公司，p53與p-p53由Cell Signaling Technology公司提供，試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司[6]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞置入RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)（含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素），在恒定（37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。提取雙數(shù)生長(zhǎng)期Hela細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化處理后放到含有血清培養(yǎng)基上終止消化進(jìn)程。然后進(jìn)行離心處理（3500 r/min的速率離心5 min），去除上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀以進(jìn)行傳代培養(yǎng)[7]。

1.2.2 試驗(yàn)分組 采用DMSO將深度為20 mg/mL的沙利度胺溶液進(jìn)行溶解。使用培養(yǎng)基將THD分別稀釋到50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL，處理Hela細(xì)胞時(shí)分為空白組（0 μg/mL THD）、低濃度組（50 μg/mL THD）、中濃度組（100 μg/mL THD）、高濃度組（200 μg/mL THD）。

1.2.3 細(xì)胞活力 采用CCK-8法檢測(cè)，具體是把雙數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞勻稱的接種至96孔板中，將細(xì)胞密度設(shè)為5×105/孔，同時(shí)創(chuàng)設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。繼而把細(xì)胞放置在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待觀察到細(xì)胞貼壁以后，使用不同濃度THD持續(xù)處理Hela細(xì)胞24 h，繼而將5 μL CCK-試劑置入每個(gè)空洞中，置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)波長(zhǎng)達(dá)到450 nm時(shí)應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞吸光度值。實(shí)施MTT試驗(yàn)：每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD 490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，每組重復(fù)4次，求其平均值，對(duì)兩組測(cè)定值。

1.2.4 細(xì)胞周期分布 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，具體操作過程中把雙數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞勻稱接種至6孔板內(nèi)，設(shè)定細(xì)胞對(duì)應(yīng)的密度為3×105/孔。待觀察到細(xì)胞貼壁后，把THD加入至Hela細(xì)胞內(nèi)。歷經(jīng)24 h后，采集2×105～1×106個(gè)細(xì)胞，采用1 000×g離心處理5 min。去除上清液后將預(yù)冷的無水乙醇（約3 mL）緩緩加入，混勻。離心去除乙醇后加入PBS溶液（2 mL），在室溫條件靜置15 min使細(xì)胞水化，經(jīng)離心后除去上清液，加入的DNA staining solution 1 mL后再充分混勻，避光孵育30 min后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[8]。

1.2.5 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，操作方法為：先在6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)把雙數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻的進(jìn)行接種，設(shè)細(xì)胞接種對(duì)應(yīng)的密度為1×106。待觀察到細(xì)胞貼壁后，加入適量THD溶液作用24 h。繼而采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)算每組蛋白對(duì)應(yīng)的濃度。待膠和濃縮膠配制結(jié)束后對(duì)其行分離措施，進(jìn)行凝膠電泳，繼而利用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（250 mA，120 min）。采用含5%脫脂牛奶封閉PVDF膜。封閉完成，在恒溫條4 ℃搖床上用抗稀釋液（p-p53/p53）處理，1∶1 000過夜孵育PVDF膜，用TBST連續(xù)對(duì)PVDF膜進(jìn)行3次洗滌，每次持續(xù)10 min，最后采用成像儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯影，并分析灰度值[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本組試驗(yàn)內(nèi)所有信息資料均使用SPSS26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用（%）表示計(jì)數(shù)等資料，χ2或Fisher確切概率法計(jì)算。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以（）表示細(xì)胞增殖程度等計(jì)量資料，t檢驗(yàn)；當(dāng)P＜0.05，表示數(shù)據(jù)內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THD對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖形成抑制作用 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD處理人宮頸癌Hela細(xì)胞24 h，能夠劑量依賴性的降低Hela細(xì)胞活力（P＜0.05），這提示THD對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖過程有明顯的抑制作用。見圖1。

圖1 不同濃度THD對(duì)Hela細(xì)胞活力形成的影響

2.2 MTT法測(cè)定小鼠胚胎成骨細(xì)胞增殖程度結(jié)果比較 MTT法測(cè)定人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度顯示，490 nm處空白組（0 μg/mL THD）吸光值為（0.679±0.098），低濃度組（50 μg/mL THD）吸光值為（0.575±0.089）、中濃度組（100 μg/mL THD）吸光值為（0.418±0.242）、高濃度組（200μg/mL THD）吸光值為（0.242±0.089）。低濃度組、中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.426，P＜0.05；t＝5.891，P＜0.05；t＝6.023，P＜0.05）。中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于低濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.456，P＜0.05；t＝4.091，P＜0.05）。高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.456，P＜0.05）。見表1。

表1 MTT法測(cè)定人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度（）

表1 MTT法測(cè)定人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度（）

2.3 THD能抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞周期異常扮演著重要角色。在本次研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制細(xì)胞作用，抑制增殖程度與THD呈正相關(guān)，（P＜0.05），且S期細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）。這表明THD對(duì)Hela細(xì)胞細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換過程能形成較明顯的阻滯作用，見圖2。

圖2 不同濃度THD對(duì)Hela細(xì)胞周期分布形成的影響

2.4 THD對(duì)Hela細(xì)胞其中p53蛋白的活化具有抑制作用 p53為一種抑制腫瘤的蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。我們?cè)陂L(zhǎng)期的試驗(yàn)研究中認(rèn)為，THD對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的抑制作用可能和其對(duì)p53活化能形成較明顯的調(diào)控作用相關(guān)。結(jié)果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD連續(xù)處理Hela細(xì)胞24 h后，p-p53/p53比值明顯上升（P＜0.05），這提示THD可能是通過促進(jìn)p53活化過程，實(shí)現(xiàn)抑制人宮頸癌細(xì)胞周期。

3 討論

宮頸癌是婦科中發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤，發(fā)病率、病死率較高是本病的主要特征，且最近幾年中，本病患病群體有年輕化趨勢(shì)，對(duì)廣大女性的健康與生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[10]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和HPV感染、血管增生、MMP有關(guān)通路激活均存在明顯的相關(guān)性。最近幾年中，國(guó)內(nèi)外許多試驗(yàn)研究表明[11-12]，對(duì)于宮頸癌患者均伴有HPV感染，HPV感染以其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為媒介，介導(dǎo)VEGF、EGFR等的表達(dá)。有學(xué)者研究表明，腫瘤的MMPs信號(hào)通路活化水平與宮頸癌患者預(yù)后有關(guān)。

從宮頸癌組織內(nèi)分離出一種細(xì)胞株就是Hela細(xì)胞，Hela細(xì)胞的行為狀態(tài)能體現(xiàn)出宮頸癌惡化程度，而惡性腫瘤的生物學(xué)行為以細(xì)胞無限制性增殖與浸潤(rùn)為主[13]。Hela細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及凋亡行為，均有益于拓展臨床醫(yī)師對(duì)生物學(xué)行為理解的深度性。THD作用較為廣泛，其最早被應(yīng)用在骨髓瘤治療領(lǐng)域中。既往有學(xué)者指出[14-16]，THD抗腫瘤的抑制機(jī)制可能是抑制腫瘤血管形成和產(chǎn)生免疫抑制，其還可以用于其他癌癥的領(lǐng)域當(dāng)中，如肝癌、結(jié)腸癌等。還有研究表明，THD對(duì)G1期阻滯過程能形成明顯的抑制作用，阻斷DNA合成并抑制腫瘤細(xì)胞增殖過程。以上均提示THD的抗腫瘤作用可能和其抑制腫瘤細(xì)胞增殖過程存在相關(guān)。在本次研究中，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD進(jìn)行24 h持續(xù)處理，對(duì)Hela細(xì)胞活力能產(chǎn)生明顯降低（P＜0.05），說明THD能抑制Hela細(xì)胞增殖過程。采用MTT法測(cè)定人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度變化也顯示，THD可有效降低人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度，490 nm處空白組（0 μg/mL THD）吸光值為（0.679±0.098），而低濃度組（50 μg/mL THD）吸光值為（0.575±0.089）、中濃度組（100 μg/mL THD）吸光值為（0.418±0.242）、高濃度組（200μg/mLTHD）吸光值為（0.242±0.089）；低濃度組、中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于空白組（P＜0.05），且中濃度組、高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于低濃度組（P＜0.05），而高濃度組人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度均顯著高于中濃度組（P＜0.05），可知低、中、高濃度THD均可抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度，隨THD濃度升高，人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖程度逐漸降低，高濃度THD抑制增殖效果更佳，提示THD抑制增殖效果呈劑量依賴性，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制作用，可為宮頸癌的臨床治療提供一定參考依據(jù)。

細(xì)胞周期異常和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在密切相關(guān)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中最新突破表明：靶向細(xì)胞信號(hào)傳輸渠道為載體調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。在生物學(xué)中，可以將細(xì)胞周期細(xì)化為5個(gè)階段[17]：G0（靜息期）、G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期）與M（有絲分裂期），其中G1/S與G2/M是監(jiān)測(cè)細(xì)胞組分完整性與DNA合成真實(shí)度的重要檢查位點(diǎn)。在本次研究結(jié)果提示，采用50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL的THD連續(xù)處理Hela細(xì)胞24 h后，p-p53/p53比值明顯上升（P＜0.05），這提示THD可能是通過促進(jìn)p53活化過程，實(shí)現(xiàn)抑制人宮頸癌細(xì)胞周期；50 μg/mL、100 μg/mL與200 μg/mL THD持續(xù)處理Hela細(xì)胞24 h后，Hela細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)目增加顯著，S期細(xì)胞顯著減少（P＜0.05）。這表明THD可以抑制Hela細(xì)胞細(xì)胞周期G1朝向S轉(zhuǎn)換過程，提示THD對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的抑制作用可能和其對(duì)p53活化能形成較明顯的調(diào)控作用相關(guān)。

p53可以被視為基因組的“監(jiān)護(hù)人”，在多種刺激因素作用下能調(diào)控細(xì)胞增殖過程，如DNA損傷與超聲致癌信號(hào)均能激活p53腫瘤抑制渠道，從而調(diào)控上百個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[18-20]。因?yàn)閜53蛋白活化在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要調(diào)控作用，故而本次研究中分析了THD對(duì)Hela細(xì)胞p53活化形成的影響。結(jié)果表明，THD能明顯提升p53表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的間接性抑制。

綜上所述，可見THD通過提升p53蛋白活性去實(shí)現(xiàn)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞周期的有效抑制，50 μg/mL THD、100 μg/mL THD和200 μg/mL THD均有抑制細(xì)胞作用，抑制增殖程度與THD呈正相關(guān)性，藥理作用確切，這能為宮頸癌臨床治療提供較可靠的試驗(yàn)依據(jù)，促進(jìn)患者病情恢復(fù)進(jìn)程。