非洲辣木種子無菌萌發(fā)與組培再生體系的建立

覃玉鳳，鐘連香，魏秋蘭，肖玉菲，覃子海

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002)

非洲辣木(Moringastenopetala)為辣木科(Moringaceae)辣木屬(Moringa)植物，在熱帶、亞熱帶國家和地區(qū)廣泛種植[1]。由于辣木含有豐富的氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、活性酶類物質(zhì)以及人體必需的礦物質(zhì)元素，同時具有抗癌、消炎、降血壓等功效，是良好的藥食同源植物，也常被譽(yù)為“生命之樹、奇跡之樹”，其營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值已被廣泛證實(shí)并被開發(fā)利用[2-4]。辣木又因其速生、耐旱、抗病性強(qiáng)以及經(jīng)濟(jì)效益好等特點(diǎn)成為世界上熱門的多用途樹種之一，使辣木日益受到重視[5]。

隨著辣木的神奇功效和潛在市場價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，對辣木的研究和開發(fā)日益增多，其化學(xué)成分的藥理作用和營養(yǎng)成分研究均取得了較好進(jìn)展。例如，辣木葉乙酸乙酯部位(M2)在濃度較低時對細(xì)胞氧化損傷有較好的保護(hù)作用[6]；饒?bào)w寧等[7]報(bào)道了飼料中添加辣木葉提取物可以有效改善血清和蛋黃抗氧化性能、增加蛋鴨免疫球蛋白。同時，基于辣木良好的經(jīng)濟(jì)效益，辣木育苗技術(shù)[8]和栽培技術(shù)[9]也日益成為研究熱點(diǎn)。目前，辣木的種子較為昂貴，傳統(tǒng)的種子育苗已不能滿足市場需要。為此，開展辣木組培快繁實(shí)驗(yàn)，建立植株再生體系是解決引種初期種苗缺乏問題的主要途徑，可為推廣辣木提供優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源。本研究通過對非洲辣木種子無菌萌發(fā)、不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)基配方的研究，全面、系統(tǒng)地探討適合非洲辣木組織培養(yǎng)的各項(xiàng)因素，以期建立一套非洲辣木組培快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)辣木組培工廠化育苗奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以飽滿、健康的非洲辣木種子為供試材料，種子原產(chǎn)于印度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1無菌苗的獲得

選擇飽滿的非洲辣木種子，用清水洗凈后，分別采用4種不同的處理方法進(jìn)行消毒處理，然后用無菌水沖洗5次，將種子橫臥接種于MS培養(yǎng)基(每升附加蔗糖30 g、瓊脂3 g，pH為5.8)中，接種后置于培養(yǎng)室(自然光照、28 ℃)中培養(yǎng)，觀察種子的污染率和發(fā)芽率。

1.2.2無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)

當(dāng)種子生長成為無菌苗時進(jìn)行切斷處理，將切好的無菌苗(2～2.5 cm)接種至培養(yǎng)基中，然后置于24 ℃暗室進(jìn)行暗培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計(jì)植株生長狀況并計(jì)算誘導(dǎo)系數(shù)?；九囵B(yǎng)基為MS、WPM、B5培養(yǎng)基，植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA(0.5、1.0、1.5 mg/L)、KT(0.2、0.4、0.6 mg/L)，各試驗(yàn)因素構(gòu)成L9(34)正交試驗(yàn)(表2)，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為3 g/L，pH 5.8。

1.2.3增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽切斷處理(2 cm左右)，轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基中，植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA(0.4、0.6、1.2 mg/L)、KT(0.3、0.5 mg/L)(表3)，蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為3 g/L，pH 5.8。接種后，先暗培養(yǎng)10 d，再轉(zhuǎn)入正常光照培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計(jì)每個處理芽總數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.4生根培養(yǎng)

將增殖得到的無菌苗切成2 cm左右?guī)ы敿獾那o段，轉(zhuǎn)接入以基本培養(yǎng)基1/2 MS的培養(yǎng)基上，添加NAA(0.5、1.0、1.5 mg/L)和IBA(0.4、0.5 mg/L)進(jìn)行培養(yǎng)(表4)，其中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為3 g/L，pH 5.8。培養(yǎng)30 d后記錄每瓶生根株數(shù)、每株生根條數(shù)和平均根長，計(jì)算生根率、株均根數(shù)和平均根長。

1.2.5煉苗及移栽

生根培養(yǎng)30 d后，將生根的試管苗移入大棚，擰松瓶蓋，在自然光下煉苗1周后，取出生長健壯的生根苗，將基部的培養(yǎng)基洗干凈，移至基質(zhì)(泥炭土)中，每日淋足水分，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活苗株數(shù)。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度為24 ℃，光照強(qiáng)度為6 000 lx，每天光照時間為14 h。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 21.0對增殖系數(shù)、生根率、平均生根數(shù)和平均根長進(jìn)行方差分析并采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果分析

2.1 外植體的消毒

不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響效果見表1。

表1 不同消毒方法對種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出，剝殼處理(處理3和處理4)辣木種子發(fā)芽率顯著高于未剝殼處理(處理1和處理2)，剝殼處理發(fā)芽率在70%以上，其中以處理3發(fā)芽率最高，達(dá)81.11%；未剝殼處理發(fā)芽率顯著降低，發(fā)芽率均在50%以下。從污染率指標(biāo)看，未剝殼處理污染率顯著高于剝殼處理，污染率在40%以上。75%酒精和0.1%升汞不同消毒時間對辣木種子發(fā)芽率和污染率亦產(chǎn)生影響。消毒時間過短會出現(xiàn)大量霉菌，而消毒時間過長會影響種子活力，從而影響萌發(fā)率。從發(fā)芽率指標(biāo)和污染率指標(biāo)看，處理3(剝殼+清水0.5 h+75%酒精60 s+0.1%升汞10 min)更適用于辣木種子消毒，種子發(fā)芽率達(dá)81.11%，污染率僅為17.41%，既達(dá)到良好的消毒效果，又能避免種子活力受到損害。

2.2 不同培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響

不同培養(yǎng)基與激素配比試驗(yàn)中辣木誘導(dǎo)系數(shù)存在差異，如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基對非洲辣木的誘導(dǎo)效果

MS培養(yǎng)基更利于辣木誘導(dǎo)，而WPS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基對辣木誘導(dǎo)效果表現(xiàn)較差。處理2(MS+6-BA 1.0 mg/L +KT 0.4 mg/L)和處理3(MS+6-BA 1.5 mg/L +KT 0.6 mg/L)誘導(dǎo)系數(shù)均達(dá)3.0以上，顯著高于其他處理，其中處理2誘導(dǎo)系數(shù)最大(3.17)。從極差分析結(jié)果看，誘導(dǎo)系數(shù)各影響因素作用的主次順序?yàn)椋号囵B(yǎng)基>6-BA>KT(R培養(yǎng)基=1.24，R6-BA=0.51，RKT=0.29)，故辣木不定芽誘導(dǎo)的最優(yōu)培養(yǎng)基與激素配比為：MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 0.4 mg/L。

2.3 不同激素對繼代增殖的影響

不同濃度6-BA和KT組合對辣木增殖產(chǎn)生顯著影響，各處理辣木增殖系數(shù)在2.8以上，如表3所示。

表3 不同激素對非洲辣木的增殖效果

6-BA和KT濃度過高或過低辣木的增值系數(shù)均會降低，如表3 所示，當(dāng)6-BA濃度為0.6 mg/L、KT濃度為0.3 mg/L(MS+6-BA 0.6 mg/L+KT 0.3 mg/L)時辣木增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)4.62，顯著高于其他處理，說明該激素組合較適用于辣木增殖過程。

2.4 不同激素對生根的影響

以1/2 MS為培養(yǎng)基、NAA和IBA配比組合下，辣木生根率均達(dá)70%以上。當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L時，辣木達(dá)到很好的生根效果，其中以處理4(1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L)生根效果最好，生根率高達(dá)86.68%。從株均根數(shù)看，各處理生根數(shù)均在4.0條/株以上，處理3和處理4株均根數(shù)達(dá)5.0條以上，但與其余處理均未達(dá)顯著差異(表4)。

表4 不同激素對非洲辣木生根培養(yǎng)的效果

從平均根長指標(biāo)看，處理3、處理4、處理6這3個處理平均根長達(dá)2.0 cm以上，平均根長最長的為處理3，達(dá)2.18 cm。綜合分析可知，處理4較適用于辣木生根，生根率達(dá)86.68%，平均根數(shù)為5.88條/株，平均根長達(dá)到2.0 cm以上。

2.5 煉苗及移栽

試管苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，將生根的試管苗移入遮陰大棚，擰松瓶蓋，在自然光下煉苗7 d后取出生長健壯的生根苗，將基部的培養(yǎng)基洗干凈，移至消毒的泥炭土中，每日淋足水分，成活率達(dá)90%以上。

3 結(jié)論與討論

在組織培養(yǎng)中可以通過種子消毒來獲得無菌苗，其最主要的前提就是種子消毒劑的選擇、搭配及消毒時間的掌握[10]。不同植物種子對不同消毒劑的耐受能力不同，種子消毒時間過長，在達(dá)到很好的滅菌效果的同時也會對種子造成損害，進(jìn)而降低種子的發(fā)芽率，因而篩選出適宜的消毒劑和消毒時間很有必要。相關(guān)研究表明，外殼對辣木內(nèi)部的種子起到保護(hù)作用，不剝殼可以提高發(fā)芽率[11]，在不剝殼的情況下70%酒精浸泡30 s+0.1%升汞浸泡8 min，其成活率可達(dá)73.3%；但也有一些學(xué)者認(rèn)為辣木外殼表面細(xì)菌較多，保留外殼會使污染率提高進(jìn)而影響種子發(fā)芽[12]。而本研究結(jié)果顯示，非洲辣木種子在剝殼的情況下發(fā)芽率較高，與黃洲[13]的研究結(jié)果一致，最佳的處理組合為清水0.5 h+75%酒精60 s+0.1%升汞10 min，采用此種處理方法種子發(fā)芽率達(dá)81.11%，且污染率低，植物受消毒劑的傷害小。

基本培養(yǎng)基與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，在植物組織培養(yǎng)的不同階段所需的營養(yǎng)物質(zhì)也存在差異[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣木不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，與劉德承[15]和陳麗文等[16]的研究結(jié)果一致，表明MS培養(yǎng)基中較高濃度的NH4+和NO3-更適合非洲辣木不定芽的誘導(dǎo)?；九囵B(yǎng)基只能使外植體存活下來，如果想要獲得更加優(yōu)質(zhì)的試管苗，需要按照不同要求添加相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)劑來促使其生長和分化，而決定植物形態(tài)發(fā)生啟動和分化方向最重要的2個因素是生長素和細(xì)胞分裂素濃度配比。本實(shí)驗(yàn)選用的植物生長調(diào)節(jié)劑為6-BA和KT，其配比對實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明，高濃度6-BA作用下辣木側(cè)芽生長明顯，莖節(jié)距也會相應(yīng)減小[17-18]；當(dāng)6-BA濃度高于0.6 mg/L時，增殖系數(shù)不增反降，且植株出現(xiàn)下部葉片黃化現(xiàn)象，這也說明過量的細(xì)胞分裂素對辣木產(chǎn)生不利影響。當(dāng)6-BA濃度不變時，KT濃度高則增殖系數(shù)會相應(yīng)降低，說明低濃度的KT更利于非洲辣木增殖。本研究亦得出結(jié)論：辣木在MS培養(yǎng)基上增殖效果較好，當(dāng)6-BA 濃度為0.6 mg/L、KT 濃度為0.3 mg/L時，增殖效果最好，增殖系數(shù)達(dá)4.62。

研究結(jié)果顯示，辣木在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)可達(dá)到很好的生根效果，當(dāng)NAA濃度為1.0 mg/L、IBA濃度為0.5 mg/L時生根率高達(dá)86.68%。木本植物生根是離體培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟[19]，培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)劑等對組培苗生根均會產(chǎn)生一定的影響。高濃度無機(jī)鹽易使外植體切面產(chǎn)生愈傷組織，不利于生根，因而通常選用無機(jī)鹽濃度較低的1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)。有研究認(rèn)為，IBA誘導(dǎo)出的根細(xì)長，無愈傷組織，根質(zhì)量較好，苗木移栽成活率高，而NAA誘導(dǎo)出的根粗而短，且隨NAA濃度增大愈傷組織增多，移栽成活率降低[20-21]。亦有研究報(bào)道，IBA、NAA和IAA等植物生長調(diào)節(jié)劑復(fù)合使用比單一使用更利于植物生根，且愈傷組織少，移栽成活率高[22]。

本研究中，非洲辣木種子無菌萌芽率高，繼代增殖和生根培養(yǎng)效果理想，在工廠化育苗中具有重要的指導(dǎo)意義，后期將開展辣木繼代增殖和生根過程中細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化、生理活性變化等方面的研究，闡明其增殖和生根的機(jī)理機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化非洲辣木組培再生體系。