二氫楊梅素通過ERK和p38途徑抑制人胃癌AGS細胞的增殖并誘導其凋亡

陸 崠， 王承黨

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國的發(fā)病人數(shù)約占全球的40%。近年來，胃癌的治療效果有所提高，但進展期患者的生存率仍不理想，多數(shù)患者就診時已是中晚期，導致干預滯后，預后不佳。因此，在胃癌發(fā)展前期，尋找有效的癌癥靶點和抗癌物質(zhì)，對于降低胃癌的發(fā)病率至關(guān)重要。據(jù)報道，食源性植物類化合物可誘導細胞凋亡進而干擾癌細胞生長[1]。最新的流行病學研究表明，富含天然植物類化合物的飲食可誘導癌細胞的凋亡[2]，采用植物源天然產(chǎn)物作為抗腫瘤藥物可能是一種有效的抗癌療法。

多酚類物質(zhì)是一類有效的抗癌化學物質(zhì)[2-3]，其對胃癌的抑制作用已得到驗證，且未出現(xiàn)類似傳統(tǒng)癌癥治療中發(fā)生的相關(guān)副作用[4]。二氫楊梅素也稱蛇葡萄素，是從藤茶莖葉中提取出來的多酚類化合物的主要活性成分[5]，具有消炎、抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂和抗腫瘤等多種生理藥理功效[6]，在多種癌癥中可通過上調(diào)抗凋亡蛋白/凋亡前體蛋白(Bcl-2/Bax)的相對含量、激活胱天蛋白酶(caspase)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，從而誘導癌細胞凋亡[7]，且對正常細胞影響較小[8]。而二氫楊梅素誘導人胃癌AGS細胞發(fā)生凋亡是否也是由類似通路介導，目前尚不清楚。本研究擬通過利用胃癌AGS細胞株，探討二氫楊梅素對細胞活力的干預效果和作用機制，探究其對細胞凋亡的影響以及可能的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 二氫楊梅素(純度95%，美國Sigma公司)；抗體Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、細胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、p-ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1/2、p-JNK1/2、p38、p-p38和β-肌動蛋白(上海圣克魯斯生物技術(shù)公司)。干電印跡系統(tǒng)及Chemi Doc XRS成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國伯樂公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒及BD Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)。其他化學藥品均購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) AGS細胞株來自中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院細胞中心。采用含10%胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%青霉素/鏈霉素的改良RPMI-1640培養(yǎng)基，于室溫37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2中培養(yǎng)細胞。

1.2.2 細胞活力測定 采用MTT法，在96孔板中以每孔5×104個細胞的密度確定細胞活力。參照文獻[7]的方法，細胞經(jīng)孵育過夜后，將培養(yǎng)基更換為含磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)或不同濃度二氫楊梅素的新鮮培養(yǎng)基，孵育24 h后，每孔添加25 μL MTT溶液(5 mg/mL，pH值為7.4)，37 ℃下進一步孵育4 h。孵育結(jié)束后，吸出上清液，每孔再加入150 μL DMSO，置于回轉(zhuǎn)振蕩器上震蕩30 min，并用分光光度計測定570 nm波長處的光密度(optical density, OD)。

1.2.3 流式細胞術(shù)磷脂結(jié)合蛋白V/PI染色檢測各組細胞凋亡情況 采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測二氫楊梅素誘導的AGS細胞凋亡率。先將1×106mL-1的AGS細胞接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板中，附著24 h。第2天，棄去培養(yǎng)基，加入含不同濃度(10～80 μmol/L)二氫楊梅素的新培養(yǎng)基，空白對照組僅添加0.1%的DMSO(0 μmol/L二氫楊梅素)。將細胞在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2中孵育72 h，用胰蛋白酶消化并以磷酸鹽緩沖液洗滌，按照試劑盒說明書進行染色。采用流式細胞儀分析染色的細胞，并以配套軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.4 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析 AGS細胞在細胞裂解液的作用下提取蛋白，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，用含1%苯基甲基磺酰氟和20 mmol/L氟化鈉的緩沖液進行裂解。收集細胞裂解液，于4 ℃下15 000 r/min離心10 min。分離細胞質(zhì)和線粒體，測定蛋白濃度。將樣品與緩沖液混合煮沸10 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用半干電印跡系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上。室溫下用5%脫脂奶粉在TBST緩沖液(20 mmol/L Tris，166 mmol/L NaCl和0.05%吐溫-20，pH值為7.5)中封閉2 h后，用TBST緩沖液洗滌3次。4 ℃下加一抗抗體(1∶1 000)孵育過夜后，用TBST緩沖液洗滌3次，與辣根過氧化物結(jié)合的β-actin抗體(1∶2 000)在25 ℃下再孵育2 h，于在Chemi Doc XRS成像系統(tǒng)上檢測蛋白條帶。

2 結(jié) 果

2.1 二氫楊梅素對AGS細胞增殖的影響 二氫楊梅素為20、40和80 μmol/L時，細胞增殖率分別為61.7%、58.9%和40.7%，可見AGS細胞的增殖率隨二氫楊梅素濃度的升高而降低(圖1)。

與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖1 二氫楊梅素對AGS細胞活性的影響Fig.1 Effects of dihydromyricetin on proliferation of AGS cells

2.2 誘導細胞凋亡 凋亡細胞的數(shù)量與二氫楊梅素的濃度呈劑量依賴方式遞增，二氫楊梅素的濃度為80 μmol/L時，細胞的早期凋亡率為(8.22±1.22)%(右下象限)，顯著高于空白對照組(1.89±0.31)%；細胞的晚期凋亡率為(42.78±2.51)%(右上象限)，顯著高于空白對照組(4.92±0.77)%，具體見圖2。

圖2 二氫楊梅素對AGS細胞凋亡周期的影響Fig.2 Effects of dihydromyricetin on apoptosis cycle of AGS cells

2.3 二氫楊梅素對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 在二氫楊梅素處理的AGS細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低，Bcl-2/Bax的表達顯著降低(圖3A)。與空白對照組比較，經(jīng)40和80 μmol/L的二氫楊梅素處理后，AGS細胞Bcl-2/Bax比值分別降低了16.5%和67.5%(圖3B)。

A：Western-blot實驗各蛋白的表達；B：Bcl-2/Bax；C：p-p38/p38；D：p-ERK/ERK。與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖3 二氫楊梅素對Bcl-2、Bax、p38和ERK蛋白水平的影響Fig.3 Effects of dihydromyricetin on Bcl-2, Bax, p38 and ERK protein levels

2.4 二氫楊梅素通過p38絲裂原活化蛋白激酶途徑影響細胞增殖和凋亡 將AGS細胞暴露于80 μmol/L二氫楊梅素中，與空白對照組比較，p-p38/p38蛋白的水平降低了78.6%(圖3C)，p-ERK/ERK蛋白的水平降低了81.5%(圖3D)。

2.5 誘導caspase介導的凋亡 在受試濃度的處理下，活化的caspase-3和caspase-9蛋白的表達均上調(diào)(圖4A)。在80 μmol/L的二氫楊梅素處理下，與空白對照組比較，cleaved caspase-3/caspase-3的表達從0.11提升到2.35，而cleaved caspase-9/caspase-9的表達從0.20提升到3.01(圖4B)。

A：Western-blot實驗各蛋白的表達；B：不同濃度二氫楊梅素處理AGS細胞后cleaved caspase-3/caspase-3和cleaved caspase-9/caspase-9的蛋白表達。與空白對照組比較，☆：P<0.05。圖4 二氫楊梅素對活化的caspase-3和caspase-9表達水平的影響Fig.4 Effects of dihydromyricetin on cleaved caspase-3 and caspase-9 protein expressions

3 討 論

細胞凋亡是一種由基因介導的可自我調(diào)控的細胞死亡形式，與癌細胞的生長密切相關(guān)，也是治療癌癥的有效靶點之一[9-10]。細胞凋亡可通過內(nèi)在或外在途徑觸發(fā)，導致癌細胞DNA片段化，抗癌藥物可通過激活外在或內(nèi)在凋亡途徑殺傷癌細胞，大量的抗凋亡和促凋亡效應(yīng)因子可對細胞凋亡起調(diào)節(jié)作用[11]。

胃癌的治療臨床上常采用多種方式進行聯(lián)合干預處理，如手術(shù)聯(lián)合放療或化療等。因化療具有較大的副作用，尋找高效低毒的化療藥物對胃癌的治療具有重要的意義。食源性多酚、黃酮類化合物因可通過誘導細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，已成為癌癥治療研究的新熱點。Liu等[12]的研究報道，食源性多酚類化合物的珍珠梅黃酮可能通過ERK途徑誘導肝癌移植瘤細胞凋亡；Yang等[13]也報道，芹菜素能誘導肝癌細胞的自噬及凋亡。研究表明，二氫楊梅素可通過抑制相關(guān)癌基因和通路誘導癌細胞凋亡，如上調(diào)抑癌基因p53、激活信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3信號、下調(diào)蛋白激酶B(Akt)/Bad通路、抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達、調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子通路等[14-15]。亦有報道二氫楊梅素可通過p53通路誘導卵巢癌細胞凋亡和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[14]?？梢姸錀蠲匪氐淖饔冒悬c多樣化，作用機制復雜，對胃癌細胞的增殖抑制作用是否也由凋亡途徑介導，目前尚不清楚。

本實驗在研究二氫楊梅素抑制胃癌細胞增殖作用的基礎(chǔ)上，探討其對細胞凋亡周期的影響和作用機制。研究結(jié)果顯示，在二氫楊梅素的處理濃度為10～80 μmol/L時，AGS細胞的增殖抑制效果及其凋亡數(shù)量與二氫楊梅素的濃度呈劑量依賴關(guān)系。同時，二氫楊梅素誘導的AGS細胞凋亡不僅與p38蛋白表達的改變有關(guān)，還伴隨Bax的過表達(細胞死亡的啟動子)。在細胞凋亡早期，Bax插入線粒體膜中并增加膜通透性，引導細胞色素C的釋放、多種caspase的激活以及下游死亡效應(yīng)蛋白的裂解，進而誘發(fā)細胞凋亡程序的開啟。另外，經(jīng)二氫楊梅素處理后的AGS細胞，在蛋白質(zhì)水平觀察到Bax表達升高的同時伴隨Bcl-2表達的降低，這與早期報道[16]的抗癌類胡蘿卜素(多酚類化合物)的數(shù)據(jù)相似。近年來，通過誘導凋亡靶向清除AGS細胞已成為干預和預防胃癌的重要手段[7,9,12]。本研究還顯示，二氫楊梅素上調(diào)了活化的caspase-9和caspase-3蛋白表達，且差異性激活某些絲裂原活化蛋白激酶，包括p38、JNK和ERK的表達。眾所周知，ERK通路主要參與細胞增殖和分化，JNK和p38通路主要參與細胞應(yīng)激反應(yīng)和凋亡[10]。如Xu等[14]的研究顯示，75 μmol/L的二氫楊梅素對非小細胞肺癌的細胞增殖抑制效果顯著，機制是通過調(diào)控活性氧介導ERK/JNK的表達誘導癌細胞的凋亡，且二氫楊梅素對正常肺成纖維細胞無毒副作用。本研究結(jié)果表明，二氫楊梅素濃度為80 μmol/L時，可通過ERK和p38途徑抑制AGS細胞的增殖，其機制是通過上調(diào)活化的caspase-9和caspase-3蛋白表達，進而誘導AGS細胞凋亡。

綜上所述，二氫楊梅素作為一種結(jié)構(gòu)簡單的小分子多酚類化合物，臨床和動物實驗均顯示其毒性低，且無交叉耐藥性[17]。二氫楊梅素抗癌作用多向，尤其在拮抗腫瘤細胞的耐藥性方面，起效濃度較低且抗耐藥作用顯著。另外，二氫楊梅素聯(lián)用抗腫瘤藥物具有良好的抗癌活性，具有一定的臨床應(yīng)用價值。但作為小分子抗癌藥物，目前對二氫楊梅素的研究大多集中于體外藥效基礎(chǔ)，對體內(nèi)藥效和藥物作用機制的研究較少，需進一步深入探討，以推動二氫楊梅素由基礎(chǔ)研究向臨床用藥轉(zhuǎn)化。