Pan-TRK免疫組化染色方法比較分析

沈 萍，陳潔楓，金曉婷，殷敏智

WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類介紹了一類新腫瘤，稱為神經(jīng)營養(yǎng)性-原肌球蛋白受體酪氨酸激酶基因(neurotrophic tropomyosin-tyrosine receptor kinase, NTRK)重排梭形細(xì)胞腫瘤(NTRK-rearranged spindle cell neoplasm)[1]。該類腫瘤好發(fā)于兒童及青少年，組織學(xué)表現(xiàn)多變，預(yù)后不同，但均存在NTRK基因易位，通過靶向藥物治療可獲得較好的療效。文獻(xiàn)報(bào)道通過免疫組化檢測Pan-TRK抗體可以對此類病變起到很好的篩查作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用兩種全自動免疫組化儀染色及手工染色檢測Pan-TRK，并對結(jié)果進(jìn)行比較，以期尋找最佳的染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心存檔的7例手術(shù)切除標(biāo)本。其中5例分子檢測證實(shí)存在NTRK基因易位，符合NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤的診斷。另2例為嬰兒型纖維肉瘤切除標(biāo)本，證實(shí)均存在ETV6-NTRK3融合基因。

1.2 儀器設(shè)備與試劑全自動免疫組化儀為美國羅氏公司的Benchmark Ultra和德國徠卡公司的BOND MAX。一抗Pan-TRK(ERP17341，ab181560)購自Abcam公司。全自動免疫組化儀使用的二抗及顯色系統(tǒng)、蘇木精復(fù)染液等均為相應(yīng)儀器自帶套裝。手工染色使用試劑：抗原修復(fù)液(GT100411)、二抗(GK600711)、顯色劑(GK347011-A/B)、過氧化物酶阻斷劑(GT100535)，均購自上?；蛏锕?。

1.3 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烤箱烤片2 h。(1)美國羅氏公司的Ultra全自動免疫組化染色儀，使用OptiView程序，Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復(fù)液99 ℃修復(fù)72 min；抑制劑封閉15 min；一抗37 ℃孵育30 min；二抗室溫孵育12 min；DAB顯色12 min；蘇木精Ⅱ復(fù)染8 min；返藍(lán)液返藍(lán)4 min。(2)徠卡BOND MAX全自動免疫組化染色儀，使用ER Ⅱ抗原修復(fù)液(pH 9.0)99 ℃修復(fù)72 min；抑制劑封閉15 min；一抗室溫30 min；二抗室溫15min；DAB顯色10 min；蘇木復(fù)染5 min。(3)手工染色法采用EnVision法，免疫組化修復(fù)液(pH 9.0)直接煮沸修復(fù)72 min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉10 min；一抗室溫孵育1 h；二抗室溫孵育15 min；DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染1 min。

2 結(jié)果

2.1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結(jié)果NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤和嬰兒型纖維肉瘤不同的易位基因及不同的染色方法結(jié)果略有區(qū)別(表1)。

表1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結(jié)果

2.2 三種染色方法結(jié)果對比分析本組結(jié)果顯示，在出現(xiàn)NTRK1基因易位的病例中(例1、3、4、5)，三種方法均可得到陽性結(jié)果。兩種全自動免疫組化儀染色陽性信號強(qiáng)，定位清晰，背景干凈(圖1、2)，其中徠卡設(shè)備染色陽性更強(qiáng)；手工染色以表達(dá)、定位及背景著色均尚可(圖3)。出現(xiàn)NTRK3基因易位的病例中(例2、6、7)，包括2例嬰兒型纖維肉瘤，羅氏全自動染色65%～75%腫瘤細(xì)胞陽性，定位清晰，背景干凈(圖4)；徠卡和手工操作均未得到陽性結(jié)果(圖5、6)。

3 討論

NTRK包括NTRK1(1q21-22)、NTRK2(9q22)和NTRK3(15q25)[4]。在WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類中將出現(xiàn)NTRK基因改變的腫瘤均歸為NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤(不包括先天性/嬰兒型纖維肉瘤)。目前已有的靶向藥物均療效明顯，如Larotrectinib、克唑替尼等，尤其針對復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者[5-6]，因此明確病理診斷意義重大。

NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤是一組臨床及病理異質(zhì)性高的罕見腫瘤。其共同點(diǎn)均具有NTRK基因改變，好發(fā)于兒童及青少年。該病變發(fā)生部位廣泛，組織學(xué)表現(xiàn)多樣，一般表現(xiàn)為梭形細(xì)胞腫瘤，但也可上皮樣/橫紋肌樣，浸潤性生長，伴有黏液變、不同程度炎細(xì)胞浸潤，核分裂多少不等[7]。由于其病變部位廣泛，組織學(xué)表現(xiàn)多變，給病理診斷帶來了巨大挑戰(zhàn)，亟需尋找合適的輔助技術(shù)來協(xié)助診斷。

用于NTRK融合基因檢測的技術(shù)包括免疫組化、FISH、RT-PCR、新一代測序等。診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是在分子水平進(jìn)行基因檢測[8]。考慮到此類腫瘤涉及不同的3條染色體的相應(yīng)區(qū)域，如對可疑病例采用病理科較常開展的分子檢測手段(如FISH)，需要使用3個(gè)探針才能明確，無論是醫(yī)療資源、還是社會資源均是極大的浪費(fèi)。免疫組化技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于省時(shí)省力省錢，在國內(nèi)大部分病理科已經(jīng)常規(guī)開展。目前針對TrkA/B/C蛋白的抗體主要有抗TrkA單克隆抗體(EP1058Y，Abcam公司)和Pan-TRK單克隆抗體(ERP17341，ab181560，Abcam公司)。文獻(xiàn)報(bào)道Pan-TRK具有高度的靈敏度和特異性[9]；同時(shí)不同的Pan-TRK表達(dá)模式提示涉及的基因不同：胞質(zhì)陽性提示可能涉及NTRK1/2，胞核(可伴有胞質(zhì))陽性可能涉及NTRK3，可根據(jù)免疫組化結(jié)果作為后續(xù)分子檢測的依據(jù)。因此，Pan-TRK免疫組化染色可作為有效的輔助診斷和篩查工具[8]。

來自Nordi相關(guān)資料提示：同一抗體在不同設(shè)備或使用不同的流程染色，其結(jié)果差異較大，陽性率高者達(dá)95%，低者僅11%[10]。本組通過三種不同的染色方式以尋找Pan-TRK合適的染色方法，分別是羅氏和徠卡全自動免疫組化儀染色及手工EnVision法染色。按照說明書推薦結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室摸索的條件，試劑的工作濃度為1 ∶150。

本組結(jié)果顯示，在出現(xiàn)NTRK1基因易位的病例中，三種方法均可得到陽性結(jié)果，全自動染色儀得到的結(jié)果略優(yōu)于手工方法。出現(xiàn)NTRK3基因易位的病例(包括2例先天性纖維肉瘤病例)，羅氏全自動染色65%～75%腫瘤細(xì)胞陽性，定位清晰，背景干凈；而徠卡全自動染色和手工染色均未得到陽性結(jié)果。造成的原因可能為：(1)修復(fù)條件不同：本試驗(yàn)羅氏全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復(fù)液(pH 8.4)，設(shè)置修復(fù)時(shí)間達(dá)72 min。長時(shí)間的修復(fù)充分暴露了抗原，便于更多的抗體結(jié)合。手工方式嘗試采用不同修復(fù)時(shí)間包括30 min、72 min修復(fù)，使用兩種不同pH值(pH 9.0和8.4)修復(fù)液進(jìn)行試驗(yàn)，均得不到較為理想的陽性結(jié)果，整個(gè)修復(fù)過程中始終在關(guān)注修復(fù)液的量及pH變化?？赡芘c手工操作、抗原暴露不夠充分有關(guān)。徠卡全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復(fù)液(pH 9.0)，修復(fù)時(shí)間從最初的20 min延長到72 min，未得到陽性結(jié)果，背景變得更深，最終結(jié)果無法判讀。日常工作中，徠卡設(shè)備抗原修復(fù)一般為20～30 min，建議不超過50 min，此次延長到72 min，僅是出現(xiàn)背景加深?？赡荛L時(shí)間的抗原修復(fù)并不是設(shè)備理想的工作狀態(tài)。(2)DAB染色液的作用原理不同：羅氏的OptiView DAB染色液對比普通的DAB試劑盒中間多加了一種帶有酶的三抗，其與二抗結(jié)合直接作用于攜帶有相應(yīng)底物色原體系統(tǒng)的一抗，這種結(jié)合有助于催化DAB顯色。徠卡全自動染色和手工染色所用的DAB均無此作用。上述這些區(qū)別可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。

因此，如果考慮NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤，盡量選擇羅氏全自動免疫組化染色儀進(jìn)行免疫組化染色。建議每次檢測均設(shè)置陽性對照。另外，對每批號的抗體需要進(jìn)行性能驗(yàn)證，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，試劑應(yīng)在其有效期內(nèi)使用。

隨著分子檢測手段的普及，越來越多的疾病均被發(fā)現(xiàn)存在特異的基因?qū)W改變，而靶向藥物的出現(xiàn)讓臨床醫(yī)師對病理診斷的要求也越來越高。雖然現(xiàn)在越來越多的病理科已開展了分子檢測技術(shù)，但免疫組化技術(shù)開展時(shí)間長，開展的科室廣，抗體種類多，檢測時(shí)間短等具有其不可替代的優(yōu)勢。對于免疫組化的開展，前期結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體情況制定最佳的操作方法，實(shí)驗(yàn)過程中選擇合理的內(nèi)、外部對照，以及實(shí)驗(yàn)后定期的質(zhì)控都是缺一不可的重要環(huán)節(jié)。