循環(huán)免疫熒光法助力組織學(xué)多靶標(biāo)共染

傅椿輝，周洪輝，陳惠玲，王麗杰，陳 泳，楊清海

免疫組化染色是一種研究組織形態(tài)和原位蛋白表達(dá)的重要技術(shù)，對(duì)腫瘤的診斷、鑒別診斷、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后等方面具有重要作用[1]。組織切片可以為細(xì)胞和組織生物學(xué)提供豐富的信息。在同一張切片上，傳統(tǒng)免疫組化染色通常只能對(duì)1～2種抗原進(jìn)行染色分析，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展和蛋白質(zhì)組學(xué)更加深入的研究，如不同蛋白間的相互作用，共表達(dá)和共定位，表達(dá)量與空間和距離關(guān)系，腫瘤異質(zhì)性分析，細(xì)胞表型統(tǒng)計(jì)，腫瘤微環(huán)境呈現(xiàn)等均需在一張組織切片上同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)分子[2-5]。本研究介紹一種利用循環(huán)免疫熒光的方法，可以同時(shí)顯示至少5個(gè)以上靶標(biāo)分子，免疫熒光染色與熒光基團(tuán)的化學(xué)滅活結(jié)合抗原抗體分離的快速非破壞性方法交替進(jìn)行，通過(guò)數(shù)字病理切片掃描儀，可以在不丟失任何信息的情況下捕獲每一輪染色結(jié)果，用軟件疊加每一輪染色結(jié)果，最終實(shí)現(xiàn)多重免疫熒光染色。

1 材料與方法

1.1 材料硫酸、高錳酸鉀、硼氫化鈉購(gòu)自國(guó)藥公司；DAPI購(gòu)自Vector公司；ER、PR、HER-2兔單克隆抗體，Ki-67、CK5/6鼠單克隆抗體，EDTA抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自福州邁新公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明(rhodamine)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Abcam公司，3D Histech Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀、CaseView圖像分析軟件購(gòu)自濟(jì)南丹吉爾公司。

1.2 方法

1.2.1免疫熒光 (1)乳腺癌石蠟切片脫蠟、水化，自來(lái)水沖洗并浸泡于水中待用；(2)取適量EDTA(1 ∶50)抗原修復(fù)液倒入不銹鋼鍋中，將不銹鋼鍋置于電磁爐上，大功率加熱至沸騰；(3)將功率調(diào)至最小(處于保溫狀態(tài))，將切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的修復(fù)液中，蓋上鍋蓋繼續(xù)加熱20 min；(4) 室溫自然冷卻10 min，可用自來(lái)水在不銹鋼鍋外壁沖淋加速鍋內(nèi)修復(fù)液冷卻，冷卻至室溫后取出切片，自來(lái)水沖洗干凈，PBS沖洗3 min×3。(5)除去PBS，切片上滴加ER兔單克隆抗體(1 ∶50)和Ki-67鼠單克隆抗體(1 ∶50)混合液，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 min×3；(6)除去PBS，切片上滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶100)和rhodamine標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶100)混合液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3 min×3；(7)流水沖洗，風(fēng)干切片，滴加DAPI復(fù)染液封固。

1.2.2抗體洗脫和熒光淬滅 染好的切片經(jīng)Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行熒光掃描后，小心地移去蓋玻片，蒸餾水清洗，切片上滴加0.15 mol/L KMnO4、0.01 mol/L H2SO4溶液2 min，流水沖洗，放入新鮮配置的4.4 mol/L NaBH4(pH 9.0)中10 min，流水沖洗，PBS浸泡5 min，即可徹底洗脫抗體和淬滅熒光[8-9]。接著可進(jìn)行第二輪免疫熒光染色，方法從1.2.1步驟5加一抗開始。

1.2.3熒光掃描與圖像分析 每一輪染色后，采用3D Histech Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行熒光掃描。掃描前先設(shè)置抗體標(biāo)記的偽彩顏色，可以設(shè)置任意顏色。采用CaseView圖像軟件對(duì)每一輪的熒光圖像進(jìn)行對(duì)齊，疊加合成，最終實(shí)現(xiàn)多重免疫熒光染色。完整的循環(huán)免疫熒光染色流程見圖1。

圖1 循環(huán)免疫熒光染色流程圖

2 結(jié)果

2.1 KMnO4/H2SO4/NaBH4洗脫抗體、淬滅熒光并保留抗原活性的有效性為驗(yàn)證KMnO4/H2SO4/NaBH4洗脫抗體的有效性，第一輪使用兔單克隆抗體ER在乳腺癌組織上進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色明顯(圖2A)，經(jīng)KMnO4/H2SO4/NaBH4處理后，只用熒光標(biāo)記的二抗染色，未見任何ER染色，表明一、二抗已完全剝離(圖2B)。再用ER抗體和熒光標(biāo)記二抗進(jìn)行新一輪染色，又可以看到明顯的ER染色(圖2C)。為進(jìn)一步測(cè)試抗原的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了5輪的ER循環(huán)染色，ER免疫反應(yīng)性在經(jīng)過(guò)5輪的染色和洗脫后依然同第一輪染色一樣強(qiáng)烈，染色未見明顯減弱(圖2D)。表明該方法至少可以進(jìn)行5輪染色。

ABCD

2.2 免疫熒光染色與抗體洗脫結(jié)合熒光掃描實(shí)現(xiàn)多重免疫熒光染色在同一張乳腺癌組織上，分別用ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6進(jìn)行循環(huán)免疫熒光染色，通過(guò)3D Histech Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀熒光掃描和CaseView圖像軟件對(duì)齊疊加后，可在一張乳腺癌組織切片上完美呈現(xiàn)5種蛋白的共表達(dá)(圖3)，這為觀察不同蛋白間的相互作用、腫瘤異質(zhì)性分析、細(xì)胞表型統(tǒng)計(jì)、腫瘤微環(huán)境呈現(xiàn)等提供了極大的便利。

圖3 同一張圖片上實(shí)現(xiàn)5種蛋白共同標(biāo)記，免疫熒光染色：ER為紫色；PR為紅色；HER-2為黃色；Ki-67為綠色；CK5/6為青色；DAPI為藍(lán)色

3 討論

免疫熒光是一項(xiàng)被廣泛用于腫瘤研究的技術(shù)，傳統(tǒng)的多重免疫熒光染色通常只能顯示2～3種抗原標(biāo)記，并且要求使用不同種屬來(lái)源的一抗和二抗，以避免抗體間的交叉反應(yīng)[6-8]。當(dāng)需要在一張切片上顯示5種以上抗原標(biāo)記時(shí)，傳統(tǒng)的多重免疫熒光無(wú)法顯現(xiàn)。酪胺信號(hào)放大免疫熒光利用酪胺分子與其結(jié)合的抗原蛋白之間共價(jià)鍵的穩(wěn)定性，其鍵能遠(yuǎn)高于抗原、抗體間的非共價(jià)鍵結(jié)合力，熒光標(biāo)記后通過(guò)微波加熱法在保留抗原標(biāo)記信號(hào)的同時(shí)去除結(jié)合在抗原上的一抗和二抗分子，解決了傳統(tǒng)多重免疫熒光抗體交叉反應(yīng)的問(wèn)題[9]；缺點(diǎn)是需要多種不同熒光素標(biāo)記的酪胺信號(hào)放大試劑，配備激光掃描共聚焦顯微鏡和專業(yè)的多光譜成像設(shè)備，1次最多只能標(biāo)記7種顯色，步驟多，繁瑣且耗時(shí)。對(duì)于大多數(shù)研究者來(lái)說(shuō)試劑成本高，且缺乏專業(yè)設(shè)備，無(wú)法自行開展。循環(huán)免疫熒光法使用化學(xué)試劑去除每一輪樣本中的抗體和熒光染料，結(jié)合數(shù)字切片掃描儀，只需要1～2種熒光二抗試劑即可完成多重免疫熒光標(biāo)記。利用雞尾酒式抗體孵育，每一輪可以顯示1～2種抗原標(biāo)記，抗原在經(jīng)過(guò)5輪顯色和洗脫后依然可以完好保留。因此，使用該方法經(jīng)過(guò)5輪顯色后，可以實(shí)現(xiàn)5～10種抗原標(biāo)記，且步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，1天內(nèi)即可完成。全波片熒光掃描的使用大大簡(jiǎn)化了循環(huán)免疫熒光染色方法，其提供了所有標(biāo)記的永久存檔，并允許在各種放大倍數(shù)下觀察每個(gè)標(biāo)記的任何區(qū)域。更少的二抗試劑和大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都配有的數(shù)字切片掃描儀，使得該方法具有更好的簡(jiǎn)易性、經(jīng)濟(jì)性和普及性。

綜上所述，本研究建立的循環(huán)免疫熒光法(第一輪免疫熒光染色-偽彩掃描-化學(xué)洗脫-重復(fù)免疫熒光染色-圖像合成)可以實(shí)現(xiàn)5～10種蛋白共染，該方法將有助于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究、腫瘤信號(hào)通路研究以及腫瘤微環(huán)境研究等。