通過TCT檢測惡性胸腔積液非小細胞肺癌血管擬態(tài)現(xiàn)象

丁春曉，王 健，劉小虎，杜明偉，李建華，方長清

全球肺癌的發(fā)病率和病死率增長較快，對人類的生命健康造成巨大威脅。近年，我國肺癌的發(fā)病率增長最快，位居男性惡性腫瘤的第1位，位居女性惡性腫瘤的第2位，而在美國等其他國家，肺癌甚至是因癌癥致死的首要因素[1-4]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺腫瘤的85%，約56%患者在確診時已發(fā)生轉移[5-6]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移過程中，新生血管的生成至關重要[7]，其作用是為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質及氧氣。然而，在實際治療過程中，抗腫瘤血管生成的臨床療效遠達不上預期。這提示腫瘤血管生成可能不是腫瘤唯一的微循環(huán)機制，或許還存在血管擬態(tài)(vascufogenicmimicry, VM)現(xiàn)象。Maniotis等[8]于1999年首次在部分高度侵襲性葡萄膜黑色素瘤組織中證實VM現(xiàn)象的存在。目前關于NSCLC的轉移性惡性胸腔積液(malignant pleural effusion, MPE)腫瘤細胞中存在血管新生和VM現(xiàn)象的文獻，鮮有報道。因此，本文著重從細胞學角度出發(fā)，在NSCLC轉移性MPE脫落細胞中，探討VM現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2018年1月～2020年12月接收的胸水標本1 425例，對液基細胞薄層檢測(thinprep cytology test, TCT)診斷陽性及可疑陽性標本進行離心沉渣包埋，行HE及免疫組化染色以篩選NSCLC，并通過回顧性查找病史，匯總臨床資料。

1.2 主要試劑TTF-1、SPA、SPB、CK7、CK5/6、CD105、CD34、CD31、FⅧRAg、D2-40、LYVE-1、CD31、VEGF、FGF和GAPDH等抗體以及免疫組化、免疫熒光檢測所需試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 TCT檢測收集新鮮胸水20 mL左右，室溫下800 r/min離心5 min，棄上清，取沉淀于底部的細胞，加入清洗液后再次離心，取沉淀與保存液混合后機器自動制片，中性樹膠封固。

1.4 胸水沉渣包埋[9]胸水標本室溫下自然沉淀4 h，棄上清，取剩余自然沉淀液20 mL倒入離心管，室溫下2 000 r/min離心10 min，再次棄上清，用剪刀剪斷離心管最底部，其內即為沉淀物，一起放入包埋盒，經10%中性福爾馬林固定、脫水、包埋。

結果判讀：NSCLC患者胸腔積液中的脫落腫瘤細胞經沉渣包埋制片后，鏡下觀察細胞可呈管腔樣排列，且形式多樣，其中可見單個腫瘤細胞形成的脈管樣管型結構，也可見多個腫瘤細胞圍成的脈管樣管型結構，有些管腔樣結構可呈共壁聯(lián)環(huán)型，有時可見多個腫瘤細胞共壁于基膜。通讀HE染色，鏡下觀察VM現(xiàn)象，每張切片隨機選取5個高倍視野(200×)，計數具有以上任一形式的VM現(xiàn)象中具有完整管腔的數量，結果用中位數四分位間距表示。

1.5 免疫熒光切片脫蠟、抗原修復、血清封閉、滴加一抗孵育過液，PBS沖洗，滴加熒光素標記的二抗、避光室溫孵育，PBS沖洗、封固，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

結果判讀：對CD31、D2-40，CD105、LYVE-1，CD34、LYVE-1，F(xiàn)ⅧRAg、D2-40進行熒光雙染，陽性為胞質陽性。

1.6 免疫組化采用免疫組化SP法染色，PBS稀釋一抗，生物素標記二抗，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶孵育，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。

結果判讀：由兩名病理診斷醫(yī)師獨立檢查5個代表性高倍視野(200×)，識別陽性染色的腫瘤細胞，合計檢測100個連續(xù)細胞，通過陽性染色細胞數/檢測腫瘤細胞的總數計算陽性百分比：陽性細胞數<5%為陰性，≥5%為陽性。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗，結果用中位數和四分位數間距表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者的篩選在1 425例胸水標本中，對既往TCT診斷結果為惡性細胞、可疑惡性細胞或見核異質細胞等結果的標本，進行進一步沉渣包埋，HE染色結合免疫組化最終確定323例為NSCLC胸水標本。其中女性189例，中位年齡67歲；男性134例，中位年齡70歲。同時，通過HE和免疫組化染色對NSCLC進行組織學分型：其中肺腺癌(TTF-1、Napsin-A、CK7等陽性)174例，肺鱗狀細胞癌(CK5/6、p40、p63、CK34βE12等陽性)108例，腺鱗癌24例，大細胞癌17例。

2.2 HE染色觀察VM現(xiàn)象沉渣包埋HE染色切片顯示腫瘤細胞呈脈管樣管型結構排列(圖1)，VM形成數量：腺癌為10(10，20)個、鱗狀細胞癌為12.5(10，20)個、腺鱗癌為12.5(5，17.5)個、大細胞癌為10(5，20)個，各組間差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.102，P>0.05)。

圖1 沉渣包埋切片腫瘤細胞呈脈管樣管型結構排列

2.3 VM現(xiàn)象中脈管樣管型結構NSCLC標志物的表達為進一步判斷脈管樣管型結構是否由NSCLC成分細胞分化形成，實驗進行了NSCLC細胞特異性標志物免疫細胞化學染色。結果發(fā)現(xiàn)特異性標志物陽性率分別是：TTF-1為92.88%(300/323)(圖2A)、CK7為93.81%(303/323)(圖2B)、CK5/6為8.98%(29/323)、CD133為89.78%(290/323)、SPA為68.11%(220/323)、SPB為55.73%(180/323)。

2.4 VM現(xiàn)象中脈管樣管型結構內皮細胞標志物的表達鑒于在VM現(xiàn)象中有脈管樣管型形成，為鑒定新分化形成的類脈管結構是否具有真正的脈管系統(tǒng)功能，本實驗對其進行了血管內皮及淋巴管內皮細胞的免疫標志物染色，結果發(fā)現(xiàn)各標志物均呈不同程度的表達。其中血管內皮細胞標志物的陽性率分別是：CD105為65.33%(211/323)、CD34為69.04%(223/323)(圖2C)、CD31為75.54%(244/323)、FⅧRAg 為55.42%(179/323)，淋巴管內皮細胞標志物陽性率分別為：D2-40為76.78%(248/323)(圖2D)、LYVE-1為72.76%(235/323)，同時，F(xiàn)GF和VEGF的陽性率分別為75.54%(244/323)和77.71%(251/323)。

ABCD

2.5 免疫熒光染色結果MPE中NSCLC脫落細胞分化形成的脈管樣管型結構經免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，脈管內皮細胞標志物CD105、D2-40、LYVE-1、CD31、CD34、FⅧRAg均陽性(圖3)。

AB

3 討論

近年來NSCLC的發(fā)病率逐年增加，且越發(fā)年輕化，尤其在新冠疫情常態(tài)化管理的當下，肺CT檢查率增加，這使得一些早期癥狀不明顯的肺患者被發(fā)現(xiàn)。然而，絕大部分患者發(fā)現(xiàn)即為晚期，已發(fā)生轉移。惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤，就是因為其具有侵襲和轉移的能力，對機體危害大，甚至常因其而致命。腫瘤侵襲和轉移過程是呈動態(tài)變化且極其復雜的，主要包括基因水平的失衡、營養(yǎng)新生血管的生成、細胞間基質的變化及微環(huán)境的變化等[10]。其中血管生成是一關鍵環(huán)節(jié)。20世紀70年代初，F(xiàn)olkman[11]提出“腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移均依賴于腫瘤組織內新生血管生成”的理論，成為腫瘤研究領域的重要里程碑。然而，臨床治療過程中抗腫瘤血管生成的臨床療效并不理想，學者們便設想VM現(xiàn)象的存在。VM現(xiàn)象是一種由非內皮細胞組成的微血管通道，其是由惡性腫瘤細胞和一種PAS染色陽性的細胞外基質組成的，其形成主要包括惡性腫瘤細胞的自身變形、細胞外基質的重塑以及由此產生的與現(xiàn)有血管相連的脈管樣結構，進而為腫瘤生長提供了充足的血液供應[12-15]。在VM現(xiàn)象中，由非內皮細胞排列的脈管樣管腔結構是由多能干細胞、高侵襲性的腫瘤細胞和細胞外基質構成，其模擬了血管的功能，使紅細胞可以通過血管流動，并具有替代功能，當依賴于內皮細胞的血管生長跟不上腫瘤組織的生長時，一些腫瘤細胞就會改變原有的功能，模仿內皮細胞的功能，這些機制都表明VM現(xiàn)象在惡性腫瘤的血液供應中起著重要作用[12,16-17]。在近年來，通過激光掃描共聚焦血管造影、電子顯微鏡、三維細胞培養(yǎng)等先進技術，先后在乳腺癌、肝癌、膠質瘤、卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌等惡性腫瘤中證實了VM的存在。

鑒于此，我們設想，腫瘤組織學中常見的血管新生和VM現(xiàn)象在NSCLC患者MPE腫瘤細胞中是否也存在呢？NSCLC患者MPE中脫落的腫瘤細胞具備惡性程度高、分化程度低和可塑性強的特點，在失去血液供應低氧條件下，在胸水中為了適應這種缺氧微環(huán)境是否會進行自我調整，進而分化形成新生血管和具有VM的形態(tài)結構和功能。本實驗對 1 425 例胸水標本采用TCT技術進行制片診斷，最終確認323例NSCLC，發(fā)現(xiàn)在TCT細胞學制片下腫瘤細胞或呈緊密排列的彩球狀，或呈鱗片狀，或是燈泡狀排列的結構。沉渣包埋HE染色中發(fā)現(xiàn)上述形態(tài)結構的腫瘤細胞分化形成不同形態(tài)的脈管樣管型結構。通過免疫組化證實，排列成脈管樣結構的腫瘤細胞表達TTF-1、SPA、SPB、CK7、CK5/6等腫瘤標志物，驗證了構成脈管樣結構的這些細胞為腫瘤細胞。同時，本實驗又對其進行脈管上皮相關抗體標記，發(fā)現(xiàn)CD105、CD34、CD31、FⅧRAg、D2-40、LYVE-1等標志物均陽性。對于腫瘤細胞中與血管內皮相關抗體的表達，有學者認為，可以通過腫瘤干細胞的可塑性來解釋。有研究在神經母細胞腫瘤中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞具有向內細胞分化的能力[18-21]。本研究結合上述結果得出，NSCLC胸腔積液中的脫落腫瘤細胞能夠形成脈管樣管型結構，其中一部分的形成機制為VM或血管新生，另一部分來自于腫瘤細胞分化形成的脈管樣結構，具有內皮細胞功能，但機制不清。因此，作者大膽提出了腫瘤細胞-脈管樣管型假說，即在細胞學中，NSCLC患者胸腔積液中的脫落腫瘤細胞(上皮細胞)為了克服低氧微環(huán)境可以向血管內皮和(或)淋巴管內皮細胞分化并形成脈管樣管型結構。腫瘤細胞這種脈管樣管型的形成有利于腫瘤細胞間的物質交換和代謝，充當了“制氧機”的作用，加快了腫瘤細胞進一步侵襲和轉移。CD133為腫瘤干細胞標志物，在本研究中其染色為陽性，作者推測腫瘤細胞具有干細胞的功能，在外界環(huán)境需要的情況下分化為不同功能的細胞，對自身生存提供有利的環(huán)境。腫瘤細胞脈管樣結構在分化過程中可能與新生的正常血管內皮細胞或淋巴管內皮細胞連接，最終嫁接到正常的某一段血管或淋巴管，進入血液淋巴循環(huán)通道，形成新的轉移灶。

NSCLC常規(guī)治療往往對進展NSCLC的療效有限，總的5年生存率僅為15%[22]。因此，抑制腫瘤血管生成就成為腫瘤治療的核心策略之一，研究NSCLC的血管新生和血管生成機制將為探索腫瘤血管生成抑制劑治療肺癌提供堅實的理論基礎。本實驗為深入理解腫瘤血管形成的原理和分子機制以及探索臨床上抗腫瘤血管生成藥物治療的新靶標提供了前期基礎。