Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調(diào)控腎臟AA淀粉變

夏順杰，李釗希，王琨璐，張彩妮，董愛彤，王宇彬，劉 巍，錢金澤

淀粉樣變是一組由遺傳變性和感染等不同因素引起的，因蛋白質(zhì)分子錯(cuò)誤折疊/異常聚集所致的淀粉樣物質(zhì)沉積的綜合征[1]。AA淀粉樣變的形成主要與長期炎癥刺激所致的持續(xù)性高濃度的淀粉樣前體蛋白，即血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)有關(guān)。大量的SAA可以通過酶解作用分解，或以錯(cuò)誤折疊的方式形成具有β折疊(β-pleated sheets)的淀粉樣纖維。臨床上AA淀粉樣變的腎臟累及率高達(dá)75%～90%，預(yù)后較差，患者多死于腎功能衰竭，其發(fā)病及防治機(jī)制尚未完全清楚。

具有分子伴侶功能的熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)通過誘發(fā)熱休克反應(yīng)激活熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock factor 1, Hsf1)，參與蛋白質(zhì)的正確折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳遞等生理過程[2]。在急性腎損傷模型中，腎臟上皮細(xì)胞的Toll-like受體(toll-like receptor, TLR)，特別是TLR2和TLR4表達(dá)量明顯增加，而這兩種受體的激活是依賴于HSP70來完成的，并且在整個(gè)免疫過程中對細(xì)胞因子的介導(dǎo)和吞噬細(xì)胞的活化也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3]。TLR4是一種模式識別受體，與相應(yīng)的配體結(jié)合后，TLR4被活化。其活化后可誘導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮抗炎、自身免疫等效應(yīng)。

前期的基因芯片篩選結(jié)果顯示，HSP70誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生與TLR4信號通路有關(guān)，而目前對于該通路在AA淀粉樣變中的作用機(jī)制尚未見詳細(xì)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Hsf1基因敲除小鼠構(gòu)建腎臟AA淀粉樣變模型，探討HSP70-TLR4-MyD88通路相關(guān)因子在腎臟AA淀粉樣變中的作用機(jī)制以及Hsf1基因?qū)ζ渫返恼{(diào)節(jié)，有助于該病在臨床上的預(yù)防與治療策略的合理選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組本實(shí)驗(yàn)選用ICR背景的Hsf1基因敲除鼠，由日本山口大學(xué)大學(xué)院醫(yī)學(xué)系研究科醫(yī)化學(xué)系中井彰教授贈予。所用小鼠均為2個(gè)月齡雄鼠，實(shí)驗(yàn)分5組：Hsf1+/+生理鹽水組、Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組、Hsf1-/-生理鹽水組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)同時(shí)給予替普瑞酮(GGA)治療組(Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)+GCA組)，每組各6只。

1.2 模型制備根據(jù)Pras法，從AA淀粉樣變誘導(dǎo)的野生型小鼠腎臟組織中提取出AA淀粉樣纖維種子，各淀粉樣變誘導(dǎo)組采用尾靜脈注射AA淀粉樣纖維(1 μg/100 μL)，并給予皮下注射0.5 mL 1%AgNO3的方法制備AA淀粉樣變模型，然后每隔1天皮下注射0.5 mL 1%AgNO3持續(xù)誘導(dǎo)炎癥刺激。此外，GGA治療組每日灌胃(500 mg/kg GGA，GGA溶于4.0 mL 0.9%NaCl溶液中使用[4-5])。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行1周后完成造模。實(shí)驗(yàn)中每天同一時(shí)間點(diǎn)對各組小鼠進(jìn)行尾靜脈取血，并低速離心收集血清以測量SAA。

1.3 組織取材淀粉樣變誘導(dǎo)1周后進(jìn)行取材，再使用乙醚麻醉后處死小鼠，取小鼠腎臟部分置入液氮，部分置于10%中性福爾馬林與4%多聚甲醛配置成的固定液中，室溫固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余部分直接冷凍于-80 ℃進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(1)應(yīng)用RT-PCR法檢測各組中HSP70、TLR4、MyD88、Tnf-α及IL-6 mRNA檢測：從腎臟組織提取RNA合成cDNA，使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，操作系統(tǒng)選擇Mx 3005 RT-PCR SYSTEM。(2)應(yīng)用Western blot法檢測各組小鼠腎臟中HSP70以及血清中SAA蛋白表達(dá)：使用SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后檢測蛋白表達(dá)，所用抗體HSP70和小鼠淀粉樣蛋白A(mouse amyloid A, mAA)稀釋比均為1 ∶3 000。

1.5 HE及免疫組化用10%中性福爾馬林固定取材的腎臟組織，再將其進(jìn)行包埋封蠟至成型，對腎臟組織進(jìn)行石蠟切片，4 ℃保存。對切片進(jìn)行剛果紅染色，偏光鏡下觀察染色情況，確定淀粉樣物質(zhì)的沉積程度；同時(shí)對相同部位連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化SP法染色，mAA抗體稀釋比為1 ∶3 000，在顯微鏡下觀察切片并判斷mAA沉積情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用Stat View software package(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并應(yīng)用Mann-WhitneyU進(jìn)行數(shù)據(jù)的組間比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA淀粉樣變中Hsf1對HSP70與TLR4的影響RT-PCR檢測各組腎臟中mRNA的結(jié)果顯示：淀粉樣變誘導(dǎo)試驗(yàn)后，Hsf1+/+小鼠腎臟HSP70 mRNA表達(dá)量顯著升高，而Hsf1-/-小鼠腎臟組織HSP70 mRNA表達(dá)量無明顯改變(圖1A)，提示Hsf1表達(dá)缺失不能有效激活HSP70。此外，Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組小鼠腎臟組織中TLR4及其下游因子MyD88的mRNA表達(dá)量顯著高于Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組小鼠，并且前者的細(xì)胞因子Tnf-α和IL-6的mRNA表達(dá)量同樣顯著高于后者(圖1B～E)。結(jié)果提示，Hsf1表達(dá)缺失對HSP70-TLR4通路有直接調(diào)控作用，并影響AA淀粉樣變。

圖1 各組小鼠腎臟組織中HSP70(A)、TLR4(B)、MyD88(C)、Tnf-α(D)和IL-6(E) mRNA的表達(dá)情況

2.2 Hsf1表達(dá)缺失對炎癥刺激后SAA表達(dá)的影響通過Western blot法對各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中SAA蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，未進(jìn)行炎癥刺激時(shí)，無論是Hsf1+/+型小鼠還是Hsf1-/-型小鼠，均未檢測到血清中SAA表達(dá)；而進(jìn)行炎癥刺激后，Hsf1+/+型小鼠和Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達(dá)均急劇升高，Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達(dá)量顯著高于Hsf1+/+型小鼠(P<0.05)，且在炎癥刺激后第一天達(dá)到峰值后迅速下降(圖2)。由此可見，Hsf1的缺失顯著增強(qiáng)了炎癥刺激后SAA的表達(dá)，為AA淀粉樣物質(zhì)的形成提供了必要條件。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠每天同一時(shí)間點(diǎn)血清中SAA蛋白表達(dá)情況：Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組與Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組相比，*P<0.05

2.3 Hsf1敲除對AA淀粉樣物質(zhì)沉積程度的影響對各組小鼠腎臟切片進(jìn)行剛果紅染色結(jié)果顯示：Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組淀粉樣物質(zhì)沉積顯著多于Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組，且淀粉樣物質(zhì)沉積部位主要集中在集合管的間質(zhì)組織中，再對相同部位連續(xù)切片進(jìn)行mAA免疫組化染色，可見在熒光位置出現(xiàn)等量的淀粉樣沉積，證明剛果紅染色所見淀粉樣物質(zhì)即為AA淀粉樣纖維(圖3)。同時(shí)利用淀粉樣蛋白沉積指數(shù)評估將淀粉樣變沉積程度進(jìn)行量化比較，結(jié)果提示：Hsf1的敲除顯著增強(qiáng)了腎臟組織中AA淀粉樣變的沉積程度(圖4)。

ABCDEFGHHsf1+/+生理鹽水組Hsf1+/+淀粉樣變誘導(dǎo)組Hsf1-/-生理鹽水組Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組

圖4 小鼠腎臟組織中淀粉樣蛋白沉積指數(shù)評估：N.D.未檢出

2.4 GGA通過TLR4通路有效改善了腎臟組織中AA淀粉樣物質(zhì)沉積Hsf1-/-淀粉樣變誘導(dǎo)組同時(shí)給予GGA處理后，結(jié)果顯示在Hsf1缺失情況下，GGA可有效的誘導(dǎo)腎臟組織中HSP70的mRNA和蛋白表達(dá)(圖5A、B)，同時(shí)削弱TLR4-MyD88的活化和促炎因子的表達(dá)(圖5C～F)；并且在一定程度上抑制了腎臟組織中淀粉樣物質(zhì)沉積(圖6)。

圖5 GGA處理后腎臟組織中各分子mRNA和蛋白表達(dá)情況：A、B.實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織中HSP70 mRNA(A)及蛋白(B)表達(dá)水平；C～F.分別為各實(shí)驗(yàn)組小鼠腎臟組織中TLR4(C)、Myd-88(D)及促炎因子Tnf-α(E)和IL-6(F)的mRNA表達(dá)水平

圖6 GGA處理后腎臟組織中淀粉樣變沉積程度評估：N.D.未檢出

3 討論

AA淀粉樣變又稱繼發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變或反應(yīng)性淀粉樣變，是常見的系統(tǒng)性淀粉樣變性之一，由SAA形成的淀粉樣纖維(amyloid fibrils)沉積于機(jī)體組織器官內(nèi)，從而引起的系統(tǒng)性淀粉樣變。目前，已有30余種不同的蛋白質(zhì)及其前體可以引起機(jī)體的淀粉樣變疾病，如朊病毒疾病、阿爾茨海默病、Ⅱ型糖尿病、反應(yīng)性淀粉樣變性疾病(reactive amyloidosis)等。簡言之，淀粉樣變是一種淀粉樣蛋白在組織或器官內(nèi)沉積而引發(fā)的一組疾病，可累及全身各組織或器官，腎臟是淀粉樣蛋白常累及的器官之一，是誘發(fā)腎臟纖維化和功能異常的主要因素之一[6]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，淀粉樣變性每年發(fā)病率約為0.7/10萬人，其中腎臟淀粉樣變的年發(fā)病率高達(dá)(0.21～0.33)/10萬人，占繼發(fā)性腎臟疾病的3.6%，以中老年患者為主。目前普遍認(rèn)為，血清中SAA的含量和炎癥反應(yīng)均與AA淀粉樣變的形成密切相關(guān)，特別是IL-6抑制劑可使患者血清中SAA水平正常化，達(dá)到治療AA淀粉樣變的效果[7]。

未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)以及熱休克反應(yīng)(heat shock response, HSR)，這兩種通路被認(rèn)為與蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)態(tài)平衡或蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)有一定的相關(guān)性。HSR是當(dāng)細(xì)胞或組織暴露在高溫、毒物、自由基、感染、淀粉樣纖維蛋白的異常沉積等應(yīng)激原作用下，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變、聚合等一系列防御適應(yīng)性反應(yīng)。Hsf1作為HSPs的主要轉(zhuǎn)錄因子，隨著年齡的增長其表達(dá)逐漸下降。而各種具有分子伴侶功能的HSPs通過誘發(fā)HSR激活Hsf1而被誘發(fā)出來，作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的正確折疊、聚合、轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程。大量體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP70等HSPs的高表達(dá)不僅可以有效地抑制亨廷頓病和多聚谷氨酰胺病，還可以有效抑制由α-Synuclein引起的帕金森病[8-10]。在阿爾茨海默病的研究中發(fā)現(xiàn)，HSP70不僅可以抑制細(xì)胞內(nèi)Aβ42的異常聚集，還與細(xì)胞外淀粉樣物質(zhì)的沉積密切相關(guān)[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)HSP無論在天然免疫還是獲得性免疫反應(yīng)中都發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。其中，HSP70具有免疫保護(hù)功能，可與NF-κB、MMPs、ROS等促炎因子相互作用，發(fā)揮抗炎作用。在巨噬細(xì)胞中，HSP70的上調(diào)有效地阻止了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致的炎癥細(xì)胞因子如Tnf-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)增加；在腦出血模型中，HSP70的上調(diào)降低了Tnf-α的表達(dá)，減弱了血腦屏障的破壞、水腫的形成和神經(jīng)功能障礙。TLR4作為一種模式識別受體，其不僅可通過識別LPS等病原相關(guān)分子模式(pathogene-associated molecular patterns, PAMP)而被活化，還可通過高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)、HSPs等損傷相關(guān)分子模式(damageassociated molecular patterns, DAMP)而被活化，從而誘導(dǎo)IL-1β、Tnf-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，發(fā)揮抗炎、自身免疫等效應(yīng)。根據(jù)動(dòng)物和臨床研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的下調(diào)顯著削弱了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrophridine, MPTP)誘導(dǎo)的帕金森小鼠腦部的神經(jīng)炎癥，減少促炎因子Tnf-α和IL-1β的表達(dá)[12]。通過藥理學(xué)阻斷TLR4受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以顯著削弱阿爾茨海默病中神經(jīng)元胞質(zhì)中的Ca2+濃度，防止細(xì)胞凋亡[13]。此外，細(xì)胞外HSP70通過TLR4與巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞相互作用參與先天免疫應(yīng)答[14]。因此，HSP70不僅參與了腎臟正常生理活動(dòng)，而且在急性腎損傷、腎缺血再灌注損傷、慢性腎損傷等過程中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過采用Hsf1-/-型小鼠構(gòu)建腎臟AA淀粉樣變模型，證實(shí)Hsf1的缺失不能有效誘導(dǎo)腎臟HSP70的表達(dá)，加劇了TLR4相關(guān)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了促炎因子的釋放；另一方面，Hsf1的缺失導(dǎo)致了急性炎癥后血清中SAA高表達(dá)，從而為AA淀粉樣變沉積程度的加劇增加了可能性。作為HSP70誘導(dǎo)劑使用的GGA，可以有效的增加腎臟HSP70的表達(dá)來削弱TLR4介導(dǎo)的促炎反應(yīng)，達(dá)到了一定的治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示了Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調(diào)控腎臟AA淀粉變的機(jī)制，為探討腎臟AA淀粉樣變的形成機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)，并為臨床預(yù)防和治療提供了新思路。