circHIPK3通過調(diào)控miR-124-3p/EZH2促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為

蘇 敏，王文祥，唐金明

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第6位和第4位[1]。我國90%食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌，患者預(yù)后較差，5年生存率約15%[2-3]。因此，發(fā)掘食管鱗狀細(xì)胞癌潛在的治療靶點(diǎn)具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)是一種共價(jià)封閉環(huán)狀非編碼RNA，雖然難以被翻譯成蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾而發(fā)揮重要作用[4-6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3(hsa_circ_0000284)參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]，如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]、膀胱癌[12]、結(jié)直腸癌[13]、卵巢癌[14]等。而目前circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用及機(jī)制尚不十分明確。因此，本文通過檢測circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，探討circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和遷移等生物學(xué)功能的影響及可能的分子機(jī)制，為靶向circHIPK3治療食管鱗狀細(xì)胞癌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2017年5月～2018年3月湖南省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除、術(shù)前未接受化療或放療患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織及配對(duì)癌旁組織樣本(距癌組織>3 cm)42例，樣本均經(jīng)病理檢查確診。其中男性26例，女性16例；年齡47～74歲，平均(61.3±5.26)歲。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人正常食管上皮細(xì)胞系HET-1A及食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系KYSE-410、KYSE-510購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，湖南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。鼠抗人EZH2單克隆抗體購自R&D Systems公司；兔抗人Actin抗體、HRP標(biāo)記IgG二抗購自成都正能生物公司；轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉?jiǎng)P基因科技公司；引物設(shè)計(jì)與合成由北京擎科生物公司完成；CCK-8試劑盒購自碧云天生物公司；凋亡試劑盒購自諾唯贊生物公司；Trizol試劑、qRT-PCR試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及ECL發(fā)光試劑盒購自天根生化科技(北京)公司；Transwell小室購自美國Corning公司；RNA抽提試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) HET-1A、KYSE-410和KYSE-510培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，每隔2～3天消化傳代1次，細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.3.2shRNA慢病毒感染 沉默表達(dá)特異性circHIPK3病毒及陰性對(duì)照病毒由上海吉?jiǎng)P基因科技公司提供。應(yīng)用含有針對(duì)circHIPK3特異性的shRNA慢病毒感染KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞作為circHIPK3敲低組，陰性對(duì)照病毒感染KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3.3qRT-PCR檢測 取相應(yīng)的樣本組織或細(xì)胞，用Trizol或RNA抽提試劑盒提取RNA，進(jìn)行定量，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。circHIPK3上游引物5′-GGGTCGGCCAGTCATGTATC-3′，下游引物5′-ACACAACTGCTTGGCTCTACT-3′；EZH2上游引物5′-GCCATTATGGACATCGCGGTGC-3′，下游引物5′-CTTCGCGCTCGCGTGCCG-3′；miR-124-3p上游引物5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。按qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR定量檢測。每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct，采用2-ΔΔCt法計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參檢測circHIPK3的表達(dá)，以U6為內(nèi)參檢測miR-124-3p的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4Western blot法 取適量細(xì)胞，裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，調(diào)節(jié)上樣濃度。恒壓電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，分別以抗EZH2(1 ∶1 000)和Actin抗體(1 ∶5 000)為一抗，以HRP標(biāo)記IgG為二抗(1 ∶5 000)，ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24～96 h；于每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h；酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，用10 μL槍頭沿直尺垂直劃直線。劃線后用不含血清的培養(yǎng)基洗滌2～3次，分別于培養(yǎng)0 h和24 h時(shí)，顯微鏡下拍照并測量劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將BD Matrigel膠與RPMI-1640培養(yǎng)基按1 ∶5比例稀釋，加50 μL稀釋的Matrigel膠至Transwell小室上室。將Transwell小室放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。待膠凝固后，取細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升2×105個(gè)，取50 μL加至Transwell小室上室，將Transwell小室置入24孔培養(yǎng)板(預(yù)先加入500 μL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基)；培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去基質(zhì)膠和小室內(nèi)細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min；洗脫殘余染液，顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8Annexin V-FITC/PI凋亡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種至6孔板，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，收集細(xì)胞，PBS重懸，取(5～10)×104個(gè)重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入10 μL PI，輕輕混勻，冷浴避光放置，上流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9雙熒光素酶檢測報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將293T細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)50%～70%時(shí)，將20 μL DMEM與0.16 μg circHIPK3目的質(zhì)粒以及5 pmol miR-124-3p/Negative Control充分混勻，再加入0.3 μL轉(zhuǎn)染試劑充分混勻，室溫放置。在細(xì)胞中加入以上試劑，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后換用新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)說明使用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中circHIPK3的表達(dá)qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，circHIPK3在42例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平顯著高于配對(duì)癌旁組織(P<0.001，圖1A)；circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著高于正常食管上皮細(xì)胞：與HET-1A細(xì)胞相比，circHIPK3在KYSE410和KYSE-510細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為3.06±0.47(P=0.017)和3.63±0.41(P=0.008，圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測circHIPK3的表達(dá)：A.食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織；B.食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和食管上皮細(xì)胞；*P<0.05

2.2 敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞中circHIPK3相對(duì)表達(dá)量(0.42±0.03，0.35±0.05)均明顯低于對(duì)照組(圖2)，表明sh-circHIPK3慢病毒感染能顯著抑制circHIPK3的表達(dá)。

圖2 qRT-PCR檢測sh-circHIPK3慢病毒感染食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后circHIPK3表達(dá)量：*P<0.05

CCK-8檢測結(jié)果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410及KYSE-510細(xì)胞增殖能力均顯著低于對(duì)照組，48 h(P=0.014、0.046)、72 h(P=0.044、0.006)、96 h(P=0.037、0.032)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)；Annexin V-FITC/PI檢測結(jié)果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞的早期凋亡比例均高于對(duì)照組(P=0.007、0.009，圖4)。

圖3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；*P<0.05

圖4 Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)檢測敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.細(xì)胞早期凋亡比例統(tǒng)計(jì)圖；*P<0.05

2.3 敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410及KYSE-510細(xì)胞劃痕愈合度明顯低于對(duì)照組(P=0.013、0.004，圖5)；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P=0.004、0.006，圖6)。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.劃痕愈合度統(tǒng)計(jì)圖；*P<0.05

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；*P<0.05

2.4 敲低circHIPK3對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中miR-124-3p和EZH2表達(dá)的影響為探討circHIPK3發(fā)揮作用的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與circHIPK3結(jié)合的miRNA并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選擇circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，circHIPK3與miR-124-3p具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖7A)。對(duì)circHIPK3的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circHIPK3與miR-124-3p的結(jié)合關(guān)系，結(jié)果顯示miR-124-3p mimics+circHIPK3-wt組熒光素酶活性與NC mimics+circHIPK3-wt組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖7B)。

qRT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，circHIPK3敲低組KYSE-510細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)水平(3.21±0.49)顯著高于對(duì)照組(P=0.016，圖7C)，EZH2 mRNA表達(dá)水平(0.39±0.07)顯著下調(diào)(P=0.004，圖7D)；Western blot分析結(jié)果顯示，EZH2蛋白表達(dá)水平下降(圖7E)。

圖7 敲低circHIPK3對(duì)miR-124-3p和EZH2表達(dá)的影響：A.數(shù)據(jù)庫預(yù)測circHIPK3與miR-124-3p的結(jié)合關(guān)系；B.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circHIPK3與miR-124-3p的結(jié)合關(guān)系；C.qRT-PCR檢測敲低circHIPK3對(duì)KYSE-510細(xì)胞中miR-124-3p表達(dá)的影響；D.qRT-PCR檢測敲低circHIPK3對(duì)KYSE-510細(xì)胞中EZH2 mRNA表達(dá)的影響；E.Western blot法檢測敲低circHIPK3對(duì)KYSE-510細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)的影響；*P<0.05

3 討論

我國是食管癌高發(fā)國家，發(fā)病例數(shù)約占全球病例數(shù)的一半，其中90%患者為食管鱗狀細(xì)胞癌且預(yù)后不佳[2]。近年來大量研究表明，lncRNA、circRNA等非編碼RNA在多種腫瘤中表達(dá)異常，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等一系列過程[5,15-17]。circRNA參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾，可能作為腫瘤的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[18-20]。circHIPK3來源于同源域結(jié)合蛋白激酶3(homeodomain-interacting protein kinase 3, HIPK3)基因的第二外顯子，長1 099 bp，且在多種腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[21-22]。Ba等[23]報(bào)道circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且能通過調(diào)控miR-599/c-MYC信號(hào)通路促進(jìn)TE-13細(xì)胞的增殖。但circHIPK3在其他食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的作用和機(jī)制并不清楚，值得深入研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，這與Ba等[23]的研究結(jié)果一致。此外，circHIPK3在KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞系中高表達(dá)，利用shRNA病毒感染KYSE-410和KYSE-510細(xì)胞敲低circHIPK3表達(dá)，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲均受到抑制，而細(xì)胞凋亡比例上升，提示circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌中可能發(fā)揮促癌作用。

研究顯示，circHIPK3大量存在于細(xì)胞胞質(zhì)中，因此其可能充當(dāng)miRNA的海綿，通過ceRNA機(jī)制影響miRNA靶基因的表達(dá)來發(fā)揮其調(diào)控作用[23-24]。通過生物學(xué)分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選擇circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信號(hào)通路進(jìn)行初步驗(yàn)證。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-124-3p在腫瘤中發(fā)揮重要作用，如miR-124-3p通過調(diào)控ITGB3抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[25]，miR-124-3p在膀胱癌中低表達(dá)且通過調(diào)控EDNRB抑制膀胱癌細(xì)胞增殖[26]。EZH2基因位于人類染色體7q35上，可編碼一種名為組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶的生物酶，是多梳蛋白抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的催化活性亞單位，參與組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化修飾進(jìn)而抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[27-28]。EZH2蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡以及參與耐藥等功能[29-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲低食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中circHIPK3后，miR-124-3p表達(dá)上調(diào)，而EZH2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降；熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也表明，circHIPK3與miR-124-3p有直接結(jié)合作用。上述結(jié)果提示：circHIPK3可能通過影響miR-124-3p/EZH2信號(hào)軸而發(fā)揮功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮促癌作用，提示circHIPK3可能是食管鱗狀細(xì)胞癌的潛在治療靶標(biāo)。然而，本實(shí)驗(yàn)對(duì)于circHIPK3對(duì)miR-124-3p和EZH2的直接調(diào)控作用研究尚淺，circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用機(jī)制還未得到完全驗(yàn)證，本課題組將進(jìn)一步對(duì)circHIPK3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，為其成為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。