山東東營(yíng)地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)母豬子宮內(nèi)膜炎病原菌檢測(cè)與藥物敏感性分析

呂桂霞 劉慧軍 蔣康富 陳立軍 延廷松 孫圣福

（1山東省東營(yíng)市畜牧獸醫(yī)站，山東東營(yíng) 257091；2山東省東營(yíng)市河口區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東東營(yíng) 257000；3山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東濟(jì)南 250100）

母豬子宮內(nèi)膜炎是規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)十分常見的一種疾病，其影響母豬生殖系統(tǒng)，給畜牧業(yè)帶來巨大損失。急性子宮內(nèi)膜炎主要臨床表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜充血水腫，患病嚴(yán)重的母豬還會(huì)出現(xiàn)子宮黏膜脫落或潰瘍，陰道排出暗紅色惡臭液體。慢性子宮內(nèi)膜炎一般情況下沒有明顯的臨床癥狀，或有一部分病豬出現(xiàn)陰道分泌物增多[1]。該病可能會(huì)引起不同階段的母豬發(fā)生疾病，經(jīng)產(chǎn)母豬、初產(chǎn)母豬及后備母豬中均可發(fā)病。引起該病的主要原因有以下3點(diǎn)：一是人工授精過程中可能操作不規(guī)范，導(dǎo)致母豬子宮機(jī)械性損傷，引起炎癥；二是精液中含有細(xì)菌，導(dǎo)致在授精后傳染給母豬；三是母豬采食發(fā)霉變質(zhì)的飼料、生長(zhǎng)環(huán)境差、抵抗力降低等引起的細(xì)菌感染。為了能夠更好地了解山東東營(yíng)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)母豬子宮內(nèi)膜炎感染的情況及主要的致病菌種類，本研究對(duì)12頭患病母豬子宮內(nèi)容物進(jìn)行樣本采集、細(xì)菌培養(yǎng)分離、純化、鑒定、序列及生物信息學(xué)分析、動(dòng)物致病性試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等方法進(jìn)行研究，確定主要的致病菌以及相應(yīng)的敏感藥物，以期為該地區(qū)母豬子宮內(nèi)膜炎的綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2021年在山東東營(yíng)地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，采集具有明顯臨床癥狀的母豬子宮內(nèi)容物12份。分別標(biāo)記為1～12。用0.9%Nacl水溶液反復(fù)沖洗患病母豬陰道，然后用無菌去針頭注射器抽取子宮內(nèi)容物。

1.1.2 主要試劑

伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司、血平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、微生物生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司、細(xì)菌DNA提取試劑盒夠自天根生化技術(shù)有限公司、Extap酶、DNA Marker 2 000購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司，試驗(yàn)用昆明小鼠購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

超凈生物工作臺(tái)購自蘇州凈化儀器設(shè)備有限公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，PCR儀購自德國耶拿分析儀器股份公司，恒溫箱購自濟(jì)南創(chuàng)日新儀器設(shè)備有限公司。顯微鏡購自尼康儀器有限公司，離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離和培養(yǎng)

收集的12頭母豬子宮內(nèi)容物置于滅菌的15 mL離心管中。做好標(biāo)記1～12，取2 mL在12 000 rpm/min下，離心5 min，棄上清液，留300 μL沉淀液混合均勻后做細(xì)菌培養(yǎng)，在血平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基分別接種100 μL混勻的沉淀液體，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的變化、菌落的形態(tài)，通過顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)鑒定菌株，并將分離得到的細(xì)菌進(jìn)行純化。

1.2.2 菌株的生化鑒定

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取單菌落接種到微生物生化鑒定管中，37℃培養(yǎng)1～2 d，根據(jù)生化管中的反應(yīng)及變化，鑒定菌株。

1.2.3 細(xì)菌PCR鑒定及序列比對(duì)

在無菌條件下，挑取細(xì)菌單菌落，根據(jù)細(xì)菌的革蘭氏染色結(jié)果，分別對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌進(jìn)行遺傳物質(zhì)提取，測(cè)定遺傳物質(zhì)的濃度后進(jìn)行細(xì)菌PCR鑒定，引物采用16S rDNA常用引物序列，引物序列上游為 （27F）：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’[2]，引物下游為 （1492R）：5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’。將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳下確定擴(kuò)增成功后，送至華大基因有限公司測(cè)序，得到的數(shù)據(jù)在GENEBANK上進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

確定細(xì)菌種類后使用滅菌的移液槍頭點(diǎn)取單菌落接種于液體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基加入10%犢牛血清，在37℃培養(yǎng)16～24 h，制備出單位濃度為108 CFU/mL的菌液，然后根據(jù)分離到的菌株數(shù)量決定試驗(yàn)組小鼠的數(shù)量，試驗(yàn)組每只小鼠進(jìn)行腹腔注射0.3 mL，每個(gè)菌株注射5只小鼠，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組注射等量的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠是否有死亡或者發(fā)病的癥狀。解剖接種細(xì)菌后感染死亡的小鼠，對(duì)其臟器內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)根據(jù)美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）（2017）推薦的K-B紙片法進(jìn)行操作[3]，根據(jù)CLSI的判定依據(jù)，分為藥物敏感（S）、中等敏感（I）、耐藥（R）3個(gè)種類，從而了解被檢測(cè)菌株的耐藥性，方便臨床應(yīng)用[4,5]。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

12份母豬子宮內(nèi)容物樣本中共分離得到2種細(xì)菌菌株，9株細(xì)菌疑似大腸桿菌，其菌落在血平板上形態(tài)為白色、光滑、圓潤(rùn)、接種于麥康凱培養(yǎng)基的菌落呈紅色、接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基呈黑色，通過革蘭氏染色觀察到100倍鏡下細(xì)菌為紅色、中等大小無芽孢的桿狀細(xì)菌。6種疑似為金黃色葡萄球菌，菌落在血平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài)較厚、呈圓形凸起、可引起血瓊脂平板培養(yǎng)基出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，100倍的鏡下革蘭氏染色后呈紫色，球菌呈現(xiàn)出葡萄串狀，無芽孢。具體病豬子宮內(nèi)容物分離致病菌株見表1，對(duì)菌株進(jìn)行重新編號(hào)（A～O）。

表1 12份母豬子宮內(nèi)容物分離到的細(xì)菌詳情

2.2 生化鑒定結(jié)果

根據(jù)3種細(xì)菌代謝產(chǎn)物的差異，生化鑒定結(jié)果如表2，與表1結(jié)果相符。其中，A～I(xiàn) 9株細(xì)菌在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇中的主要代謝產(chǎn)物為既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；在蔗糖、硫化氫、尿素酶、明膠、檸檬酸鹽中表現(xiàn)陰性不反應(yīng)；在木糖、山梨醇、阿拉伯糖和硝酸鹽中發(fā)生反應(yīng)且會(huì)產(chǎn)酸。根據(jù)以上結(jié)果可初步判定為大腸桿菌。G～O 6株菌株在葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、阿拉伯糖、尿素酶、明膠中發(fā)生陽性產(chǎn)酸反應(yīng)；在木糖、硫化氫、檸檬酸鹽和硝酸鹽中表現(xiàn)陰性不反應(yīng)。初步判定為葡萄球菌。

表2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rDNA基因片段PCR鑒定結(jié)果

對(duì)15個(gè)菌株進(jìn)行DNA提取，并使用16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示分離出的15株細(xì)菌均擴(kuò)出1 500 bp左右的目的條帶（如圖1），將擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序，反饋的測(cè)序結(jié)果在GeneBank上比對(duì)顯示其中9株與大腸桿菌參考株（NR_024570.1）的同源性≥95.9%，分離到的9株細(xì)菌鑒定為大腸桿菌；6株與金黃色葡萄球菌參考株（KF999688.1）的同源性≥97.9%，分離到的6株細(xì)菌鑒定為金黃色葡萄球菌。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

將菌液接種于1組對(duì)照組和15組試驗(yàn)組的小鼠，24 h后試驗(yàn)組小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠正常。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢可見肝臟腫大，將15組小鼠肝臟在無菌環(huán)境下收集，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定后顯示分離到的細(xì)菌與原細(xì)菌為同種細(xì)菌，進(jìn)行單菌落DNA提取以及擴(kuò)增、測(cè)序后所得結(jié)果與原細(xì)菌相同。致病性結(jié)果顯示，在某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)母豬子宮內(nèi)分離到的15株細(xì)菌均具有較強(qiáng)的致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離到的15株細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，9株大腸桿菌的耐藥性顯示該養(yǎng)殖場(chǎng)使用頭孢曲松、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星等藥物對(duì)子宮內(nèi)膜炎效果較好，藥物敏感性較好；大觀霉素、阿莫西林、阿米卡星、多西環(huán)素等藥物的耐藥發(fā)生較多（表3）。由表4可知，該養(yǎng)殖場(chǎng)使用頭孢曲松、氨芐西林、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星等的效果較好，而使用慶大霉素、阿米卡星2種藥物耐藥則無明顯效果，說明分離的6株金黃色葡萄球菌對(duì)慶大霉素和阿米卡星有一定的耐藥性。綜合所述，如果該養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生母豬子宮內(nèi)膜炎時(shí)適合選用頭孢曲松、環(huán)丙沙星、磺胺間甲氧嘧啶進(jìn)行治療可能會(huì)達(dá)到預(yù)期的效果。

表3 9株大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表4 6株金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

母豬子宮內(nèi)膜炎一般情況是由大腸桿菌、葡萄球菌、綠膿桿菌、鏈球菌等致病性微生物引起母豬生殖系統(tǒng)的疾病，如處理不及時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[6]。本試驗(yàn)檢測(cè)的山東東營(yíng)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)母豬子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為大腸桿菌和鏈球菌。2種細(xì)菌對(duì)不同的藥物敏感性差距很大，但通過一系列的科學(xué)診斷治療技術(shù)可以對(duì)該病的防控起到很大的作用。2010年葉健毅等[7]在某發(fā)生子宮內(nèi)膜炎養(yǎng)豬場(chǎng)的樣本中分離出了大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等致病菌，這些致病菌對(duì)林可霉素、頭孢噻呋等藥物敏感性較高。2012年張文波等[8]在4份樣本中分離得到了銅綠假單胞菌、溶血不動(dòng)桿菌、產(chǎn)堿桿菌，且分離的細(xì)菌對(duì)不同藥物敏感性差距較大。2015年諶劍波等[9]在26份樣本中分離到了大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌，藥敏結(jié)果顯示菌群對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感性較好。2020年李淑紅等[10]在8份樣本中均分離出了金黃色葡萄球菌，其對(duì)丁胺卡那、頭孢唑林等藥物中等敏感，其他藥物耐藥。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)母豬子宮內(nèi)膜炎感染的情況已不再是單獨(dú)一種細(xì)菌感染[11-14]，更可能出現(xiàn)兩種或者兩種以上的細(xì)菌同時(shí)感染，且耐藥性越來越嚴(yán)重。

4 總結(jié)

針對(duì)母豬子宮內(nèi)膜炎給養(yǎng)豬場(chǎng)帶來的威脅，建議養(yǎng)豬場(chǎng)做好以下防控。第一，在飼養(yǎng)過程中，不要飼喂母豬霉敗變質(zhì)的飼料，把好養(yǎng)殖場(chǎng)飼料質(zhì)量關(guān)。第二，養(yǎng)殖場(chǎng)一定要做好傳染性疾病的預(yù)防工作，合理使用質(zhì)量過關(guān)的疫苗[15]。第三，加強(qiáng)從業(yè)人員的培訓(xùn)及管理，人工授精時(shí)一定要注意操作規(guī)范，避免傷害母豬陰道及子宮。第四，加強(qiáng)飼養(yǎng)環(huán)境的管理[16]，如在高溫或寒冷的季節(jié)更要注意環(huán)境衛(wèi)生，按照規(guī)定頻率進(jìn)行消毒，防止飼養(yǎng)圈舍內(nèi)衛(wèi)生環(huán)境不達(dá)標(biāo)而引起的大量細(xì)菌的孳生。在母豬發(fā)生子宮內(nèi)膜炎后，獸醫(yī)或飼養(yǎng)員一定要從專業(yè)角度考慮問題，不可濫用抗生素。最好做到精準(zhǔn)診斷，科學(xué)合理用藥，避免濫用藥產(chǎn)生耐藥性。