戊型肝炎病毒感染對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)表達(dá)的影響

王文靜，王玨，禹文海，姜典財(cái)，黃芬

1. 昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，云南昆明650500；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650038；3. 大連雅立峰生物制藥有限公司，遼寧 大連 116000

補(bǔ)體是由肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的，參與免疫效應(yīng)的一類大分子蛋白質(zhì)，是由30 多種可溶性蛋白、膜結(jié)合蛋白和補(bǔ)體受體組成的多分子系統(tǒng)。按照生物學(xué)功能的不同，補(bǔ)體可分為3 種組分：第一類為固有成分，由11 種球蛋白組成（如C1 ~C9 等）；第二類為調(diào)控蛋白，以可溶性膜結(jié)合形式參與補(bǔ)體活化（如CD55 和CD59 等）；第三類為補(bǔ)體受體，可識(shí)別配體，進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)等（如C5aR 和C3aR等）［1-2］。補(bǔ)體系統(tǒng)可選擇性識(shí)別和清除病原體，在機(jī)體先天免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用，是機(jī)體抵抗病毒感染的第一道防線。當(dāng)補(bǔ)體組分含量出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)增加機(jī)體對(duì)疾病的易感性，導(dǎo)致機(jī)體組織器官損傷［3］。如在胰腺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體C3 和C4 的大量沉積［4］；在神經(jīng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)檢測(cè)到 C3、C4 和 CD59 的大量消耗［5-6］；在陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿和再生性貧血等患者中均檢測(cè)到調(diào)節(jié)蛋白CD55 表達(dá)異常［7］。因此，推斷補(bǔ)體可能參與了宿主的自身免疫調(diào)節(jié)。

肝炎病毒的復(fù)制與補(bǔ)體的激活有關(guān)，如慢性乙型肝炎及丙型肝炎患者中C3 和C4 含量相對(duì)于正常人明顯降低；慢性丙型肝炎患者中發(fā)現(xiàn)CD59 含量增多［8-9］。因此，補(bǔ)體的激活在病毒入侵機(jī)體的過程中發(fā)揮重要作用。然而目前對(duì)于戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）復(fù)制過程中補(bǔ)體的研究較少，在HEV 感染過程中補(bǔ)體激活調(diào)控的信號(hào)通路尚不清楚。

HEV 是一種危害人類健康的病毒性肝炎病原體［10］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)顯示，全球每年約有2 000 萬人感染HEV，其中7 萬人死亡，在孕婦中致死率高達(dá)25%［11］。戊型肝炎早期被認(rèn)為是一種急性自限性疾病，孕婦（尤其是妊娠晚期）感染HEV 后容易造成胎兒早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎［12］。在感染HEV 的孕婦中發(fā)現(xiàn)孕期雌激素和孕激素水平明顯升高，孕期激素水平與HEV 的病毒滴度有一定相關(guān)性［13］，這可能導(dǎo)致孕婦在妊娠晚期更易感染HEV。為了解HEV 感染孕婦后對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)控作用，探究補(bǔ)體C3、C4、C3aR、CD55和CD59 在HEV 感染孕婦中的變化，本研究采用免疫比濁法檢測(cè)HEV 感染的孕婦及非孕婦患者血清中的補(bǔ)體固有成分C3 及C4 的表達(dá)水平，RT-qPCR法檢測(cè)HEV 患者全血中補(bǔ)體C3aR、CD55 和CD59的表達(dá)水平，從而探討感染HEV 的孕婦和非孕婦患者中補(bǔ)體水平的變化。

1 材料與方法

1. 1 研究對(duì)象 收集云南省昆明市婦幼保健院HEV 感染孕婦（n = 20）及非孕婦全血樣本（n = 20），置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。研究?duì)象均排除甲肝、乙肝、丙肝和丁肝等肝炎病毒感染。

1. 2 主要試劑及儀器 Trizol 試劑購自美國Axygen公司；RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄酶（Rtase M-MLV）、RNA酶抑制劑、RT-qPCR 試劑（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）均購自寶生物工程（大連）有限公司；免疫比濁法檢測(cè)試劑和Array 360 特種蛋白分析儀均購自美國Beckman 公司。

1. 3 HEV 感染孕婦及非孕婦患者血清中補(bǔ)體固有成分C3 及C4 水平的檢測(cè) 采用免疫比濁法。取HEV 陽性患者血清，采用Array 360 特種蛋白分析儀檢測(cè)血清樣本中補(bǔ)體C3、C4 水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。人血清中補(bǔ)體C3 的正常范圍為 0. 7 ~ 1. 28 g ／ L，補(bǔ)體 C4 的正常范圍為 0. 17 ~0. 48 g ／ L。

1. 4 HEV 感染孕婦及非孕婦患者全血中HEV 滴度及補(bǔ)體C3aR、CD55 和CD59 表達(dá)水平的檢測(cè) 采用RT-qPCR 法。用Trizol 試劑提取全血中總RNA，用MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及HEV 特異性引物（引物序列見表1，由上海捷瑞生物工程有限公司合成）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以合成的cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系：cDNA 樣品 1 μL，上下游引物各 0. 2 μL，2 ×ChamQ SYBR Color qPCR Mix 5 μL，添加無菌無酶水至 10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，60 ℃31 s，共 39 個(gè)循環(huán)；溶解曲線形成，65 ℃升至 95 ℃，每5 s 升高0.5 ℃，陰性對(duì)照排除PCR 污染。對(duì)HEV滴度進(jìn)行絕對(duì)定量分析，按2-（目的基因△Ct-GAPDH△C）t對(duì)目的基因C3aR、CD55 和CD59 進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列Tab. 1 Primer sequences for PCR amplification

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用t 檢驗(yàn)確定兩組間差異的顯著性，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 HEV 滴度 與非孕婦患者相比，孕婦患者全血中HEV 的拷貝數(shù)變化顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =7. 006，P < 0. 001），見圖 1。表明 HEV 感染孕婦后促進(jìn)病毒的復(fù)制。

圖1 孕婦及非孕婦患者中HEV 滴度Fig. 1 HEV titers in pregnant and non-pregnant women

2. 2 血清中補(bǔ)體固有成分C3 及C4 水平 孕婦患者血清中補(bǔ)體C3 水平為0. 95 ~ 1. 63 g ／ L，顯著高于非孕婦患者血清中補(bǔ)體 C3 水平（0. 09~1. 58 g ／ L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 35. 41，P < 0. 001），表明HEV感染激活患者血清中C3 的表達(dá)。孕婦患者血清中補(bǔ)體 C4 水平為 0. 04 ~ 0. 435 g ／ L，高于非孕婦患者血清中補(bǔ)體 C4 水平（0. 005 ~ 0. 336 g ／ L），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 5. 538，P < 0. 05），但大部分患者血清中C3、C4 水平均在正常值范圍內(nèi)，表明HEV 感染對(duì)補(bǔ)體C4 水平無明顯影響。見圖2。

圖2 HEV 感染孕婦及非孕婦血清中補(bǔ)體固有成分C3（A）及 C4（B）水平的檢測(cè)Fig. 2 Expression levels of C3（A）and C4（B）in sera of HEV-infected pregnant and non-pregnant women

2. 3 全血中補(bǔ)體C3aR、CD55 和CD59 的表達(dá)水平與未感染HEV 的非孕婦患者相比，感染HEV 的非孕婦患者全血中補(bǔ)體C3aR 表達(dá)水平較顯著上升（t=11. 32，P < 0. 01），補(bǔ)體 CD55 表達(dá)水平顯著上升（t =6. 293，P < 0. 05），補(bǔ)體 CD59 表達(dá)水平無明顯差異（t = 1. 194，P>0. 05）。與未感染HEV 的孕婦相比，感染HEV 的孕婦患者全血中補(bǔ)體C3aR 和CD55 表達(dá)水平均極顯著上升（t 分別為37.92 和46.32，P均 <0. 001），補(bǔ)體 CD59 表達(dá)水平顯著上升（t = 9. 624，P < 0. 05）。表明HEV 感染會(huì)激活補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的大量表達(dá)。與感染HEV 的非孕婦相比，感染HEV 的孕婦補(bǔ)體C3aR、CD55 及CD59 的表達(dá)水平更高，見圖3。表明HEV 感染會(huì)促進(jìn)患者補(bǔ)體其他成分C3aR、CD55、CD59 表達(dá)量增加，且孕婦患者顯著高于非孕婦患者。

圖3 HEV 感染補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和補(bǔ)體受體的表達(dá)的促進(jìn)作用Fig. 3 HEV infection promotes expression of complement regulatory protein and complement receptor

3 討 論

作為有機(jī)體天然免疫的一部分，補(bǔ)體的激活參與了病原體的識(shí)別、清除過程［3］。近期一些研究熱衷于宿主先天免疫蛋白，如補(bǔ)體固有蛋白、級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)受體、產(chǎn)物（C3、C3aR、C5aR 和 C5adesArg 等）與炎癥反應(yīng)的關(guān)系等［14-16］。正常人血清中的補(bǔ)體含量不隨機(jī)體的免疫反應(yīng)增強(qiáng)而升高，基本趨于穩(wěn)定狀態(tài)。肝臟是合成補(bǔ)體的主要場(chǎng)所，因此補(bǔ)體含量的變化對(duì)監(jiān)測(cè)肝病患者肝臟損傷程度有一定的價(jià)值［2］。作為血清中含量最高的補(bǔ)體成分，C3 是各種補(bǔ)體激活途徑的匯合點(diǎn)，在補(bǔ)體調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮重要作用，因此C3 測(cè)定可反映總補(bǔ)體水平，是衡量體液免疫的重要指標(biāo)［17］。研究同樣發(fā)現(xiàn)，C4 的缺陷會(huì)使細(xì)胞發(fā)生持續(xù)感染，引起自身免疫攻擊［18］。CD55 作為一種補(bǔ)體抑制劑，可以抑制C3、C4 裂解避免補(bǔ)體異常激活導(dǎo)致的損傷［19］。有報(bào)道稱，補(bǔ)體的激活與肝臟炎癥的發(fā)展及腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如在腎炎患者及肝炎患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體表達(dá)量發(fā)生變化［4，8，20］。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，HIV-1、麻疹病毒和柯薩奇病毒CVB3等均可導(dǎo)致補(bǔ)體在體內(nèi)的異常表達(dá)，促進(jìn)病毒在體內(nèi)持續(xù)復(fù)制［21］。這也預(yù)示了補(bǔ)體在病毒入侵機(jī)體過程中發(fā)揮重要作用，可能通過調(diào)控補(bǔ)體組分以治療相關(guān)疾病。

本研究對(duì)HEV 感染患者的血清和全血進(jìn)行檢測(cè)，探究不同人群HEV 感染患者補(bǔ)體表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HEV 感染會(huì)激活非孕婦患者及孕婦患者補(bǔ)體C3、C3aR、CD55、CD59 的表達(dá)水平，且在孕婦患者中顯著增高。補(bǔ)體的激活參與機(jī)體抗HEV 的過程，但HEV 感染患者中孕婦由于體內(nèi)激素的調(diào)節(jié)及自身抗病毒能力較弱，使得HEV 感染在孕婦中死亡率較高，說明HEV 在孕婦體內(nèi)補(bǔ)體水平的升高可能是導(dǎo)致孕婦體內(nèi)病毒復(fù)制能力較強(qiáng)的原因之一。因此，研究孕婦體內(nèi)補(bǔ)體激活與病毒復(fù)制的關(guān)系顯得尤為重要，但有關(guān)補(bǔ)體表達(dá)參與免疫效應(yīng)的機(jī)理仍需進(jìn)一步研究?？赏ㄟ^阻斷補(bǔ)體的激活來預(yù)防HEV在孕婦體內(nèi)的復(fù)制，預(yù)防疾病的發(fā)生。本研究證明，HEV 感染調(diào)控補(bǔ)體系統(tǒng)的表達(dá)，HEV 感染孕婦患者體內(nèi)補(bǔ)體表達(dá)大量增加，這為進(jìn)一步探討HEV 在孕婦中的致病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。