生物炭與氮肥配施對植煙土壤微生物及碳氮含量特征的影響

馮慧琳，何歡輝，徐 茜，李小龍，張 帆，姬小明，徐辰生*，任天寶*，劉國順

（1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/河南省生物炭研究工程技術(shù)中心，河南 鄭州 450002；2．福建省煙草公司南平市公司/南平煙草科學(xué)研究所，福建 南平 353000；3．龍巖市煙草公司上杭分公司，福建 龍巖 364200）

土壤健康培育和根際微生物調(diào)控是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)綠色高質(zhì)量發(fā)展的重要基礎(chǔ)和途徑［1］。生物炭作為一種土壤改良劑具有較強(qiáng)的吸附力、極大的比表面積和發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)，在土壤微生態(tài)調(diào)控、土壤固碳培肥和緩解溫室效應(yīng)等方面具有良好的效應(yīng)［2-5］。土壤微生物是土壤生態(tài)的重要組成部分，微生物的數(shù)量和新陳代謝的變化都會(huì)直接作用于土壤，使土壤養(yǎng)分及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［6-7］。Prayogo等［8］研究發(fā)現(xiàn)生物炭能夠改變土壤微生物定殖棲息地的理化性質(zhì)，從而改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)Ameloot等［9］也發(fā)現(xiàn)生物炭能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁┮粋€(gè)舒適的棲息環(huán)境，刺激土壤微生物發(fā)生改變。

氮是植物必需的營養(yǎng)元素之一，是限制作物產(chǎn)質(zhì)量的重要因子，氮肥施用過多或不足均會(huì)對土壤及環(huán)境造成不良影響［10-12］。近年來有大量研究表明，生物炭能夠提升土壤氮素利用率［13-14］，Wang等［15］研究發(fā)現(xiàn)生物炭增加了土壤中有效氮、磷、鉀的含量，改變了土壤物理結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了烤煙根系的健康發(fā)展。Oladele等［16］研究發(fā)現(xiàn)生物炭與氮肥配施能夠減少硝酸鹽的淋失、提高水稻產(chǎn)量和土壤養(yǎng)分的有效性。Chaplot等［17］研究證明基于山核桃生產(chǎn)的生物炭能夠減少土壤中硝酸鹽的浸出。因此，人們把目光聚集在生物炭與氮肥減施上，以期探究出最有利于土壤健康和可持續(xù)性發(fā)展的精準(zhǔn)施肥模式。沈仁芳等［18］提出，土壤研究已經(jīng)從單一的生產(chǎn)功能研究階段進(jìn)入到生產(chǎn)、環(huán)境、生態(tài)多目標(biāo)多功能系統(tǒng)的研究階段。本研究基于土壤健康、土壤微生態(tài)環(huán)境發(fā)展的角度，在邵武煙區(qū)深入開展植煙土壤施加生物炭并采取減氮措施試驗(yàn)，從土壤-根系-微生物互作過程對植株養(yǎng)分高效利用的影響入手，以期為我國植煙土壤健康培育和綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2018年2～10月在福建省南平市邵武市沿山鎮(zhèn)進(jìn)行，該煙區(qū)為煙稻輪作，植煙土壤均為砂壤土，土壤基本理化性質(zhì)見表1。試供烤煙品種為K326，由福建省南平市邵武市公司提供。試驗(yàn)小區(qū)選擇有代表性、前茬作物一致、土壤肥力均勻、肥力中等水平的地塊。生物炭由河南省生物炭工程技術(shù)研究中心提供，原材料為花生殼，在380～400℃條件下低氧、連續(xù)炭化5～6 min制得，粉碎后過篩（孔徑2.00 mm），其基本理化性質(zhì)見表2。

表1 土壤基本理化性質(zhì)

表2 生物質(zhì)炭基本理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)一個(gè)空白對照、一個(gè)常規(guī)施肥、4個(gè)不同生物炭用量配合不同程度的減氮處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，6個(gè)處理具體的施肥配比及小區(qū)面積見表3?？瞻讓φ誄K1不施加任何肥料，CK2按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥模式為：煙草專用肥525 kg/hm2（N：12.5%，P2O5：8.0%，K2O：22.5%）、芝麻餅肥675 kg/hm2（N：5.8%，K2O：1.3%）、鈣鎂磷肥459 kg/hm2、氫氧化鎂187.5 kg/hm2、硝酸鉀345 kg/hm2、硫酸鉀300 kg/hm2，氮、磷、鉀比例為1∶0.78∶2.87。施肥處理的氮肥基、追肥比例為7∶3（70%作為基肥，30%作為追肥），基肥采用條施，追肥于移栽后30 d施用。

表3 試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)于2月23日進(jìn)行煙田整地、施肥及起壟工作，所有物料于起壟前一天條施，施用生物炭后，將其他物料混勻后撒施于生物炭上。煙苗于3月4日進(jìn)行移栽，采用膜下移栽方式，5月8日開始逐一打頂，5月18日開始進(jìn)行煙葉采烤。該試驗(yàn)區(qū)煙葉于7月11日全部采收完，7月27日煙葉全部烘烤完畢。

1.3 土壤養(yǎng)分及碳、氮含量分析方法

在煙株移栽后45、60、75、90 d時(shí)，根據(jù)5點(diǎn)取樣法確定取樣點(diǎn)，用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中煙株的任何側(cè)根，挖出煙株整個(gè)根部。將根球放入盆中，搖動(dòng)根部，用鏟子從根部去除土壤，采集盆中的土壤放入密封袋中，常溫避光條件下風(fēng)干、磨細(xì)、過篩，進(jìn)行土壤樣品分析。測定方法參照文獻(xiàn)［19］，有效磷測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀測定采用0.5 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法；堿解氮測定采用堿解擴(kuò)散法；稱取過0.149 mm篩的風(fēng)干土樣20 mg，采用 VarioEL III 型元素分析儀測定樣品中的全碳含量。

1.4 土壤微生物分析方法

在煙株移栽后75 d時(shí)，根據(jù)5點(diǎn)取樣法確定取樣點(diǎn)，用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中煙株的任何側(cè)根，挖出煙株整個(gè)根部。將根球放入盆中，搖動(dòng)根部，用鏟子從根部去除土壤，采集盆中無碎塊的土壤5～10 g，除去植物根、動(dòng)物殘骸及其他雜質(zhì)，混勻過2 mm篩，保存在10 mL無菌離心管中，用干冰保存送往上海美吉生物科技有限公司，對采集的土壤樣品進(jìn)行土壤微生物多樣性檢測。

土壤DNA提取和PCR擴(kuò)增：用E.Z.N.A.?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross GA USA）提取總DNA，DNA的濃度和純度利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific公司）來進(jìn)行檢測，DNA提取質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳來檢測；細(xì)菌16S rRNA用338F（5′-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌18S用SSU0817F（5′-TTAGCAT GGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTG GACCTGGTGAGTTTCC-3′）引 物 對V5～V7可 變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［20］，擴(kuò)增的程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型）。擴(kuò)增體積為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmoL dNTPs，0.8 μL引物（5 Um），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

Illumina Miseq測序：PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫，構(gòu)建文庫步驟：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2016分析數(shù)據(jù)，用DPS 7.0分析處理數(shù)據(jù)，方差分析采用最小顯著性差異法。微生物處理使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序 列 進(jìn) 行Operational Taxonomic Units（OTUs）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifie對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。韋恩圖分析時(shí)選用相似水平為97%的OTUs的樣本表，利用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖?？梢暼D利用Circos-0.67-7軟件。Qiime計(jì)算beta多樣性距離矩陣，R語言vegan軟件包進(jìn)行NMDS分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭與氮肥配施對土壤有效磷、速效鉀、堿解氮含量的影響

有效磷是土壤中可被植物吸收的磷組分，能夠促進(jìn)植物早期根系的形成和生長，提高植物適應(yīng)外界環(huán)境的能力，可增強(qiáng)植物的抗旱性及抗寒性。從圖1可以看出，各處理的有效磷含量隨著生育期的增加而減少，在移栽后75 d生物炭與減氮處理的有效磷含量高于CK2處理。在移栽后90 d時(shí)差異最明顯，T1至T4的有效磷含量與CK2相比分別增加了31.81%、47.15%、82.22%、32.87%。說明生物炭與減氮處理能夠增加土壤中的有效磷含量，且以T3處理增幅最大。

煙株對鉀素的吸收是在烤煙生長發(fā)育的早期，因此保證早期的鉀素供應(yīng)是十分必要的。從圖2可以看出，T4處理在煙草移栽后60 d時(shí)土壤中速效鉀的含量最大，達(dá)276.87 mg/kg，顯著高于未加生物炭的處理。T4處理在煙草的4個(gè)生育期里，土壤速效鉀含量都顯著高于CK2，分別顯著增加了11.89%、35.11%、25.95%、15.85%。說明生物炭與減氮處理能夠在煙株生長前期保證土壤中鉀素含量以供煙葉吸收。

土壤中的堿解氮含量能夠反映煙株對氮素的吸收、利用情況，堿解氮含量的提升會(huì)使土壤的供氮能力增強(qiáng)，能夠滿足煙株對氮素的需求，促進(jìn)植株對養(yǎng)分的吸收。從圖3能夠看出，生物炭與減氮處理能夠提升土壤堿解氮的含量，其中移栽后45、60、75 d以T3處理的堿解氮含量最大，移栽后45 d含量為187.92 mg/kg，較CK2處理增加了16.66%。4個(gè)生物炭配合減氮處理在移栽后90 d時(shí)均與CK2處理存在顯著性差異，分別較CK2處理增加了7.21%、8.03%、12.41%、12.76%。

2.2 生物炭與氮肥配施對土壤全碳含量及土壤碳氮比的影響

在煙草生長前期，常規(guī)施肥與生物炭配合減氮處理部分存在顯著性差異，但隨著生長期的增加，差異越來越不顯著，到成熟期時(shí)，各處理間的全碳含量不存在顯著性差異。由圖4可以看出，移栽后45 d時(shí)，T1至T4的全碳含量較CK2分別增加了1.29%、3.89%、12.44%、5.62%。在整個(gè)煙草生育期中T3處理土壤的全碳含量一直高于其他處理，除移栽后90 d與CK2不存在顯著性差異外，其它3個(gè)時(shí)期均與CK2差異顯著，且4個(gè)時(shí)期較CK2分別增加了12.44%、18.48%、16.58%、6.15%。所以在土壤中施加生物炭與減氮處理會(huì)使土壤全碳含量在煙草生育前期有所增加，且以T3處理效果最佳。

由圖5可以看出，施用生物炭能夠提升土壤碳氮比，生物炭高添加量的提升作用大于低添加量。隨著煙草生育期的增加，各處理之間土壤碳氮比差距減少。從煙草整個(gè)生育期來看，T3、T4處理的土壤碳氮比始終與CK1、CK2處理存在顯著性差異，且4個(gè)時(shí)期T4處理較CK2處理分別增加了5.44%、4.85%、2.57%、4.18%。

2.3 生物炭與氮肥配施對土壤微生物的影響

2.3.1 土壤微生物樣本測序的結(jié)果

所有樣本真菌測序共獲得1523483條有效序列，細(xì)菌測序共獲得1581998條有效序列。由圖6（a）能夠看出，細(xì)菌中所有樣本所共有的OTUs總數(shù)為1715，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4處理所特有的OTUs數(shù)目分別為59、35、19、3、7、3。由圖6（b）能夠看出，真菌中所有樣本所共有的OTUs總數(shù)為161，CK1、CK2、T1、T2、T3、T4處理所特有的OTUs數(shù)目分別為6、1、4、5、2、4?？偟膩碚f，生物炭與氮肥配施處理較CK1、CK2處理在細(xì)菌中的差異較大。

2.3.2 土壤微生物物種組成

不同樣本中優(yōu)勢菌種的組成是相似的，但是每一菌種在每一樣本中所占的比例是完全不同的。通過可視化圈圖來展現(xiàn)每個(gè)處理中優(yōu)勢物種的分布比例及各優(yōu)勢物種在不同處理中的分布比例。由圖7（a）可以看出，土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌綱是放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedono-bacteria）和酸桿菌綱（Acidobacteria）。4個(gè)生物炭配合減氮處理的放線菌綱相對豐度較CK2處理分別減少了16.67%、11.11%、22.22%、5.56%，4個(gè)生物炭配合減氮處理的酸桿菌綱相對豐度較CK2處理分別減少了18.75%、0.00%、11.11%、11.11%，說明生物炭與減氮處理會(huì)減少放線菌綱（Actinobacteria）及酸桿菌綱（Acidobacteria）的相對豐度。T2處理的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）相對豐度最高，較CK1、CK2處理分別增加了23.53%、9.52%。由圖7（b）可以看出，土壤真菌的優(yōu)勢菌綱為糞殼菌綱（Sordariomycetes）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）、子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）。T1處理的糞殼菌綱（Sordariomycetes）相對豐度最高，較CK1、CK2處理分別增加了29.41%、15.79%。各處理散囊菌綱（Euroti om ycetes）相對豐度大小排列為：T2>CK1>T3>T4>T1=CK2，說明常規(guī)施肥會(huì)降低土壤中散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度，但是通過生物炭與氮肥配施能夠減緩降低作用，使其相對豐度提升，隨著生物炭用量和減氮比例的增加，散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）的相對豐度隨著生物炭用量和減氮比例的增加，呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，到T3處理相對豐度達(dá)到最低，T4處理的相對豐度最高，較CK2處理增加了86.67%。

2.3.3 土壤微生物β多樣性

基于Bray-Curtis距離對6個(gè)處理的土壤細(xì)菌群落組成進(jìn)行NMDS分析。由圖8（a）能夠看出CK1的土壤細(xì)菌群落與其余5個(gè)處理存在明顯差異，T3、T4處理的土壤細(xì)菌群落組成更加相似。由圖8（b）可知，T2、T3、T4處理的土壤真菌群落更加相似，與T1處理存在明顯差異，說明生物炭用量和減氮比例的增加會(huì)導(dǎo)致土壤微生物真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；與CK1、CK2處理也存在明顯的差異，說明生物炭與氮肥配施會(huì)影響土壤微生物真菌菌群結(jié)構(gòu)。

3 討論

3.1 生物炭與減氮措施配合對土壤養(yǎng)分及碳含量的影響

生物炭本身的養(yǎng)分含量很低，但因其獨(dú)特的物理特性，如較高的比表面積和較大的孔隙度，能夠吸附土壤中的氮、磷、鉀元素，減少它們的淋失［21］。由上述結(jié)果來看，植煙土壤中施入生物炭會(huì)改變土壤的養(yǎng)分情況，添加生物炭后能夠提高土壤有效磷、速效鉀的含量，Laird等［22］研究發(fā)現(xiàn)生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)對肥料養(yǎng)分的延長釋放有作用，能夠降低養(yǎng)分損失，增加土壤磷鉀的有效性，與本文的研究結(jié)果相印證。但本試驗(yàn)會(huì)出現(xiàn)生物炭施用量大的處理有效磷含量小的情況，如移栽后90 d時(shí)，T3處理的有效磷含量大于T4處理。張阿鳳等［23］的研究表明，適宜用量的生物炭不僅能夠減少土壤有效磷的淋溶和固定，還可以吸附一部分的磷酸根，使得土壤有效磷含量增加幅度較大；但是過高用量生物炭對土壤的影響僅以吸附土壤的磷酸根為主，因此會(huì)導(dǎo)致有效磷含量增幅小，與本文的研究結(jié)果相印證。本研究中隨著生物炭施用量的增加土壤中速效鉀的含量也增加，這與前人的研究基本一致［24］。并且，這與生物炭能夠提高土壤持水性有關(guān)，聶新星等［25］研究發(fā)現(xiàn)，土壤水分狀況是影響土壤鉀素固定和釋放的重要因素，生物炭施入土壤后能夠通過提高土壤持水能力從而影響土壤鉀素含量。本研究發(fā)現(xiàn)生物炭能夠增加土壤中的全碳含量及碳氮比，這與前人的研究相似［26］，且發(fā)現(xiàn)全碳和碳氮比均隨著生物炭用量和減氮比例的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，進(jìn)一步證實(shí)了生物炭能夠保持土壤中的有機(jī)質(zhì)不被降解和淋溶，且因其性質(zhì)穩(wěn)定施加到土壤中能夠有助于土壤中腐殖質(zhì)的形成，從而增加碳含量［27］。劉玉學(xué)等［28］研究表明，生物炭對NH4+、NO3-具有較強(qiáng)的吸附作用，因此土壤中添加生物炭能夠減少氮素的淋溶，增加土壤中的氮素含量。對比CK2處理，生物炭處理能夠增加土壤中的堿解氮含量，且存在顯著性差異，與梁忠厚等［21］的研究結(jié)果相同。但是較高生物炭施用量及減氮的T4處理堿解氮含量卻小于T3處理，主要原因是過量生物炭聚集在植株根際土壤區(qū)域，土壤微生物活性受到抑制，降低土壤氮素的有效性，從而表現(xiàn)為土壤氮含量的降低。

3.2 生物炭與減氮措施配合對土壤微生物的影響

土壤微生物是土壤中氮、碳等營養(yǎng)元素循環(huán)與轉(zhuǎn)化的動(dòng)力源泉，會(huì)通過降解凋落物等有機(jī)物質(zhì)，釋放植物能夠利用吸收的養(yǎng)分，從而幫助土壤保持有效肥力［29-31］。從土壤微生物的韋恩圖和NMDS分析圖可以看出，生物炭與減氮措施配合對土壤細(xì)菌的影響大于對土壤真菌的影響。可能與生物炭能夠提高土壤的pH［32］有關(guān)，一般有利于細(xì)菌繁殖的土壤pH高于有利于真菌繁殖的土壤pH［33］。施用生物炭對土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，生物炭與氮肥配施處理較CK2處理增加了α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、纖線桿菌綱（Ktedonobacteria）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）和子囊菌門某綱（norank_p_Ascomycota）的相對豐度。有研究表明生物炭具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁┮粋€(gè)更好、更舒適的棲息環(huán)境，能夠刺激土壤微生物的相對豐度發(fā)生改變，有利于某些細(xì)菌、真菌的生長，與本文研究結(jié)果相印證［32］。本文也發(fā)現(xiàn)生物炭與氮肥配施處理較CK2處理放線菌綱（Actinobacteria）及酸桿菌綱（Acidobacteria）的相對豐度減少，可能是由于本文的生物炭與氮肥配施處理采用了減少氮肥的措施，導(dǎo)致土壤中的氮素較CK2沒有那么的充足而不能很好地支撐某些細(xì)菌的生長代謝過程，從而引起某些細(xì)菌相對豐度的降低［34］，不過放線菌綱（Actinobacteria）多為致病菌，該菌的減少會(huì)降低土壤病害的發(fā)生概率，從而更加有利于土壤健康。

4 結(jié)論

生物炭與減氮處理能夠在煙草的生長過程中改變植煙土壤的養(yǎng)分情況，適當(dāng)減氮與生物炭的添加能夠促進(jìn)土壤碳氮平衡，改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，使土壤向一個(gè)更加健康的環(huán)境改變，表明生物炭能夠滿足我國植煙土壤改良的同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)“雙減”，對烤煙實(shí)施肥料減施、有機(jī)肥替代部分無機(jī)肥的施肥措施提供理論依據(jù)。綜上所述，以T3（常規(guī)施肥+氮肥80 kg/hm2+生物炭1350 kg/hm2）模式對土壤動(dòng)態(tài)養(yǎng)分的影響最符合烤煙不同生育期養(yǎng)分需求，有利于土壤健康、土壤培育和植物根際土壤微生物調(diào)控。