氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定醫(yī)用橡膠彈性體中的12種N-亞硝胺殘留量

劉愛娟， 劉雪婷， 薄曉文， 孟 凱， 亓曉慶， 沈 永*

(1.山東省醫(yī)療器械產品質量檢驗中心,山東濟南 2501012.山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室,山東濟南 2501013.國家藥品監(jiān)督管理局藥品包裝材料質量控制重點實驗室,山東濟南 250101)

N-亞硝胺是具有-N-N=O官能團的—類物質的總稱，屬于強致癌有機化合物。橡膠制品中的N-亞硝胺主要產生于橡膠的高溫硫化成型過程。在特定的使用環(huán)境下，橡膠制品中殘留的N-亞硝胺可能被釋放出來，進而通過呼吸道、消化道、皮膚吸收或血液循環(huán)等方式進入人體，對人體造成巨大危害[1]。我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心2018年發(fā)布的《化學藥品與彈性體密封件相容性研究技術指導原則(試行)》中，明確要求密封件中應關注亞硝胺及類似結構化合物的檢出。亞硝胺、亞硝基類物質在現(xiàn)有分析技術條件下應不得檢出(歐盟指令為亞硝胺浸出不得過0.01 mg/kg彈性體，亞硝基類物質浸出不得過0.1 mg/kg彈性體)。由于現(xiàn)有國家標準(GB/T 24153-2009)《橡膠及彈性體材料N-亞硝基胺的測定》中的方法的測定下限為0.5 mg/kg，不能滿足安全性評價的需求，因此需建立更加靈敏的分析方法。

近年來，國內外對亞硝胺殘留測定的研究較多，但多集中在食品[2 - 6]、水[7,8]和各種日用橡膠制品，如橡膠密封材料[9,10]、嬰兒奶嘴[11,12]、橡膠玩具[13 - 15]，橡膠手套[16,17]及避孕套[18,19]，在藥劑中也有涉及[20]，而對醫(yī)用橡膠材料中殘留的亞硝胺類物質評價工作開展較少[21]。由于各種不同種類的橡膠制品在藥品包裝材料及醫(yī)療器械中均有相當數(shù)量的使用，如橡膠塞、注射器活塞及植入類硅橡膠器械等，其臨床使用的特點及與人體接觸方式的特殊性也要求更合理的設計樣品浸提條件，從而科學評估該類產品的安全風險。本研究針對醫(yī)療器械及藥品包裝材料中使用的橡膠彈性體，采用極限浸提法對樣品中的亞硝胺類物質進行浸提，并利用氣相色譜-串聯(lián)質譜儀的選擇反應監(jiān)測(SRM)模式，對49批次醫(yī)用橡膠彈性體中的亞硝胺類物質進行準確定量，為醫(yī)用橡膠材料中殘留的亞硝胺類物質的評價提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ-8000 Evo氣相色譜-串聯(lián)質譜儀(美國，Thermo Fisher公司)；超聲波恒溫清洗機(寧波新芝)；Vortex-2渦旋振蕩器(美國，Scientific Industries)；高速離心機(德國，Sigma公司)；Cleanert Nitro亞硝胺專用凈化管(艾吉爾公司)。

12種亞硝胺標準品(表1)：o2si，批號：353499，純度100 mg/L；內標N-亞硝基二異丙胺(NDiPA)標準品，Dr.Ehrenstorfer GmbH，批號：157733ME，純度100 mg/L；丙酮：色譜純，F(xiàn)isher。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準儲備溶液的配制精密吸取12種亞硝胺標準品適量于容量瓶中，加入丙酮稀釋至1 mg/L，得到亞硝胺標準儲備溶液，于-20 ℃下避光保存。

1.2.2 內標儲備溶液的配制精密吸取NDiPA標準品適量于容量瓶中，加入丙酮稀釋至10 mg/L，得到NDiPA內標儲備溶液，于4 ℃下避光保存。精密移取NDiPA內標儲備溶液適量，加入丙酮稀釋至20 ng/mL，得到NDiPA內標工作溶液，于4 ℃下避光保存。

1.3 色譜-質譜條件

色譜條件：HP-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：270 ℃；柱升溫程序：40 ℃保持2 min，以8 ℃/min的速率升溫至140 ℃，保持5 min，以50 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持10 min(共計31.5 min)；載氣：高純氦；柱流速：1.5 mL/min。不分流進樣，進樣量1 μL。

質譜條件：電子轟擊(EI)電離源，電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃，溶劑延遲：3.5 min；掃描模式：選擇反應監(jiān)測(SRM)模式。質譜參數(shù)見表1。

表1 13種亞硝胺SRM條件

1.4 樣品前處理

對膠塞、活塞、護帽、硅橡膠產品，將其剪碎成3 mm×3 mm左右的小顆粒，按照2 mL/g的比例加入內標溶液，將容器密封并充分混勻，置于40 ℃水浴中超聲浸提1 h，放至室溫后，取浸提液于亞硝胺專用凈化柱中，渦旋混勻后離心，取上清液進樣分析測試。

2 結果與討論

2.1 儀器條件的建立

2.1.1 色譜柱篩選采用12種亞硝胺標準品進行色譜柱篩選。本研究主要對DB-WAX柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm)和HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)兩種色譜柱進行考察。結果表明，HP-FFAP柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)能夠較好地實現(xiàn)12種亞硝胺的分離，且峰形良好，基線背景較低，出峰時間最短，故選擇該色譜柱進行亞硝胺分離。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化通過優(yōu)化色譜分離條件，實現(xiàn)對12種亞硝胺的有效分離，縮短總體運行時間，并增加內標1種。優(yōu)化后的色譜圖見圖1。

圖1 13種亞硝胺總離子流(TIC)色譜圖

2.1.3 質譜條件優(yōu)化對13種亞硝胺進行質譜全掃描，選取特征離子作為母離子，通過二級質譜選擇相應的子離子對，采用儀器自動優(yōu)化SRM離子對的方式進行碰撞能量優(yōu)化，最終確定了定量和定性離子對以及最優(yōu)碰撞能量。優(yōu)化后的質譜參數(shù)見表1，定量質譜圖見圖2。

圖2 13種亞硝胺MRM色譜圖

2.2 樣品極限浸提條件優(yōu)化

2.2.1 浸提溶劑選擇考慮到不同種類亞硝胺的溶解性，首先進行浸提溶劑的篩選。選擇甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷、水5種不同極性的溶劑，分別對廠家A的樣品(已知含有NDPHA和NDBzA)進行浸提，將樣品活塞剪碎成3 mm×3 mm小顆粒，稱取1 g并加入5 mL溶劑，于25 ℃超聲1 h，浸提液經0.45 μm的濾膜過濾后進樣分析。對比后發(fā)現(xiàn)，丙酮對樣品中NDPHA、NDBzA提取效果最好。

此外，為考察溶劑效應，分別使用甲醇、丙酮配制不同濃度標準溶液進樣測試，12種亞硝胺峰面積相近，故可判定甲醇及丙酮對12種亞硝胺溶解及測試無影響。同時，由于甲醇作為溶劑時可能對某些化合物有溶劑效應，因此本研究選用丙酮作為浸提溶劑。

2.2.2 浸提溫度選擇考慮到橡膠彈性體在使用時可能會接觸人體，也可能在較高的室溫下使用，故比較了25 ℃與40 ℃的浸提能力。選用廠家A的樣品，分別在25 ℃和40 ℃超聲0.5 h浸提，取浸提液過濾后測試。結果表明，40 ℃時的浸提效果優(yōu)于25 ℃。同時對標準溶液的超聲穩(wěn)定性進行試驗，配制一定濃度的亞硝胺標準混合溶液，分別在25 ℃和40 ℃超聲0.5 h后進樣測試，結果表明兩種溫度下超聲對標準溶液峰面積無明顯影響。綜合樣品及標準溶液的測試結果，選擇40 ℃為浸提溫度。

2.2.3 極限浸提條件按照2 mL/g的比例加入丙酮，在40 ℃超聲下分別浸提0.5、1.0、1.5 h后，將浸提液過濾后進樣測試，按時間段計算目標物的浸提量，以浸提出測得的累積殘留量無明顯增加的時間作為極限浸提。結果表明，樣品在超聲1 h后，浸提得到的量無明顯增加，故選擇1 h作為極限浸提時間。

2.3 樣品前處理方式優(yōu)化

本研究對C18小柱、亞硝胺專用柱及直接過濾進樣幾種前處理方式進行了比較。傳統(tǒng)的C18小柱需進行柱活化、上樣、淋洗、濃縮等過程，操作比較復雜，而且濃縮過程會導致亞硝胺的揮發(fā)而使回收率偏低；直接過濾進樣會使得萃取液中大量的抗氧劑、添加劑等雜質直接進入色譜柱，帶來系統(tǒng)污染。而使用亞硝胺凈化專用柱只需取浸提液渦旋混勻后離心，即可取上清液進樣測試，該方法操作簡單，可不經過濃縮直接進樣，并能有效減少浸提液中雜質的干擾，減少了樣品損失。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性對空白溶液及樣品溶液分別進樣分析，得到色譜圖3、圖4(標準溶液色譜圖見圖2)。由圖可知，13種亞硝胺可得到完全分離，且空白溶液及樣品基質對化合物出峰無干擾。

圖3 空白溶劑色譜圖(丙酮)

圖4 樣品溶液色譜圖

2.4.2 檢出限與定量限配制不同濃度亞硝胺標準溶液，進樣測試，以信噪比(S/N)=3時的濃度作為該化合物的檢出限；配制不同濃度亞硝胺標準溶液，加入空白橡膠樣品(不含亞硝胺)中，經過極限浸提后過凈化柱，進樣測試，以S/N≥10時的濃度作為該物質的定量限，結果見表2。

表2 12種亞硝胺的檢出限(LODs)及定量限(LOQs)

2.4.3 線性范圍以內標溶液作為溶劑，配制濃度為0.6～200 ng/mL的12種亞硝胺混合標準溶液，優(yōu)化條件下進樣分析。各化合物的線性范圍見表3。

表3 12種亞硝胺的線性方程及線性范圍

2.4.4 精密度與準確度選取低、中、高3個濃度的標準溶液，連續(xù)進樣6次，進行精密度測試，結果見表4。選取空白鹵化丁基膠塞樣品(無亞硝胺)，剪成3 mm×3 mm顆粒，按照2 mL/g的比例加入內標溶液，并分別加入一定濃度的標準溶液，超聲提取，進行回收率試驗。每個化合物選取低、中、高3個濃度，每個濃度平行3次。回收率結果見表4。

表4 12種亞硝胺精密度及回收率

(續(xù)表4)

2.5 樣品測試

選取鹵化丁基橡膠塞產品25批次(來源12個生產廠家，其中進口2家，國產10家)，鹵化丁基橡膠活塞18批次，聚異戊二烯橡膠護帽1批次，硅橡膠醫(yī)療器械5批次進行分析測試。25批次鹵化丁基橡膠塞中有14批次有檢出，檢出NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR及NDBzA 7種亞硝胺。18批次鹵化丁基橡膠活塞均檢出亞硝胺物質，共檢出NDMA、NDEA、NDBA、NEPHA、NPIP、NPYR、NMOR、NDPHA及NDBzA 9種亞硝胺。1批次聚異戊二烯橡膠護帽中檢出NDBzA，5批次硅橡膠醫(yī)療器械中有3批次檢出亞硝胺物質，共檢出NDEA及NDBzA 2種亞硝胺。通過49批次樣品中檢出的N-亞硝胺的種類及含量情況可以看出，12種N-亞硝胺類物質除NEMA、NDPA、NMPHA外，其余9種均有檢出，且NEPHA、NDPHA及NDBzA最高含量均已超過200 ng/g。

從以上試驗發(fā)現(xiàn)，鹵化丁基橡膠活塞中檢出的亞硝胺物質種類最多，共9種，鹵化丁基橡膠塞中檢出了7種亞硝胺物質，醫(yī)用硅橡膠中亞硝胺檢出的種類最少，且含量較低。

膠塞和活塞樣品屬于藥品包裝材料中最為常用的橡膠彈性體，實驗結果顯示，活塞中檢出的亞硝胺種類及數(shù)量均高于膠塞。就材質來講，膠塞和活塞均屬于鹵化丁基橡膠，而活塞中檢出的亞硝胺種類及含量均高于膠塞，可能是由于活塞的生產過程中加入了炭黑，而炭黑的表面積較大，容易吸附氮氧化物，在一定程度上促進了N-亞硝胺的形成[1]，故殘留量較多。

3 結論

本研究針對醫(yī)用橡膠彈性體及硅橡膠等藥品包裝材料和醫(yī)療器械，采用氣相色譜-串聯(lián)質譜儀的選擇反應監(jiān)測(SRM)模式，對膠塞、活塞、護帽及硅橡膠醫(yī)療器械等產品中的亞硝胺類物質進行檢測。建立的方法可對12種亞硝胺及1種亞硝胺內標實現(xiàn)良好分離，線性范圍寬，靈敏度高。對49批次樣品定量分析發(fā)現(xiàn)，目前醫(yī)用橡膠彈性體中仍然有不同程度的亞硝胺殘留。由于檢測的產品種類多數(shù)量大，具有一定的統(tǒng)計學意義，有助于生產企業(yè)和監(jiān)管部門對目前市場上醫(yī)用橡膠彈性體中亞硝胺殘留的風險評定提供技術依據(jù)。