美拉德反應(yīng)對藍(lán)蛤酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

步 營，劉瑛楠，于 玲，祝倫偉，朱文慧，李學(xué)鵬，勵(lì)建榮，于建洋

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.山東時(shí)進(jìn)檢測服務(wù)有限公司，山東榮成 264309；3.榮成泰祥食品股份有限公司，山東威海 264309）

0 引言

藍(lán)蛤（Aloididae aloidi）是一種盛產(chǎn)于我國沿海灘涂的小型低值貝類，富含蛋白質(zhì)，因個(gè)體小而加工困難，主要作為對蝦養(yǎng)殖的活餌料使用[1]。由于對蝦養(yǎng)殖業(yè)萎縮以及餌料的嚴(yán)格控制等原因，導(dǎo)致藍(lán)蛤用量大為減少，因此，藍(lán)蛤等低值貝類資源的高值化利用亟待解決。藍(lán)蛤中含有多種呈味物質(zhì)，其中呈鮮甜味的氨基酸約占氨基酸總量的50%，是制備海鮮調(diào)味料的理想原料[2]，可以采用生物酶解技術(shù)對其進(jìn)行水解處理而加以利用。

美 拉 德 反 應(yīng)（Maillard reaction，MR）是 指羰基類化合物與氨基類化合物之間進(jìn)行的一系列氧化、環(huán)化、脫水和聚合等復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)的統(tǒng)稱，該過程的產(chǎn)物即為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）[3]。在 MR 過程中，生成了具有抗氧化活性的類黑精、還原酮以及揮發(fā)性雜環(huán)化合物（呋喃、吡咯、噻吩和噻唑）[4]。MRPs的抗氧化機(jī)制包含自由基鏈斷裂、清除活性氧、消除過氧化氫和金屬離子螯合等[5]，其中類黑精的抗氧化性得益于具有較強(qiáng)的消除活性氧能力，而還原酮是通過供氫原子而終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。有研究表明，MRPs的抗氧化能力受氨基酸組成、序列和鏈長的影響[6]，肽分子量的大小與MRPs抗氧化活性之間存在關(guān)聯(lián)。徐浩等[7]發(fā)現(xiàn)5～10 ku的河蜆酶解液MRPs具有最高的羥基自由基清除率；LIU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對應(yīng)組（1～5 kDa）相比，木糖 - 大豆肽（＜1 kDa）模型體系產(chǎn)生的MRPs具有更強(qiáng)的抗氧化活性。已有研究證明，超高壓耦合酶解技術(shù)提高了酶的活性，藍(lán)蛤酶解液的水解度和風(fēng)味得到了提升，經(jīng)超高壓處理后的藍(lán)蛤蛋白質(zhì)被分解成了更多的小分子物質(zhì)，酶解液中肽的分子量更低[9]，而常壓和超高壓酶解液經(jīng)MR反應(yīng)后抗氧化能力的對比變化規(guī)律尚未見報(bào)道。

基于此，本文對常壓和超高壓藍(lán)蛤酶解液進(jìn)行MR反應(yīng)，制備MRPs，通過測定其DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、Fe3+還原力、Fe2+螯合活性和羥自由基清除活性5個(gè)方面來評價(jià)藍(lán)蛤酶解液MR后抗氧化能力的變化，以期得到天然抗氧化物，并進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)蛤，購自錦州市林西水產(chǎn)市場；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，購自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、過硫酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、氯化亞鐵、菲啰嗪、硫酸亞鐵、水楊酸，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2 ，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽、鐵氰化鉀，購自北京索萊寶公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2羧酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma公司。上述試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-600/0.6型超高壓設(shè)備（天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Sorvall Stratos型冷凍高速離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)蛤酶解液的制備

將藍(lán)蛤脫殼取肉，取藍(lán)蛤肉加入去離子水（1：1，w/v）后均質(zhì)，分別添加風(fēng)味蛋白酶FlavourzymeTM500MG（0.2%w：v，500 LAPU/g）和 堿 性 蛋 白 酶 NovozymTM11039（0.2% w：v，1.2 AU-A/g），用1.0 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值為7.0，分別在 250 MPa條件下高壓處理 1 h，后置于50 ℃水浴鍋中酶解 4 h，和常壓下酶解 4 h，酶解結(jié)束后 100℃下滅活 10 min。在 4 ℃以 5 120 g離心作用15 min，將上清液冷凍干燥后得到超高壓酶解凍干粉F1，和常壓酶解凍干粉F2，并貯存于干燥器中備用。

1.3.2 美拉德反應(yīng)液的制備

以酶解凍干粉（0.50 g）、D- 木糖（0.20 g）和L-半胱氨酸（0.15 g）為原料，加入試管制備10 mL溶液反應(yīng)體系。將反應(yīng)體系pH值調(diào)為7.0后密封并轉(zhuǎn)移到油浴中，反應(yīng)溫度為120 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1.5 h。將FI和F2的MRPs分別記為MRPF1和MRPF2，未添加D-木糖和L-半胱氨酸的熱反應(yīng)產(chǎn)物作為陰性對照（F1NC和F2NC），未加熱反應(yīng)作為空白對照（F1BC和F2BC）。

1.3.3 DPPH自由基清除活性測定

參照YU等[10]的方法稍作修改。移取10 mL樣液和 10 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L，溶于無水乙醇制得），混合均勻后，于室溫避光放置30 min，隨后在 517 nm 處測定其吸光度（A2）；將 10 mL樣液和10 mL無水乙醇混合，其他操作同上，記為A1；將 10 mL DPPH 溶液和 10 mL 無水乙醇混合，其他操作同上，記為A0。按照下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.3.4 ABTS自由基清除活性測定

參照杜椅楠等[11]的方法稍作修改。將配制好的ABTS溶液（7 mmol/L）與過硫酸鉀溶液（2.4 mmol/L）按 1：1的比例混合后，在 30 ℃避光孵育12 h，制成ABTS自由基儲(chǔ)備溶液。用前以pH=7.4的磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L）為溶劑稀釋ABTS自由基儲(chǔ)備溶液至734 nm下吸光度為 0.7±0.02，取 10 μL 樣品溶液和 4 mL 的 ABTS工作液，振蕩混勻，靜置6 min后在734 nm處測定吸光度。同時(shí)以 6- 羥基 -2，5，7，8- 四甲基色烷 -2-羧酸（Trolox μmol）做標(biāo)曲，依據(jù)方程y=251.96x+41.516，R2=0.987計(jì)算Trolox當(dāng)量。

1.3.5 還原力測定

參照J(rèn)IANG等[12]的方法稍作修改。將0.5 mL樣品溶液與2.5 mL 磷酸鈉緩沖液（pH=6.6，0.2 mol/L）和 2.5 mL 鐵氰化鉀（1 g/mL，K3{Fe（CN）6}）混合，于 50 ℃水浴 20 min。在室溫下加入 2.5 mL 的三氯乙酸（TCA，10 g/mL），并在 3 000 g離心作用15 min，收集上清液。取 1 mL 上清液加入 10 mL超純水和 1 mL FeCl3（0.1 g/mL），充分振蕩后靜置10 min。使用紫外-可見分光光度計(jì)在700 nm處讀取混合物的吸光度。吸光度越高則還原力越高。用吸光度表示結(jié)果。

1.3.6 Fe2+螯合活性測定

參照杜椅楠等[11]的方法稍作修改。取0.2 mL樣品溶液與 0.1 mL FeCl2（2 mmol/L）、4 mL 超純水室溫下混勻，靜置5 min后加入0.2 mL菲啰嗪（5 mmol/L）。室溫下混勻 5 min 后以 479 g離心作用10 min，取上清液在562 nm處測定吸光度（As）。取超純水代替樣品溶液按上述條件測定吸光度（A0）。計(jì)算Fe2+螯合率公式如下：

1.3.7 羥自由基清除活性測定

參照崔燕玲[13]的方法稍作修改。取0.1 mL樣品溶液，加入 2 mL 的 FeSO4（9 mmol/L）、2 mL的水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）和2 mL的H2O2溶液（8.8 mmol/L），混勻后于 37 ℃水浴 30 min，在510 nm處下測得A1；用去離子水代替樣品如上述方法測得A；用去離子水代替水楊酸-乙醇溶液測得A0。計(jì)算清除率公式如下：

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，使用LSD法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表明差異顯著。數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 9軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除活性分析

DPPH自由基可通過氫的貢獻(xiàn)被抗氧化物質(zhì)清除，目前DPPH自由基清除活性測定已被用作評價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)。對超高壓組和常壓組的DPPH自由基清除活性分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果如圖1所示。F1組BC、NC、MRPs的 DPPH自由基清除活性分別為67.8%、67.2%、83.4%，F(xiàn)2組分別為74.3%、75.1%、81.2%。與BC組相比，MRPs組的DPPH自由基清除率從67.8%～75.8%增加到 81.2～83.4%（P＜0.05），其原因可能是由MR中產(chǎn)生的黑色素和低分子量的雜環(huán)化合物導(dǎo)致。BENJAKUL等[14]探究添加不同種類、濃度的糖與豬血漿蛋白進(jìn)行MR后抗氧化活性的變化情況，結(jié)果表明添加2%半乳糖制備的MRPs的DPPH自由基清除活性顯著高于果糖和葡萄糖，并且清除能力與MRPs添加量呈正相關(guān)。超高壓酶解凍干粉F1的分子量低于常壓酶解凍干粉F2。由圖1可知，MRPF1的DPPH自由基清除活性優(yōu)于MRPF2，這與YU等的研究報(bào)道一致，該團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)MR后不同分子量花生肽的DPPH自由基清除活性顯著提高，其中分子量＜1 kDa的MRPs抗氧化活性最強(qiáng)。與BC組相比，NC組的DPPH自由基清除活性差異不顯著（P＞0.05），表明只加熱對DPPH自由基清除活性的變化無明顯影響。綜上所述，MR能增強(qiáng)藍(lán)蛤酶解液的DPPH自由基清除活性，且超高壓酶解液的MRPs的DPPH自由基清除活性優(yōu)于常壓酶解液。

圖1 美拉德反應(yīng)后酶解液的DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH radical-scavenging activity of enzymatic hydrolysate after Maillard reaction

2.2 ABTS自由基清除活性分析

ABTS自由基清除法是常見的用于評價(jià)抗氧化能力的一種方法，其原理是ABTS二銨鹽經(jīng)過硫酸鉀氧化后生成穩(wěn)定的ABTS自由基，該物質(zhì)呈藍(lán)綠色，當(dāng)加入具有抗氧化效果的物質(zhì)后吸光度會(huì)降低[15]。從圖2可看出，藍(lán)蛤酶解液自身就具有一定的清除ABTS自由基能力（1233.1±55.1 μM Trolox/mL），這是由于酶解過程中，蛋白質(zhì)被水解成具有抗氧化能力的多肽和氨基酸，使其清除自由基的能力得到增強(qiáng)。組內(nèi)差異性分析表明，與酶解液相比，熱反應(yīng)產(chǎn)物（F1NC：1 643.3 μM Trolox/mL vs F2NC：1 636.7 μM Trolox/mL）及MRPs（MRPF1：2 253 μM Trolox/mL vs MRPF2：2 226.7 μM Trolox/mL ）具有更高的清除活性，這表明加熱以及MR均能顯著增強(qiáng)藍(lán)蛤酶解液的ABTS自由基清除活性（P＜0.05）。該結(jié)果與已有研究一致，ZHAO等[16]研究表明MR能提升鳳尾魚蛋白酶解液的ABTS自由基清除活性，原因是反應(yīng)過程中形成了具有堿性的雜環(huán)組分和重排肽或低分子量的芳香族氨基酸。本研究中，MRPF1的ABTS自由基能力優(yōu)于常壓，這與杜椅楠等[11]的研究結(jié)果一致，該小組以刺參腸為原料，對其進(jìn)行酶解，制備MRPs并超濾分組，結(jié)果表明分子量＜1 kDa的MRPs抗氧化性最強(qiáng)，其中對ABTS自由基的清除能力達(dá)到4.56 Trolox當(dāng)量/μL樣品。

圖2 美拉德反應(yīng)后酶解液的ABTS自由基清除活性Fig.2 ABTS radical-scavenging activity of enzymatic hydrolysate after Maillard reaction

2.3 還原力活性分析

MRPs具有將Fe3+還原成Fe2+的能力，并且在700 nm處具有最大吸收波長，其還原力越強(qiáng)時(shí)吸光度則越大[17-18]。圖3是藍(lán)蛤酶解液加熱以及MR后還原力的變化情況。由圖可知，酶解液自身同樣具有一定的還原力，但還原力較低（F1BC：0.319 vs F2BC：0.195）。熱反應(yīng)后，其對應(yīng)的加熱產(chǎn)物的還原力有所增長但增幅?。‵1NC：0.361 vs F2NC：0.299）。MR 反應(yīng)后，超高壓耦合酶解液及常壓酶解液的MRPs還原力（MRPF1：0.978 vs MRPF2：0.937）顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。該結(jié)果與以往的研究報(bào)道一致，盧彬[19]研究發(fā)現(xiàn)，金帶細(xì)鲹蛋白酶解液的還原力隨著MR時(shí)間的延長而逐漸提升，并且120 ℃下反應(yīng)6 h產(chǎn)生的MRPs還原力是對應(yīng)100 ℃的2.16倍；NOOSHKAM等[20]研究殼聚糖與菊粉發(fā)生MR后其對應(yīng)的MRPs的還原力大小，結(jié)果表明褐變程度越大的產(chǎn)物表現(xiàn)出越強(qiáng)的還原力，這也證明了還原力大小與類黑精的含量有密切關(guān)聯(lián)。綜上表明，超高壓處理組的還原力更高，原因可能是產(chǎn)生了更多的游離氨基酸，并且MR能顯著提升其還原力。

圖3 美拉德反應(yīng)后酶解液的還原力活性Fig.3 Reducing power of enzymatic hydrolysate after Maillard reaction

2.4 Fe2+螯合活性分析

有研究表明，F(xiàn)e2+、Cu2+等金屬離子對人體中部分酶的活性有所影響，而MRPs能與之螯合形成穩(wěn)定的螯合物，減少自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，表現(xiàn)出一定的抗氧化作用。如圖4所示，各組對Fe2+均有一定的螯合能力，但整體螯合能力較弱，其中BC 組的螯合能力最低（F1BC：21.01% vs F2BC：19.59%），其對應(yīng)的熱反應(yīng)產(chǎn)物的螯合能力有所增強(qiáng)，而MR反應(yīng)后，對應(yīng)的MRPs的Fe2+螯合活性（MRPF1：33.56% vs MRPF2：30.09%）顯著提升（P＜0.05），超高壓處理組比常壓處理組螯合能力更強(qiáng)。杜椅楠等研究發(fā)現(xiàn)分子量＜1 kDa的刺參腸MRPs的Fe2+螯合活性最強(qiáng)，達(dá)到了20.5%左右；盧彬研究發(fā)現(xiàn)，在120 ℃條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，其對應(yīng)的MRPs的Fe2+螯合活性顯著降低，當(dāng)加熱6 h后其Fe2+螯合力相比酶解液減少67.37%；GU等[21]研究表明隨著MRPs濃度的增加，螯合活性增加（0.5 mg/mL：31.24%，2.0 mg/mL：93.87%），并且高分子量組分表現(xiàn)出較高的金屬螯合能力，而低分子量組分則沒有活性。

圖4 美拉德反應(yīng)后酶解液的Fe2+螯合活性Fig.4 Fe2+ chelating activity of enzymatic hydrolysate after Maillard reactio

2.5 羥自由基清除活性分析

如圖5所示，各組樣品對羥自由基均有良好的清除效果，空白對照組、陰性對照組及MRPs各組差異顯著（P＜0.05），其中空白組的清除效果最 低（F1BC：77.14% vs F2BC：74.61%），陰性對照組產(chǎn)物清除效果稍高（F1NC：80.88% vs F2NC：79.39%），而 MRPs組則最高（MRPF1：85.72% vs MRPF2：83.80%）。

上述結(jié)果表明酶解液自身就有較高的羥自由基清除活性，加熱對酶解液的羥自由基清除活性也有顯著的提升，其中MR對其提升最為顯著，超高壓處理對其也有一定的增強(qiáng)。ZENG等研究發(fā)現(xiàn)MR后花生粕酶解液的羥自由基清除活性顯著增強(qiáng)，并且隨著MRPs的濃度增大而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，MR前后酶解液對羥基自由基的清除能力基本相同，然而，在濃度為6 mg/mL時(shí)，差距增加到15%；盧彬研究發(fā)現(xiàn)不同水解度的酶解液的羥自由基清除率不同，呈先增加后減少的趨勢，DH=10.8%的酶解液在濃度為3.5 mg/mL清除羥自由能力最強(qiáng)，并且其MRPs的清除活性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長逐漸降低。

3 結(jié)語

藍(lán)蛤常壓和超高壓酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后，DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、還原力、Fe2+螯合活性和羥自由基清除活性顯著提升（P＜0.05），且超高壓酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPF1）的抗氧化能力均優(yōu)于常壓的MRPF2。熱反應(yīng)產(chǎn)物與酶解液相比，除DPPH自由基清除活性、還原力外，抗氧化指標(biāo)間均有顯著差異（P＜0.05）。綜上所述，藍(lán)蛤酶解液經(jīng)MR后可以顯著提高抗氧化性，進(jìn)一步說明藍(lán)蛤酶解液的MRPs可以作為一種良好的抗氧化劑使用。