藍尾蠑螈皮膚轉錄組及活性多肽分析

唐 興, 王洪亮, 梁廣男, 劉雅莉, 段志貴

(1.衡陽師范學院生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽 421008；2.衡陽師范學院南岳山區(qū)生物資源保護與利用湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008；3.東華理工大學江西省質譜科學與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013；4.湖南師范大學動物多肽藥物國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南 長沙 410081)

為了保護自己免受掠食者侵害，兩棲動物已進化出不同的形態(tài)、生理和行為特征[1].兩棲動物皮膚分泌物含有大量的活性多肽.這些多肽儲存在兩棲動物皮膚的顆粒腺體中，在受到壓力或受傷時可以高濃度釋放到皮膚分泌物中[2]，它們能保護皮膚免受環(huán)境和致病性的傷害，并發(fā)揮許多其他生物學作用[3].

大量的研究證明，兩棲動物皮膚活性多肽具有潛在藥物治療作用.在過去的幾十年里，蛙和蟾蜍(兩棲類無尾目)皮膚分泌物中的生物活性多肽被廣泛研究，目前已發(fā)現(xiàn)約2 000個(超過100個家族)活性多肽[2-6].這些皮膚活性多肽功能各異，包括抗菌肽、神經肽、緩激肽、蛙皮素、速激肽、色氨肽、膽囊收縮素、阿片樣肽、蛋白酶抑制劑肽、抗氧化肽、凝集素、胰島素釋放肽、肥大細胞降解/組胺釋放肽、傷口愈合肽，免疫調節(jié)肽、神經元一氧化氮合酶抑制劑等[2].但是，蠑螈(兩棲類有尾目)的皮膚活性多肽鮮有報道[7-9].

藍尾蠑螈(Cynopscyanurus)屬于兩棲綱、有尾目、蠑螈科、蠑螈屬，分布于我國貴州和云南的海拔1800米以上地區(qū)，多棲息于水塘、稻田水溝、沼澤地水坑，其捕食對象包括蚊、蠅蟲等有害昆蟲的幼蟲[10,11]，因此藍尾蠑螈是一種具有重要的農業(yè)保護價值的兩棲動物.目前關于藍尾蠑螈的發(fā)育、繁殖生態(tài)、肢體再生等研究已有一些論文報道[10-12]，但是未有對其皮膚的物質組成和功能進行研究報道.本研究首次對藍尾蠑螈皮膚進行轉錄組測序，并分析其轉錄組和活性多肽成分.

1 材料與方法

1.1 藍尾蠑螈皮膚總RNA提取和檢測

將錫箔紙包裹鐵制器具和研缽后在180 ℃下烘烤過夜以滅活RNA酶.雙蒸水及濾紙均滅菌處理.試驗所用槍頭、離心管、手套等均為RNase Free產品.用70%乙醇擦洗超凈臺后，將所有試驗用品在紫外燈下照射1 h.

藍尾蠑螈成體(圖1)購買于云南某養(yǎng)殖場，為人工繁殖的后代.取藍尾蠑螈成體1只，用雙蒸水清洗皮膚后用濾紙擦干.用眼科剪剪破藍尾蠑螈背部皮膚，再用鑷子撕下皮膚后立刻加入到液氮預冷的研缽中研磨約10 min至粉狀，再通過Trizol試劑盒提取藍尾蠑螈皮膚總RNA.

圖1 藍尾蠑螈

取適量皮膚總RNA以Agilent Bioanalyzer進行毛細管電泳以鑒定RNA樣品濃度、純度、完整性.RNA樣品達到以下要求即可符合cDNA文庫構建要求：RNA總量≥10 μg；RNA濃度≥200 ng·μL-1；RNA完整值≥7.0，28S∶18S濃度比≥1.0.

1.2 cDNA文庫的構建及測序

總RNA用DNaseⅠ處理后，采用Oligo(dt)—磁珠法分離mRNA.在mRNA中加入片段化試劑以形成mRNA短片段，并以其為模板合成第一條鏈cDNA，然后以雙鏈合成反應體系合成雙鏈cDNA.將雙鏈cDNA純化后加入EB緩沖液，再進行末端修復.雙鏈cDNA的3′末端添加腺嘌呤(A)并連接接頭，再選擇合適片段大小的雙鏈cDNA進行PCR擴增.cDNA文庫質檢合格后使用Illumina HiSeq 4000進行測序.

1.3 測序數(shù)據(jù)處理和生物信息學分析

測序獲得的原始reads經過過濾后，獲得clean reads數(shù)據(jù).使用Trinity軟件對clean reads重疊序列連成更長的片段contig(重疊群),然后使用Tgicl軟件將來自同一轉錄本的不同contig進行聚類、去冗余、組裝，得到最長的unigene序列.

通過Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所有unigene進行NT、NR、COG、KEGG、SwissProt注釋，使用Blast2GO(www.blast2go.com)以及NR注釋結果進行GO注釋，采用 InterProScan5[13]進行InterPro注釋.根據(jù)unigene的COG和GO注釋結果，統(tǒng)計了各自的功能分類.

多肽前體序列使用信號肽在線軟件SignalP-5.0 Server[14]識別多肽信號肽序列，再利用MEGA 6.0軟件將皮膚活性多肽與其同源多肽的氨基酸序列進行對比.

2 結果與分析

2.1 藍尾蠑螈皮膚總RNA質檢數(shù)據(jù)

在本試驗中，藍尾蠑螈皮膚總RNA經過質檢后，其濃度為684 ng·μL-1，RNA總量為13.68 μg，RIN為7.6，rRNA的28S∶18S濃度比為1.2.藍尾蠑螈皮膚總RNA完全滿足cDNA文庫構建要求.

2.2 測序數(shù)據(jù)結果

本試驗使用Illumina HiSeq 4000共測定了6.65 Gb數(shù)據(jù).測序的原始reads總數(shù)目為47.36 M，而過濾后clean reads數(shù)目為44.35 M(占原始reads總數(shù)93.64%).然后clean reads組裝成contig，再通過聚類去冗余和組裝得到75 462個unigene，其N50、GC含量、平均長度、總長度分別為1 617 bp、45.64 %、818 bp、61 801 999 bp.

2.3 功能注釋

所有unigene在NR、NT、GO、COG、KEGG、Swissprot、Interpro數(shù)據(jù)庫中完成注釋后，統(tǒng)計了注釋結果(表1).其中NR、Swissprot、KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋unigene最多，均占unigene總數(shù)的30%以上(分別為42.31%、35.50%、32.74%).所有注釋的unigene去冗余后，共獲得34 850個非冗余注釋unigene，占unigene總數(shù)的46.18%.

表1 藍尾蠑螈皮膚轉錄組unigene的功能注釋統(tǒng)計

Unigene注釋結果的物種分布如圖2所示，注釋結果為兩棲類物種的unigene數(shù)目約占注釋總數(shù)的16%；注釋結果最多的兩棲類物種是熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)，注釋結果分別約占注釋總數(shù)的11%和4%；注釋結果為其他兩棲動物約占注釋總數(shù)的1%，其中一些注釋結果來源于蠑螈物種，如墨西哥鈍口螈、紅腹蠑螈、綠紅東美螈、東方蠑螈等.

圖2 藍尾蠑螈皮膚轉錄組unigene注釋結果的物種分布

將COG數(shù)據(jù)庫的注釋基因進行功能分類(圖3).共鑒定22 154個COG注釋項(25個COG類別).其中，“一般功能基因”(3 802個，占比為17.16%(3 802/22 154),下文同)的COG注釋項最多；其次是“翻譯、核糖體結構與生物發(fā)生”(2 180個，占比為9.84%)、“復制、重組和修復”(2 086個，占比為9.42%)、“轉錄”(1 745個，占比為7.88%)、“細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂”(1 390個，占比為6.27%)、“翻譯后修飾、蛋白質周換、分子伴侶”(1 309個，占比為5.91%)、“未知功能基因”(1 309個，占比為5.91%)；而COG注釋項最少的類別是“核結構”(7個，占比為0.03%)以及“胞外結構”(39個，占比為0.18%).

1.翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生；2.轉錄；3.信號轉導機制；4.次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝；5.RNA處理和修飾；6.復制、重組和修復；7.翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶；8.核苷酸轉運和代謝；9.核結構；10.脂質運輸和代謝；11.細胞內運輸、分泌和囊泡運輸；12.無機離子轉運和代謝；13.一般功能蛋白；14.未知功能蛋白；15.胞外結構；16.能量生產和轉換；17.防御機制；18.細胞骨架；19.輔酶轉運和代謝；20.染色質結構和動力學；21.細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；22.細胞運動；23.細胞周期控制、細胞分裂、染色體分裂；24.糖類運輸和代謝；25.氨基酸轉運與代謝.

通過基因本體論(gene ontology, GO)數(shù)據(jù)庫對所有unigene進行功能分類(圖4)，共獲得76 963個GO注釋項.其中，涉及生物過程的GO注釋項有38 192個(49.62%)，涉及細胞成分的GO注釋項有27 409個(35.61%)，涉及分子功能的GO注釋項有11 362個(14.76%).

1.行為；2.生物粘附；3.生物相；4.生物調節(jié)；5.細胞聚集；6.細胞殺傷；7.細胞成分組織或生物發(fā)生；8.細胞過程；9.發(fā)育過程；10.生長；11.激素分泌；12.免疫系統(tǒng)過程；13.定位；14.運動；15.代謝過程；16.多細胞生物過程；17.多生物過程；18.生物過程的負調控；19.生物過程的正向調節(jié)；20.生物過程的調節(jié)；21.刺激反應；22.節(jié)律過程；23.信號傳遞；24.單組織過程；25.細胞；26.細胞連接；27.細胞組分；28.膠原三聚體；29.細胞外基質；30.細胞外基質組分；31.細胞外區(qū)域；32.細胞外區(qū)域組分；33.大分子復合物；34.膜；35.膜包腔；36.膜組分；37.細胞器；38.細胞器組分；39.突觸；40.突觸組分；41.抗氧化活性；42.結合；43.催化活性；44.通道調節(jié)活性；45.趨化活性；46.化學排斥活性；47.電子載體活性；48.酶調節(jié)活性；49.鳥苷酸交換因子活性；50.金屬伴侶活性；51.分子轉換器活性；52.核酸結合轉錄因子活性；53.蛋白質結合轉錄因子活性；54.蛋白質標簽；55.受體活性；56.受體調節(jié)活性；57.結構分子活性；58.翻譯調節(jié)活性；59.轉運體活性.

2.4 藍尾蠑螈皮膚活性多肽

在藍尾蠑螈皮膚轉錄組學中鑒定到多種皮膚活性多肽.其中，膽囊收縮素、速激肽、防御素、降鈣素、蛋白激酶抑制劑與已知多肽序列進行比較，結果發(fā)現(xiàn)在其他物種中均存在相同的成熟肽序列(表2).

表2 其他物種中存在相同成熟肽序列的藍尾蠑螈皮膚活性多肽

另外，本次試驗還鑒定一些與已知多肽具有高同源性的活性多肽，包括神經肽FF和神經肽AF、胸腺肽β4、C型利鈉肽、降鈣素基因相關肽、cathelicidin類抗菌肽等，它們與已知多肽序列具有高度的序列相似性.下面將對這些高同源性的活性多肽進行詳細分析.

2.4.1 神經肽FF和神經肽AF 神經肽FF和神經肽AF最初被認為是一種抗阿片肽[15]，能介導疼痛反應.后來的研究證明神經肽FF還具有一些其他作用，如調節(jié)神經內分泌系統(tǒng)、能量平衡、抗炎、疼痛傳遞和脂肪組織巨噬細胞的外周調節(jié)[16].而神經肽AF主要研究聚焦于動物攝食[17-19]和記憶[20].

本研究鑒定的藍尾蠑螈神經肽FF與來源于加蓬蚓螈(Geotrypetesseraphini)以及非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的神經肽FF具有較高的序列相似性，僅N端氨基酸有差異(表3).藍尾蠑螈神經肽AF與3種兩棲類動物—非洲爪蟾、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、美洲牛蛙(Lithobatescatesbeianus)的神經肽AF的序列相似性超過83%(表4).從表3和表4可以看出，神經肽FF家族和神經肽AF家族的成熟肽C端序列均高度保守，且C末端均具有酰胺化的苯丙氨酸(F)殘基.

表3 神經肽FF的成熟肽序列1)

表4 神經肽AF的成熟肽序列1)

2.4.2胸腺肽β4 胸腺肽β4是一種天然再生蛋白，具有血管生成和抗炎活性，并可在傷口處聚集大量血小板，在組織保護、修復和再生中起著重要作用[21-23].本次試驗鑒定的藍尾蠑螈胸腺素β4與兩種蚓螈—加蓬蚓螈和Microcaecilia屬蚓螈(Microcaeciliaunicolor)的胸腺素β4具有較高的序列相似性.它們均富含堿性氨基酸K以及酸性氨基酸E，而且它們的N端氨基酸序列在進化上相對保守(表5).

表5 胸腺肽β4的成熟肽序列1)

2.4.3 C型利鈉肽 C型利鈉肽不僅調節(jié)血管張力和血壓，而且還調節(jié)多種心血管效應[24].此外，研究結果也表明C型利鈉肽也參與了四肢骨骼發(fā)育的調節(jié)[25].將藍尾蠑螈C型利鈉肽前體與美洲牛蛙C型利鈉肽前體進行序列比較，結果發(fā)現(xiàn)它們在信號肽(signal peptide)和中間肽(propeptide)的序列相似性很低.它們的成熟肽序列含有一對二硫鍵，且序列相似性達到86%(表6).

表6 C型利鈉肽前體序列1)

2.4.4 降鈣素基因相關肽 降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是一種高效血管舒張劑，對多種心血管疾病具有保護作用[26].此外，降鈣素基因相關肽的表達水平與軀體、內臟、神經病理性和炎癥性疼痛之間存在一定相關性[27].

將藍尾蠑螈CGRP前體與高山倭蛙(Nanoranaparkeri)CGRP前體進行序列比較，結果發(fā)現(xiàn)它們均存在成熟肽將兩段中間肽(中間肽1和中間肽2)隔開的序列結構，而且成熟肽序列高度相似(表7).兩種兩棲動物的CGRP前體的N端序列在進化上比C端更保守，且C末端均具有酰胺化的苯丙氨酸(F)殘基.

表7 降鈣素基因相關肽前體序列1)

2.4.5 cathelicidin類抗菌肽 在脊椎動物中均存在具有廣譜抗菌活性的cathelicidin類抗菌肽[28].從紅瘰疣螈皮膚中鑒定到一種cathelicidin，該多肽有助于蠑螈傷口愈合和皮膚再生.由于紅瘰疣螈cathelicidin僅含有12個氨基酸殘基，因此具有開發(fā)成為新型創(chuàng)傷愈合劑的潛力[29].

在分類學上，藍尾蠑螈屬于蠑螈科蠑螈屬，而紅瘰疣螈屬于蠑螈科疣螈屬.將兩種蠑螈的cathelicidin前體序列進行比較(表8)，結果發(fā)現(xiàn)它們信號肽的序列相似性最高(95.0%)，中間肽的序列相似性略低(83%)；而成熟肽序列中均含有一對二硫鍵，但是兩者相似性最低(47%).由于兩種成熟肽相似性較低，因此下一步將深入比較研究兩種蠑螈cathelicidin的抗菌或傷口愈合活性.

表8 cathelicidin前體序列1)

3 討論與結論

兩棲動物的皮膚直接暴露于不同的環(huán)境中，其環(huán)境因素包括微生物、寄生蟲、捕食者、物理、化學因素等，它的特殊棲息地也是作為水陸進化之間的橋梁[2].因此，研究兩棲動物皮膚成分對闡明其生理學功能具有重要科學意義.

本研究首次揭示了藍尾蠑螈皮膚轉錄組和活性多肽成分.通過生物信息學分析，共獲得75 462個unigene.在功能數(shù)據(jù)庫注釋后得到34 850個非冗余注釋unigene，占unigene總數(shù)的46.18%，其中注釋結果為兩棲類物種的unigene數(shù)目約占注釋總數(shù)的16%.分別對GO和COG數(shù)據(jù)庫的注釋unigene進行功能分類.另外，從藍尾蠑螈皮膚轉錄組中鑒定到多種皮膚活性多肽，如膽囊收縮素、速激肽、防御素、降鈣素、蛋白激酶抑制劑、神經肽FF和神經肽AF、胸腺肽β4、C型利鈉肽、降鈣素基因相關肽、cathelicidin類抗菌肽等.下一步將合成或表達這些皮膚活性多肽并進行詳細的功能研究.