水稻雌雄不育突變體Osfma2的細(xì)胞學(xué)觀察及基因圖位克隆

張濤薈 王海宇 萬華 張莉萍 謝振威 陳可毅 何曉棟 趙志剛, * 萬建民, 2

水稻雌雄不育突變體的細(xì)胞學(xué)觀察及基因圖位克隆

張濤薈1, #王海宇1, #萬華1張莉萍1謝振威1陳可毅1何曉棟1趙志剛1, *萬建民1, 2

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 南京 210095;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所, 北京 100081;#共同第一作者;*通信聯(lián)系人, E-mail: zhaozg@njau.edu.cn)

【】通過構(gòu)建分離群體定位并克隆水稻雌雄不育基因，并對其在水稻育性調(diào)控中的功能進(jìn)行探究。通過EMS誘變水稻寧粳4號得到穩(wěn)定的不育突變體，對突變體進(jìn)行表型及細(xì)胞學(xué)觀察，利用精細(xì)定位和Mut-map相結(jié)合的方法克隆了水稻雌雄不育基因，通過實時熒光定量PCR檢測其在各組織表達(dá)水平差異，利用水稻原生質(zhì)體表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行OsFMA2蛋白的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)突變體為雌雄不育。利用極端個體將其精細(xì)定位于水稻第6染色體長臂448 kb的區(qū)間內(nèi)。結(jié)合全基因組重測序結(jié)果，最終確定為目標(biāo)基因。該基因編碼一個復(fù)制蛋白，在單子葉植物中高度保守。具有組織特異性，在幼穗中高表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示OsFMA2蛋白定位于細(xì)胞核中。在幼穗中高表達(dá)，可能參與了水稻雄配子第一次減數(shù)分裂前期同源重組過程，同時，的表達(dá)對雌配子發(fā)育也產(chǎn)生了不利影響。

水稻；雌雄不育；基因克?。唤M織表達(dá)；亞細(xì)胞定位

減數(shù)分裂是有性生殖生物中存在的一種特殊的分裂方式，性母細(xì)胞經(jīng)過一次間期DNA復(fù)制和兩次連續(xù)的細(xì)胞分裂，最終來自親代的遺傳信息減半，形成單倍體的配子[6-7]。減數(shù)分裂過程中發(fā)生的同源重組事件增加了配子的遺傳多樣化。目前減數(shù)分裂的同源重組被認(rèn)為是由DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）引發(fā)，功能高度保守的拓?fù)洚悩?gòu)類內(nèi)切酶SPO11蛋白以及其他一些蛋白共同催化完成DNA雙鏈斷裂過程[8-10]。DSB產(chǎn)生之后，MRE11、RAD50等蛋白沿5′向3′不斷剪切形成3′DNA的單鏈末端（ssDNA），ssDNA隨后與DNA復(fù)制蛋白A（RPA）等蛋白因子結(jié)合[11]，然后與同源染色體或姐妹染色單體結(jié)合，并以它們作為模板進(jìn)行修復(fù)（該過程也被稱為單鏈入侵），單鏈入侵進(jìn)程需要借助RAD51以及DMC1等重組酶。RAD51或DMC1重組酶取代RPA蛋白與DSB位點產(chǎn)生的單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合，沿著DNA延伸形成螺旋狀核蛋白纖維，這些核蛋白纖維捕獲完整的雙鏈DNA（dsDNA），進(jìn)而形成含有ssDNA和dsDNA的三元復(fù)合物，同源染色體配對以及同源重組過程都是在三元復(fù)合物中完成的[12-15]。在這個階段，其中一部分DSB被修復(fù)成交叉（cross-over，CO），其他的則形成非交叉（non-crossover，NCO），兩者由不同的通路形成[16-18]。

RPA蛋白首先是從Hela細(xì)胞提取物中發(fā)現(xiàn)的，參與了SV40病毒體外復(fù)制。在人體中RPA是由RPA1（70 kDa）、RPA2（32 kDa）和RPA3（14 kDa）三個亞基組成的異源三聚體[19]。前期研究表明RPA蛋白是一種高度保守的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSBs），它參與了真核生物幾乎所有的DNA代謝過程，包括DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)和同源重組[20]。在擬南芥中，共有5個的同源基因，和各有2個同源基因。和（能夠替代）在減數(shù)分裂期間啟動同源重組事件中發(fā)揮重要作用，它是形成Ⅰ型交叉的必需組成[21-23]。水稻中和各有三個同源基因，但僅有1個拷貝。表現(xiàn)為雌性不育且雄性孢母細(xì)胞在第一次減數(shù)分裂后期出現(xiàn)異常，OsRPA1a在DNA損傷修復(fù)過程中起到基礎(chǔ)性的作用。OsRPA2c在減數(shù)分裂過程的同源重組后期參與CO的形成，并與OsRPA1c共同維持CO的正常水平[24-25]。但是，OsRPA2c在減數(shù)分裂過程中是否同時影響雌雄配子的發(fā)育還未見報道。

本研究通過EMS誘變粳稻品種寧粳4號獲得了一個穩(wěn)定遺傳的不育突變體，對其進(jìn)行表型及細(xì)胞學(xué)觀察，通過分離群體精細(xì)定位和Mut-map測序相結(jié)合的方法圖位克隆了基因，檢測了在野生型不同組織中的表達(dá)水平，并對其功能進(jìn)行了初步探究。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究水稻生殖發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)，為水稻高產(chǎn)育種提供有利的基因。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究供試材料（）突變體是通過化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對水稻粳稻品種寧粳4號進(jìn)行誘變獲得的。2016年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻育種基地以雜合型植株作為母本，以秈稻品種N22作為父本進(jìn)行雜交組合配制獲得F1雜交種；同年，將F1種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)海南陵水南繁試驗基地并收取自交種。2017年夏季，將F2種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻育種基地獲得分離F2群體，并選取F2群體中極端個體進(jìn)行定位。

1.2 I2-KI染色觀察花粉育性

分別選取野生型和突變體植株正在開花的主穗，各取即將開花的成熟小穗3～5個，置于卡諾固定液（無水乙醇∶乙酸=3∶1）中，放入4℃冰箱內(nèi)保存。鏡檢時，先滴一小滴1% I2-KI染液于載玻片，用干凈的鑷子夾取花藥已經(jīng)伸長達(dá)穎殼2/3的穎花3朵，剝開內(nèi)外穎殼，從每朵小花中取3枚花藥放到染液中，然后用鑷子輕輕夾碎花藥使花粉粒充分釋放，去掉殘余的藥壁，蓋上蓋玻片，置于普通光學(xué)顯微鏡下對花粉染色情況進(jìn)行觀察。隨機選取3個不同的視野拍照記錄，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。觀察時，可育花粉粒為圓形，染色為黑褐色；不育花粉粒染色淺或無法著色，畸形或圓形。

1.3 曙紅染色法觀察胚囊的發(fā)育過程

分別取野生型和突變體植株孕穗期至抽穗期間各個不同時期的小穗，置于卡諾固定液中，抽真空后存放于4℃下保存。在體視鏡下剝?nèi)∫吧秃屯蛔凅w的雌蕊，根據(jù)穎花長度及子房大小，取不同分時期樣品置于卡諾固定液中。樣品依次經(jīng)過70%、50%和30%的酒精溶液、蒸餾水和2%的硫酸鋁鉀溶液處理，每次處理30 min，用10 mg/L的曙紅溶液避光浸染12 h。之后用2%的硫酸鋁鉀溶液處理30 min，蒸餾水漂洗3次，依次用30%、50%、70%、80%和90%的酒精溶液處理，每次處理30 min，而后用無水乙醇處理4次。將樣品置于無水乙醇和水楊酸甲酯（體積比為1∶1）溶液中處理2 h，最后經(jīng)過純水楊酸甲酯透明處理12 h以上。吸取處理好的樣品于凹面載玻片上，蓋上蓋玻片，倒放于Leica激光共聚焦顯微鏡載物臺上進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 醋酸洋紅染色觀察花粉發(fā)育過程

分別取野生型和突變體植株各生育時期的小穗置于卡諾固定液中，4℃冰箱內(nèi)保存。鏡檢時，先滴一小滴1%的醋酸洋紅溶液，用干凈的鑷子夾取一枚完整的花藥置于染液中，用鑷子輕夾花藥，充分釋放花粉粒，除去花藥壁結(jié)構(gòu)后蓋上蓋玻片，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。根據(jù)花粉細(xì)胞染色體形態(tài)、細(xì)胞核數(shù)目等判定具體發(fā)育時期，拍照記錄。

“左達(dá)的故事至少可以給我們兩個啟示，第一，在咱們中國，從貧民到千萬富翁甚至億萬富翁，是完全可能的，要不了多長時間?！睆堉倨秸f到這兒有意地停頓了一下，借此看看曾真的反應(yīng)，見曾真認(rèn)真地記錄著，便喝了一口水，繼續(xù)說，“第二，在咱們中國，從千萬富翁甚至億萬富翁到一貧如洗，更要不了多長時間，也許一夜之間就夠了?！?/p>

1.5 花藥半薄切片觀察雄配子發(fā)育過程

分別取野生型與突變體不同發(fā)育時期的小花置于卡諾固定液中，抽真空后存放于4℃冰箱保存。用0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液（PBS，pH=7.2）充分漂洗3次，每次20 min，而后經(jīng)15%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精溶液脫水，進(jìn)而用丙酮置換乙醇，再用現(xiàn)配的樹脂溶液進(jìn)行滲透，之后將樣品放入模具中，最后置于烘箱中包埋聚合，完成聚合的樣品用磨砂紙修塊，并在Leica UC7超薄切片機上切片，切片厚度為1 μm。切好的樣品轉(zhuǎn)移至加有蒸餾水的載玻片上，在烤片機上60℃過夜烤干，隨后用0.5%甲苯胺藍(lán)染色液染色，蒸餾水浸洗后烘干，樹膠封片后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 DAPI染色觀察雄配子孢原細(xì)胞染色體的擴散

滴加一滴1%醋酸洋紅溶液于載玻片，用鑷子取固定好的減數(shù)分裂期的小花，每個小花取2～3枚花藥，用鑷子夾碎花藥使孢母細(xì)胞充分釋放，蓋上蓋玻片。置于液氮中0.5 h，取出后去掉蓋玻片，經(jīng)70%、90%、100%的酒精系列梯度脫水，每個梯度5 min。處理結(jié)束后，在風(fēng)干的載玻片上滴加溶解在抗熒光衰減封片劑的DAPI(4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚)染液，蓋上蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 水稻不育基因的定位與克隆

以（）雜合型植株為母本，秈稻品種N22作父本進(jìn)行雜交獲得F1雜交種，海南繁種得到自交種F2，分家系播種后得到性狀分離的次級F2群體，選取極端隱性個體進(jìn)行基因定位。利用實驗室公共平臺的SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記共計篩選出123對在親本“寧粳4號”和“N22”中表現(xiàn)出多態(tài)性的分子標(biāo)記，對10個極端表型的個體進(jìn)行連鎖分析，然后擴大群體加密標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位。設(shè)計定位引物時，寧粳4號參照日本晴序列，N22參照9311序列，遵循引物設(shè)計原則在Rice Var Map2網(wǎng)站（http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/）上進(jìn)行設(shè)計，設(shè)計引物見表1。從分離的F2群體中分別選取不育和可育植株各30株，取鮮嫩葉片等量混合研磨構(gòu)建混池，送公司進(jìn)行重測序，利用Mut-map方法對測序結(jié)果進(jìn)一步分析。

1.8 熒光定量檢測基因表達(dá)量

取野生型的根、莖稈、葉、幼穗、葉鞘組織迅速置于液氮中，放于?80℃冰箱凍存。使用植物總RNA提取試劑盒（天根）提取總RNA，對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)定量實驗。定量引物見表1。

表1 本研究用于精細(xì)定位和定量的引物序列

1.9 水稻原生質(zhì)體分離及亞細(xì)胞定位

構(gòu)建OsFMA2-GFP融合載體，挑取測序結(jié)果正確的陽性單克隆于200 mL LB中過夜培養(yǎng)12～16 h，利用天根的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP在原生質(zhì)體中的熒光。

水稻原生質(zhì)體的分離：用單面刀片將生長10 d左右的9311幼苗葉鞘以下切成1～2 mm左右的碎塊，立即浸入酶解液中；抽真空1 h，在28℃黑暗條件下40 r/min搖4 h進(jìn)行酶解；用35 μm（200目）尼龍膜過濾酶解液，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入10 mL的W5溶液，80 r/min室溫?fù)u1 h，再次過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加W5溶液至45 mL；200、28℃條件下離心7 min，盡量去除上清，加入2 mL重懸液；加8 mL蔗糖溶液，懸浮原生質(zhì)體，150下離心7 min；用移液槍將其吸至另一個50 mL離心管，加W5溶液至45 mL，200下離心7 min；去除上清，加入2 mL重懸液，避光分裝進(jìn)2 mL EP管中，鏡檢；在2 mL EP管中加入10 μg質(zhì)粒，加入200 μL原生質(zhì)體，小心混勻；加入220 μL 40%的PEG，立即輕柔混合，28℃下孵育20 min；緩慢加入880 μL W5溶液，小心混勻，150下離心3 min，除去PEG; 用200 μL W5溶液重懸沉淀，28℃下黑暗過夜培養(yǎng)。

1.10 進(jìn)化樹分析及同源序列比對

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中BLASTp網(wǎng)站搜索與OsFMA2蛋白全長氨基酸序列同源的其他物種中的同源蛋白，選擇同源性較高的蛋白下載序列，利用BioXM 2.6進(jìn)行同源序列比對，通過MEGA 7.0.26軟件采用極大似然估計方法構(gòu)建不同物種間FMA2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 Osfma2突變體表型鑒定

與野生型相比，突變體在株型、抽穗期等農(nóng)藝性狀上無較大差異，而小穗育性表現(xiàn)出明顯差異（圖1-A～B），并且突變體花藥發(fā)白皺縮（圖1-C～D），推測突變體小穗不育表型可能是由花粉敗育引起。經(jīng)I2-KI染色觀察發(fā)現(xiàn)野生型花粉粒育性正常（圖1-E），而突變體的花藥不能形成成熟的花粉粒，花粉粒呈現(xiàn)典敗（圖1-F）。

2.2 野生型和突變體Osfma2的花粉發(fā)育過程

為了確認(rèn)花粉敗育的具體時期，我們采用醋酸洋紅染色法觀察野生型和突變體的花粉發(fā)育。參照馮九煥等[26]的方法，將水稻花粉發(fā)育過程劃分為8個時期。在小孢子母細(xì)胞形成期，突變體與野生型的花粉形態(tài)沒有明顯差異（圖2-A、I）。此后，野生型花藥繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)減數(shù)分裂形成二分體（圖2-B）和四分體（圖2-C）。隨著包圍四分體的胼胝質(zhì)壁解體，小孢子被釋放出來，呈現(xiàn)出圓球形或橢圓球形，且具有極薄的初生細(xì)胞壁（圖2-D）。到了小孢子晚期，中央大液泡形成，小孢子恢復(fù)成圓球形（圖2-E）。到了二核花粉早期，小孢子經(jīng)一次有絲分裂形成較大的營養(yǎng)細(xì)胞和透鏡狀的生殖細(xì)胞，營養(yǎng)核逐漸向萌發(fā)孔一端移動，并伴隨花粉體積增大（圖2-F）。隨著淀粉粒等物質(zhì)開始在萌發(fā)孔附近積累，花粉進(jìn)入小孢子晚期，這一時期生殖核逐漸遷移至營養(yǎng)核附近（圖2-G）。到了成熟期，可見淀粉等貯藏物完全填充整個花粉粒（圖2-H）。相較于野生型，突變體在小孢子早期之前未見明顯差異（圖2-J、K、L），而小孢子晚期花粉粒發(fā)育停滯（圖2-M），細(xì)胞輪廓出現(xiàn)明顯皺縮，花粉粒中無淀粉填充（圖2-N、O），最終無法形成正常的成熟花粉粒（圖2-P）。

A—野生型和突變體Osfma2的植株形態(tài)，比例尺為15 cm。B—野生型和突變體的小穗，比例尺為4 cm。C—野生型的花藥，比例尺為600 μm。D—突變體的花藥表型，比例尺為600 μm。E—野生型的花粉鏡檢，比例尺為50 μm。F—突變體的花粉鏡檢，比例尺為50 μm。

Fig. 1. Phenotypes and sterility of the wild type and the mutant.

2.3 野生型和突變體Osfma2的花藥半薄切片

為了進(jìn)一步探究突變體雄性不育的細(xì)胞學(xué)原因，對野生型和突變體花藥進(jìn)行半薄切片觀察。張大兵等[27]將水稻花藥發(fā)育過程劃分為14個時期。前7個時期，突變體與野生型沒有明顯的差異，都由孢原細(xì)胞經(jīng)一次平周分裂及兩次有絲分裂形成小孢子母細(xì)胞，小孢子母細(xì)胞被四層花藥壁細(xì)胞包圍（圖3-A、G）。從第8時期開始，野生型中小孢子母細(xì)胞經(jīng)歷正常的減數(shù)分裂形成正常形態(tài)的由胼胝質(zhì)壁包圍的四分體，此時絨氈層細(xì)胞發(fā)生空泡化并開始程序性死亡（圖3-B）；而突變體雖能產(chǎn)生四分體，但其絨氈層可能發(fā)生了提前降解（圖3-H）。到了第9時期，隨著胼胝質(zhì)壁的降解，野生型中小孢子從四分體中釋放出來游離在藥室，絨氈層細(xì)胞濃縮（圖3-C）。第10時期，野生型中小孢子高度空泡化，體積增大呈現(xiàn)圓形，此時絨氈層細(xì)胞被擠壓呈山丘狀，并開始降解（圖3-D）。此后，野生型小孢子經(jīng)一次不對稱的有絲分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的鐮刀狀（圖3-E）。在這一過程中，突變體小孢子中表型無明顯異常，但其絨氈層細(xì)胞退化更為嚴(yán)重（圖3-I、J）。第11時期時，突變體中花粉細(xì)胞明顯異常（圖3-K）。到了第14時期，野生型成熟花粉粒中充滿了淀粉等貯藏物質(zhì)（圖3-F）。而突變體這一時期花粉粒內(nèi)無淀粉積累，故無法染色（圖3-L）。因此推測，突變體雄性不育可能與絨氈層提前降解有關(guān)。

A～H為野生型花粉發(fā)育過程；I～P為突變體花粉發(fā)育過程。A和I—孢原細(xì)胞期；B和J—二分體期；C和K—四分體期；D和L—小孢子早期；E和M—小孢子晚期；F和N—二核早期；G和O—二核晚期；H和P—成熟花粉期。比例尺為10 μm。

Fig. 2. Developmental process of pollen in the wild type and the mutant

A～F為野生型花藥；G～L為突變體花藥。A和G—花藥發(fā)育減數(shù)分裂之前；B和H—花藥發(fā)育的8b階段；C和I—花藥發(fā)育的第9階段；D和J—花藥發(fā)育的第10階段; E和K—花藥發(fā)育的第11階段；F和L—花藥發(fā)育的成熟階段。箭頭指向: E—上皮; En—內(nèi)層; ML—中間層; T—絨氈層; MMC—小孢子母細(xì)胞; Tds—四分體; Msp—小孢子壁細(xì)胞; BP—二核花粉; Mp—成熟花粉粒。比例尺為10 μm。

2.4 雄性孢母細(xì)胞的染色體分離異常

為明確突變體的敗育原因，利用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）對減數(shù)分裂各發(fā)育時期花粉母細(xì)胞的染色體進(jìn)行染色觀察。野生型在細(xì)線期形成細(xì)長、線狀的染色體，偶線期染色體逐漸變粗，開始發(fā)生同源染色體的聯(lián)會現(xiàn)象（圖4-A），粗線期時同源染色體完全聯(lián)會（圖4-B）。之后染色體持續(xù)縮短變粗，在雙線期聯(lián)會復(fù)合體互相排斥，并可見交叉結(jié)（圖4-C）。直至終變期，形成12個清晰可見的二價體（圖4-D）。減數(shù)分裂第一次中期時同源染色體均勻排布于赤道板兩側(cè)，后期同源染色體分離，分別向細(xì)胞兩極遷移（圖4-E）。細(xì)胞經(jīng)兩次減數(shù)分裂之后，最終形成四分體（圖4-F）。相較于野生型，突變體在減數(shù)分裂偶線期染色體行為沒有明顯差異（圖4-G），粗線期突變體中染色體形態(tài)異常，出現(xiàn)了未聯(lián)會配對的區(qū)域（圖4-H），在雙線期進(jìn)一步濃縮（圖4-I），終變期形成了數(shù)量異常的單價體（圖4-J）。而后減數(shù)分裂第1次分裂后期，這些單價體隨機分離導(dǎo)致雄配子染色體不均等分布（圖4-K），最終形成大小不一的四分體（圖4-L）。

A～F為野生型孢母細(xì)胞；G～L為突變體的孢母細(xì)胞。A和G—孢母細(xì)胞的偶線期；B和H—粗線期；C和I—雙線期；D和J—終變期；E和K—二分體；F和L—四分體。白色箭頭指向單價體。比例尺為5μm。

Fig. 4. Chromosome observation of archesporial cell of the wild type and the mutant

A～E為野生型胚囊發(fā)育過程；F～J為突變體的胚囊發(fā)育過程。A和F—孢原細(xì)胞期；B和G—二分體期；C和H—四分體時期；D和I—功能大孢子期；E和J—成熟胚囊期。A～D、F～I(xiàn)的比例尺為30 μm；E和J的比例尺為60μm。

Fig. 5. Observation of embryo sac development of the wild type and the mutant

2.5 突變體Osfma2胚囊發(fā)育受阻

為明確突變體的雌配子發(fā)育是否也存在異常，采用胚囊整體染色及透明技術(shù)對野生型和突變體的胚囊發(fā)育過程進(jìn)行了觀察。野生型珠心中的孢原細(xì)胞首先發(fā)育成大孢子母細(xì)胞（圖5-A），大孢子母細(xì)胞經(jīng)過第1次有絲分裂產(chǎn)生二分體大孢子（圖5-B），再經(jīng)過第2次減數(shù)分裂產(chǎn)生四分體大孢子(圖5-C)。此后，靠近珠孔端的3個大孢子逐漸退化，靠近合點端的大孢子形成功能大孢子（圖5-D）。功能大孢子發(fā)育為單核胚囊，單核胚囊經(jīng)三次連續(xù)的有絲分裂最終形成七細(xì)胞八核的胚囊。在八核胚囊形成階段，經(jīng)過細(xì)胞核的遷移和細(xì)胞化，形成含有卵細(xì)胞、助細(xì)胞、極核及反足細(xì)胞的成熟胚囊（圖5-E）。相較于野生型，突變體的孢原細(xì)胞和大孢子母細(xì)胞發(fā)育正常（圖5-F），大孢子母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂開始退化（圖5-H），不能形成正常的功能大孢子（圖5-I）。之后的有絲分裂也存在異常，無法形成正常七細(xì)胞八核結(jié)構(gòu)的胚囊（圖5-J）。

OsFMA2基因的初連鎖和精細(xì)定位。OsFMA2基因最終定位在分子標(biāo)記RM340和Hh-4之間448 kb的區(qū)間內(nèi)。

Fig. 6.gene mapping on chromosome 6.

2.6 突變體Osfma2的遺傳分析

以雜合子（/）為母本，秈稻N22為父本進(jìn)行雜交，獲得F1，將F1自交種分單株收種，獲得F2群體種子，將F2群體分家系播種。在F2群體中挑選表型分離的家系進(jìn)行統(tǒng)計，共獲得可育單株165株，不育單株65株。經(jīng)過卡方測驗，分離比符合3∶1（χ2=1.21<χ20.05, 1=3.84），表明突變體的不育性狀受一個單隱性核基因控制。

2.7 OsFMA2基因定位與克隆

利用上述F2分離群體進(jìn)行定位。首先篩選出均勻分布在水稻12條染色體上并在粳稻品種寧粳4號和秈稻品種N22中表現(xiàn)出多態(tài)性的SSR標(biāo)記和InDel分子標(biāo)記，利用F2群體中10個極端不育個體和10個高育單株進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)第6染色體上標(biāo)記RM162和標(biāo)記RM5463存在連鎖跡象，物理距離約為7.83 Mb。隨后通過加密標(biāo)記，利用216個極端個體將不育基因定位在標(biāo)記RM340與Hh-4之間約448 kb的區(qū)間范圍內(nèi)（圖6）。

為了進(jìn)一步確定候選基因，對F2群體中30株不育單株和30株高育單株的葉片分別構(gòu)建不育和可育兩個池進(jìn)行全基因組測序。根據(jù)基因組序列差異程度表征值Delta（SNP-index），篩選出染色體上Delta（SNP-index）值呈現(xiàn)負(fù)峰狀且連續(xù)分布的區(qū)間（圖7），發(fā)現(xiàn)在水稻第6染色體上存在符合要求的目的區(qū)間，故將其作為候選區(qū)間。對重測序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)基因（）第9內(nèi)含子與第10外顯子交界處存在1處突變，另一個基因則是發(fā)生了同義突變。因此，將基因作為候選基因。該基因為已報道的新的等位基因。

2.8 突變位點的測序驗證

對基因進(jìn)行測序驗證，發(fā)現(xiàn)突變體相較野生型在第9個內(nèi)含子和第10個外顯子交界處存在一處A-T的單堿基替換（圖8-A），由腺嘌呤突變?yōu)樾叵汆奏?，電泳結(jié)果顯示突變體與野生型的轉(zhuǎn)錄本相比較，突變體存在另一種形式（約1000 bp）的轉(zhuǎn)錄本，這表明該堿基的替換造成了野生型與突變體之間轉(zhuǎn)錄本的差異（圖8-B）。此變異位于基因的RPA_C的蛋白結(jié)構(gòu)域（圖8-C）。

2.9 蛋白OsFMA2同源序列比對及進(jìn)化樹分析

為進(jìn)一步了解基因的功能，對其編碼蛋白OsFMA2進(jìn)行生物信息學(xué)分析。網(wǎng)站蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，OsFMA2蛋白包含兩個結(jié)構(gòu)域，分別為DBD_D結(jié)構(gòu)域和RPA_C結(jié)構(gòu)域（圖9-A）。截至目前，RPA蛋白已經(jīng)在多個物種中被報道，包括擬南芥、釀酒酵母、人類等[28-30]。于是對不同物種間的RPA蛋白序列進(jìn)行同源序列比對，發(fā)現(xiàn)在這些蛋白中DBD_D結(jié)構(gòu)域和RPA_C結(jié)構(gòu)域較為保守（圖9-B）。接著對OsFMA2及其各物種間同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖10）。水稻中OsFMA2與其他單子葉植物如二穗短柄草、玉米、高粱、黍等植物中RPA蛋白處于同一進(jìn)化分枝，而擬南芥、油棕等雙子葉植物及釀酒酵母等處于另一進(jìn)化分枝。這些結(jié)果表明盡管來自不用物種的RPA蛋白含有同樣較為保守的DBD_D結(jié)構(gòu)域和RPA_C結(jié)構(gòu)域，但在進(jìn)化方向上仍存在著差異。

圖7 全基因組重測序限定OsFMA2基因物理位置

Fig. 7. Whole genome re-sequencing defines the physical location ofgene.

A—野生型與突變體的測序差異；B—野生型和突變體中OsFMA2基因的差異剪切；C—OsFMA2的基因結(jié)構(gòu)，藍(lán)色框代表外顯子，線條代表內(nèi)含子，虛線框代表的是RPA_C保守結(jié)構(gòu)域，從首位氨基酸的第一個堿基開始計算到末位氨基酸的最后一個堿基為止。紅色實線代表突變位置。白色框分別代表5′UTR和3′ UTR。

Fig. 8. Cloning and sequence analysis of the sterility gene

2.10 OsFMA2基因的組織表達(dá)模式

為了明確基因在水稻各個組織中的表達(dá)情況，提取野生型植株根、莖、葉、幼穗、鞘等組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測。如圖11所示，基因在根、莖、葉、鞘、幼穗中均有表達(dá)，但各組織間表達(dá)量存在明顯差異。其中該基因在水稻幼穗中表達(dá)量最高，而在營養(yǎng)組織中表達(dá)量較低，在葉鞘中幾乎不表達(dá)。由此表明，雖然基因的表達(dá)是組成型，但其在3 mm幼穗中呈現(xiàn)高表達(dá)，這個發(fā)育階段正是減數(shù)分裂時期。隨后，我們對不同花藥發(fā)育時期的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其在小孢子母細(xì)胞形成期以及減數(shù)分裂期高表達(dá)。

2.11 亞細(xì)胞定位

為研究OsFMA2蛋白的亞細(xì)胞定位，將OsFMA2-GFP融合蛋白和核標(biāo)記蛋白共轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)OsFMA2-GFP蛋白與核標(biāo)記蛋白重合（圖12），表明OsFMA2蛋白定位于細(xì)胞核中，是一個核蛋白。

A—OsFMA2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，數(shù)字代表氨基酸殘基位置；B—OsFMA2蛋白與其他物種中RPA蛋白序列同源比對。

Fig. 9. Bio-information analysis of OsFMA2.

圖10 OsFMA2與同源蛋白進(jìn)化分析

Fig. 10. Molecular Phylogenetic analysis of OsFMA2 and other RPA protein by Maximum Likelihood method.

3 討論

減數(shù)分裂作為有性生殖個體在生殖發(fā)育過程中特殊的分裂方式，其對于配子的遺傳多樣性及親子代間染色體數(shù)目穩(wěn)定意義重大。在多數(shù)真核生物中，減數(shù)第一次分裂前期發(fā)生的核心事件涉及同源染色體的配對、聯(lián)會及同源重組[31]。目前已經(jīng)報道了大量減數(shù)分裂相關(guān)基因，這些基因發(fā)生突變導(dǎo)致減數(shù)分裂發(fā)生異常，從而導(dǎo)致不同程度不同表型的敗育類型[32]。本研究中所得到的突變體，在第9內(nèi)含子和第10外顯子的交界處發(fā)生了1處單堿基替換，造成突變體轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)差異，是一個新的水稻的等位材料。根據(jù)前人的報道，水稻中的在減數(shù)分裂過程中高表達(dá)，其編碼了一個含430個氨基酸的蛋白質(zhì)RPA2c[25]。對RPA2c的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其具有較為保守的一個DNA binding結(jié)構(gòu)域（DBD_D）和一個RPA_C端結(jié)構(gòu)域。

前人研究的水稻突變體是一個T-DNA插入突變體，插入位置在基因的第4內(nèi)含子上。與已報道的突變方式和位點不同，本研究中的突變體在第9內(nèi)含子與第10外顯子交界處發(fā)生了一處單堿基突變，突變位點位于剪切識別處，造成突變體和野生型之間存在轉(zhuǎn)錄本的差異。對突變體進(jìn)行敗育原因的探究，通過4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，發(fā)現(xiàn)突變體在減數(shù)第一次分裂的終變期出現(xiàn)了數(shù)目異常的單價體（最多為24個），并伴隨有小孢子染色體不均等分離，這與Li等的研究相符[25]。醋酸洋紅染色結(jié)果及花藥半薄切片觀察也表明突變體無法形成正常的花粉粒。以上結(jié)果表明基因的突變直接影響雄配子的發(fā)育過程，但是對該基因在雌配子發(fā)育方面還未見報道。有趣的是，我們利用曙紅染色法觀察胚囊發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)突變體中功能大孢子形成異常最終導(dǎo)致突變體發(fā)生雌配子敗育，從而證實是一個同時控制水稻雌雄配子發(fā)育的關(guān)鍵基因。

R—根；ST—莖稈；L—葉；PA—3mm幼穗；LS—葉鞘；A—花藥；S1?S6表示小孢子母細(xì)胞形成期；S7?S9表示花藥減數(shù)分裂期；S10—單核花粉期；S11—雙核花粉期；S12—三核花粉期。內(nèi)參為OsUbiquitin，誤差線為n=3的標(biāo)準(zhǔn)差。

Fig. 11. Relative expression levels ofin different rice tissues.

A—OsFMA2-GFP融合蛋白在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；B—核標(biāo)簽在水稻原生質(zhì)體中的定位；C—明場視野中原生質(zhì)體狀態(tài)；D—GFP，核標(biāo)簽，明場的融合。比例尺為10 μm。

Fig. 12. Subcellular localization of OsFMA2 in rice protoplast.

本研究運用了精細(xì)定位和Mut-map重測序相結(jié)合的方式克隆了基因，這比傳統(tǒng)上正向遺傳學(xué)的基因定位更具優(yōu)勢。隨著NGS（二代測序）技術(shù)的發(fā)展，基于BSA-seq（Bulked Segregant Analysis-seq）的Mut-map方法逐步受到育種家們的青睞。Mut-map這一新型技術(shù)最先于2012年由Abe等[33]提出，它要求將目的性狀穩(wěn)定的突變體與野生型親本進(jìn)行雜交得到F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代后從分離群體中挑選20株表現(xiàn)為突變體性狀的個體進(jìn)行混池測序，與野生型親本測序序列比較后將SNP指數(shù)為1的SNP位點作為候選位點。由于此方法僅僅適用于點突變和質(zhì)量性狀的研究，本研究中使用的Mut-map在這一基礎(chǔ)上做了進(jìn)一步的改進(jìn)，挑選F2代中表現(xiàn)為極高育性和極低育性的單株分別進(jìn)行混池測序，獲得的序列再與野生型親本序列進(jìn)行比較，最后將兩個池間SNP指數(shù)差值較大的位點定為候選位點。利用此方法能顯著地減小定位群體、縮減定位周期的同時，有效避免了由于目的性狀外其他背景差異帶來的干擾，大大提高了定位的準(zhǔn)確性。

DNA復(fù)制蛋白（RPA）是真核生物中廣泛存在的單鏈結(jié)合蛋白，它幾乎參與了所有的DNA代謝過程，包括DNA復(fù)制、修復(fù)、重組等。RPA蛋白是與其他蛋白互作共同來實現(xiàn)這些生化過程的。根據(jù)前人研究，RPA蛋白在擬南芥、水稻、人類等體內(nèi)存在多個拷貝。在水稻中共鑒定出三種拷貝的RPA1（RPA1a，RPA1b，RPA1c），三種拷貝的RPA2（RPA2a，RPA2b，RPA2c）及單拷貝的RPA3。結(jié)合這些亞基互作情況，普遍認(rèn)為水稻中共存在三種RPA復(fù)合體：OsRPA1a-OsRPA2b-OsRPA3（A型）、OsRPA1b-OsRPA2a-OsRPA3（B型），OsRPA1c-OsRPA2c-OsRPA3（C型）[34]。這種亞基多拷貝的現(xiàn)象在植物進(jìn)化過程中非常常見，但這些亞基究竟如何對減數(shù)分裂復(fù)制重組等產(chǎn)生影響有待詳細(xì)的功能探究。本研究發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核，檢測在野生型不同組織中的表達(dá)水平差異發(fā)現(xiàn)其在減數(shù)分裂期的花藥中高表達(dá)，以上結(jié)果或許暗示了與減數(shù)分裂期的一些核蛋白作用共同行使功能。這為進(jìn)一步探究互作的功能蛋白提供思路。

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Cytological Observation of a Female and Male SterileMutant in Rice and Its Map-based Cloning

ZHANG Taohui1, #, WANG Haiyu1, #, WAN Hua1, ZHANG Liping1, XIE Zhenwei1, CHEN Keyi1, HE Xiaodong1, ZHAO Zhigang1, *, WAN Jianmin1, 2

(1National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: zhaozg@njau.edu.cn)

【】The work aims to locate and clone the rice female and male sterile geneby constructing a segregated population and explore its function in the regulation of rice fertility. 【】Stable sterile mutants were obtained by EMS mutagenesis ofrice Ningjing 4, and the phenotypic and cytologicalobservation of the mutant wasconducted. Using map-based cloning and Mut-map methods, the female and male sterile genewas fine-mapped and cloned. The expression pattern ofin various tissues was analyzed by the real-time quantitative PCR technique. Subcellular localization of OsFMA2 protein was performed with the rice protoplast expression system. 【】The cytological observation revealed that themutant was male- and female-sterile, and the extreme individuals were used to locate the gene in a 448-kb interval on the long arm of chromosome 6. The geneis predicted to encode a replication protein that is highly conserved in monocots. The genewas tissue-specific and was highly expressed in young panicles. Subcellular localization analysis showed that the OsFMA2 protein was localized on the nucleus. 【】The geneis highly expressed in young panicles, and it may participate in the homologous recombination of the first meiotic division of male gamete. At the same time, the expression ofalso has an adverse effect on the development of female gametes.

rice; male and female sterility; gene cloning; tissue analysis; subcellular localization

10.16819/j.1001-7216.2022.210312

2021-03-23;

2021-04-22。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31991224; 31971909; U2002202)。