采用斑馬魚生物模型對桑葉和絞股藍葉水提取物降糖作用的比較研究

劉均，李強，譚蓉*

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016；2.浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，浙江杭州310016）

斑馬魚（Zebrafish）是一種新型模式生物，具有體型小，易于飼養(yǎng)，性成熟期短，繁殖能力強，體外受精和發(fā)育，胚胎發(fā)育快，胚體透明等特點，便于實時觀察組織器官發(fā)生形成的各個環(huán)節(jié)，已成為生命科學(xué)研究的新寵，被廣泛用于構(gòu)建人類的各種疾病模型，建立藥物篩選和治療的研究平臺。截止目前，利用斑馬魚可以構(gòu)建糖尿病[1-2]、高血脂[3-4]、高尿酸癥[5-6]、失眠[7-8]等生物模型開展靶向藥物篩選及功能評價研究。以斑馬魚為對象建立糖尿病模型，目前主要是以成魚為對象，方法如下：采用四氧嘧啶（alloxan，ALX）或鏈脲佐菌素藥物[1，9]腹腔注射；采用ALX與高糖溶液聯(lián)合誘導(dǎo)[2]造成胰島細胞損傷型糖尿病模型；過度飼喂法[10]誘發(fā)胰島素抵抗型2型糖尿病模型。而采用斑馬魚幼魚建模的研究還比較鮮見。斑馬魚具有養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精等顯著優(yōu)勢，尤其是利用剛孵化的幼魚開展實驗研究，可以有效縮短試驗周期，并且利用微孔板操作可以有效節(jié)約實驗費用。因此，研究以斑馬魚幼魚（5 days post fertilization，5 dpf）為對象，系統(tǒng)研究了不同濃度葡萄糖（glucose，GLU）溶液、ALX藥物及其組合對斑馬魚GLU水平的影響并探討建立了糖代謝異常斑馬魚生物模型。

桑葉（moras folium，MF）是我國傳統(tǒng)經(jīng)濟作物，是蠶的主要食物，中醫(yī)稱其具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目的功效。絞股藍（gynostemma pentaphyllum，GP）有“南方人參”之稱，具有降血脂，調(diào)血壓防治血栓，調(diào)節(jié)血糖等功效。目前，市場上已有較多的MF和GP單品或復(fù)合代用茶銷售，但其實際功效大都缺乏試驗論證。因此，研究首先以MF和GP葉全水浸提物為對象，在研究斑馬魚對MF和GP藥物耐受性影響的基礎(chǔ)上，指導(dǎo)開展基于已開發(fā)構(gòu)建的糖代謝異常斑馬魚生物模型的MF和GP的降糖效應(yīng)評估，為健康功能食品開發(fā)提供基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，同時也為高通量斑馬魚降糖藥物篩選及復(fù)方產(chǎn)品開發(fā)提供多方案參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器及試劑

（1）儀器。酶標儀（Multiskan SkyHigh，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；全自動智能型生化（霉菌）培養(yǎng)箱（天津市宏諾儀器有限公司）；精密電子天平（AL-204，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；手持式高速勻漿機（MY-20，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；離心機（3K1S，德國sigma離心機公司）；水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

（2）試劑。GLU（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；GLU檢測（葡萄糖氧化酶法）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；三卡因甲磺酸（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易公司）；ALX（CAS號：2244-11-3，純度≥98.0%；合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）：1 mM ALX母液制備，稱量0.0144 g ALX于燒杯中，加入蒸餾水攪拌溶解并定容于100 mL容量瓶中，冷藏備用。準確量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL上述1 mM ALX母液，加蒸餾水定容至50 mL分別制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mM的ALX溶液。

阿卡波糖（Acarbose，ACA，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）：50 mg/mL ACA（以生藥量計）貯備液制備，稱取5 g ACA于燒杯中，加入蒸餾水攪拌溶解過濾后定容至100 mL制得50 mg/mL ACA（以生藥量計）儲備液，保存于4℃冷藏備用。準確量取0.40 mL上述ACA儲備液，加蒸餾水定容至50mL制成400μg/mL的ACA溶液。

（3）儲備液制備。MF鮮葉采摘自安徽，按綠茶加工工藝自制。50 mg/mL MF（以生藥量計）儲備液制備：稱取5 g MF于燒杯中，在80℃恒溫水浴鍋中浸提3次，每次浸提30 min，合并濾液并定容至100 mL制得50 mg/mL MF（以生藥量計）儲備液，保存于4℃冷藏備用。準確量取0、0.025、0.050、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、2.00、4.00、8.00和10.00 mL上述MF儲備液，加蒸餾水定容至50 mL分 別 制 成0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL的MF溶液。GP（平利縣興強富硒茶業(yè)專業(yè)合作社）：50 mg/mL GP（以生藥量計）儲備液制備方法如50 mg/mL MF（以生藥量計）儲備液制備相同。

1.1.2 實驗動物

斑馬魚（3月齡，AB型，上海費曦生物科技有限公司）。斑馬魚胚胎的繁殖以自然交配方式進行。每個產(chǎn)卵盒中按1∶1放入公魚和母魚，放入28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中。光周期設(shè)置：14 h光照與10 h黑暗，于第二天上午收集胚胎，去除死卵和糞便，清洗后換孵育水（60μg/mL海鹽水），置于28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫孵育，每24 h換水一次，并去掉卵膜和死卵。實驗完成后，采用三卡因甲磺酸對斑馬魚進行麻醉處死。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同濃度GLU孵育對斑馬魚GLU水平的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予0、10、14、18、22、26 mg/mL GLU溶液，每個重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU含量，探究GLU建立糖代謝異常斑馬魚模型的可行性。

1.2.2 不同濃度ALX孵育對斑馬魚GLU水平的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予0、0.02、0.04、0.06、0.08 mM ALX溶液，每個重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.02）勻漿后用于測定GLU含量，探究ALX建立糖代謝異常斑馬魚模型的可行性。

1.2.3 GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對斑馬魚GLU值的影響

基于不同濃度GLU和ALX對斑馬魚GLU值的影響結(jié)果優(yōu)選藥物組合開展糖尿病斑馬魚建模方案研究。將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為5組，分別記為BC1、BC2、MC1、MC2、MC3，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予0mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.04 mM ALX、22 mg/mL GLU+0.08 mM ALX溶液，每個重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)24 h，每個重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU含量，探究GLU與ALX聯(lián)合建立糖尿病斑馬魚模型的可行性。

1.2.4 不同濃度MF孵育對斑馬魚死亡率的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL MF溶液（以生藥量計），每個重復(fù)加藥物5 mL，置于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換水一次，記錄每個重復(fù)斑馬魚幼魚死亡數(shù)量，并計算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評價用劑量濃度。

1.2.5 不同濃度GP孵育對斑馬魚死亡率的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予 0、25、50、100、200、400、800、1000、2000、4000、8000、10000μg/mL GP溶液（以生藥量計），每個重復(fù)加藥物5 mL，置于28.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h換水一次，記錄每個重復(fù)斑馬魚幼魚死亡數(shù)量，并計算每組死亡率，優(yōu)選劑量作為降糖作用評價用劑量濃度。

1.2.6 不同濃度MF和GP對高糖誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚GLU值的影響

根據(jù)斑馬魚對MF和GP的耐受性分析結(jié)果開展降糖作用評價。將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚隨機分為8組，分別記為BC1、BC2、MFT1、MF-T2、MF-T3、GP-T1、GP-T2、GP-T3，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予0 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU、22 mg/mL GLU+200μg/mL MF、22 mg/mL GLU+400μg/mL MF、22 mg/mL GLU+800 μg/mL MF、22 mg/mL GLU+200μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL GP、22 mg/mL GLU+800μg/mL GP溶液，每個重復(fù)加藥物5 mL，培養(yǎng)至24 h，每個重復(fù)取10條魚，加入100μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU含量，探究在能量攝入過多的情況下MF和GP的降糖效應(yīng)。

1.2.7 不同濃度MF和GP對糖尿病斑馬魚GLU值的影響

將發(fā)育正常5 dpf野生型AB系斑馬魚給予22 mg/mL GLU+0.02 mM ALX聯(lián)合孵育24 h以誘導(dǎo)糖尿病模型，然后將已建立的糖尿病斑馬魚隨機分為8組，分別記為MC1、MF-T1、MF-T2、MFT3、GP-T1、GP-T2、GP-T3、ACA-T，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)15條，分別給予22 mg/mL GLU、22mg/mL GLU+200μg/mL MF、22 mg/mL GLU+400 μg/mL MF、22 mg/mL GLU+800μg/mL MF、22 mg/mL GLU+200μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL GP、22 mg/mL GLU+800μg/mL GP、22 mg/mL GLU+400μg/mL ACA聯(lián)合孵育24 h。同步設(shè)置0 mg/mL GLU孵育48 h（期間孵育24 h時換水一次）作為BC1空白對照組。試驗結(jié)束時，每個重復(fù)取10條魚，加入200μL磷酸緩沖鹽溶液勻漿后用于測定GLU含量，探究ML和GP處理對糖尿病糖斑馬魚模型降糖作用的影響。

1.3 檢測方法

GLU含量檢測按如下步驟進行，取適量磷酸緩沖鹽溶液于裝魚的1.5 mL離心管中，采用高速手持式勻漿機勻漿1 min，直至魚體組織裂解充分，然后于4℃下以2500轉(zhuǎn)/秒離心10 min，結(jié)束后取上清樣2.5μL采用GLU檢測試劑盒（GLU氧化酶法）測定GLU濃度，其測定程序和方法按照試劑盒說明書規(guī)定的步驟進行。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步處理后，用Graphpad Prism 6.0繪圖，并用SPSS Statistics 17.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差呈現(xiàn)，差異顯著性采用Duncan分析并將進行多重比較，p＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度GLU孵育對斑馬魚GLU值的影響

不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)對斑馬魚葡萄糖值的影響如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著孵育水GLU濃度的增加，斑馬魚GLU值也呈現(xiàn)上升趨勢，且當GLU濃度在22 mg/mL及以上時斑馬魚GLU值出現(xiàn)顯著性變化（p＜0.05）。相比空白組，22、26和30 mg/mL GLU處理組斑馬魚GLU值分別增加了54.86%、55.48%和65.61%，均達到差異顯著水平（p＜0.05）。

前述認可最初興起于概括代理人，后擴至其他類型的代理人，從而使之不至于(至少在最開始的時候)與受委任人完全等同起來，后者不具有這一點。即便在兩項制度融合之后，依然如故。

圖1 不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)對斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.1 Effect of different concentrations of glucose on the level of glucose of zebrafish

2.2 不同濃度ALX孵育對斑馬魚GLU值的影響

不同濃度ALX孵育對斑馬魚GLU值的影響見圖2。隨著孵育水中ALX濃度的增加，斑馬魚GLU值呈現(xiàn)上升趨勢，0.04、0.06、0.08和0.10 mM ALX處理組斑馬魚GLU值分別增加了75.03%、69.52%、115.38%和65.61%，差異均顯著 （p＜0.05）。

圖2 不同濃度ALX誘導(dǎo)對斑馬魚葡萄糖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of alloxan on the level of glucose of zebrafish

2.3 GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對斑馬魚GLU值的影響

基于不同濃度GLU與ALX對斑馬魚GLU值的調(diào)節(jié)作用，GLU與不同濃度ALX聯(lián)合孵育對斑馬魚GLU值的影響見圖3。從圖3中可以看出，相比BC1組，BC2組斑馬魚GLU值增加了119.48%，達到差異顯著水平（p＜0.05），與前期結(jié)果較為一致。另外，MC1、MC2和MC3組斑馬魚GLU值分別增加了391.99%、491.16%和432.04%，均差異顯著（p＜0.05）。因而綜合成本等因素，選用22 mg/mL GLU與0.02 mM ALX聯(lián)合用于糖尿病病理模型建模、驗證及靶向降糖作用評價研究。

圖3 葡萄糖與四氧嘧啶聯(lián)合誘導(dǎo)對斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.3 Effect of glucose and alloxan on the level of glucose of zebrafish

2.4 斑馬魚對MF和GP耐受性的影響

不同濃度MF和GP及其孵育時間對斑馬魚死亡率的影響見表1和表2。從表1中可以看出，斑馬魚對高濃度MF溶液具有長時不耐受性，隨著孵育時間的延長死亡率不斷增加。MF濃度≥8000μg/mL孵育48 h死亡率達到63.89%，但孵育24 h內(nèi)對致死率影響較小。若需采用ML孵育48 h，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑馬魚幼魚的MF耐受性（表3），死亡率與MF濃度間的關(guān)系為：Probit（p）=-1.923+0.000337X，按該模型計算得出MF的LC50為5706.06μg/mL，95%可信范圍為4732.39～7067.28μg/mL。

表1 不同濃度的桑葉水提物對斑馬魚耐受性的影響Table 1 Effect of different concentrations of the aqueous extract of moras folium（MF）on the lethality rate of zebrafish

表3 斑馬魚幼魚桑葉水提物耐受性影響的參數(shù)估計表Table 3 Parameter estimates of the tolerance of zebrafish larvae in the aqueous extract of moras folium

此外，斑馬魚對高濃度GP溶液也具有不耐受性（表2），并且隨著孵育時間的延長死亡率增加，但相比MF來說，其致死作用明顯弱于MF。GP在最高濃度10000μg/mL孵育48 h的最高致死率僅為26.67%，孵育72 h時致死率為57.78%。若需采用GP孵育72 h，采用SPSS中PROBIT程序分析得出斑馬魚幼魚的GP耐受性（表4），死亡率與GP濃度間的關(guān)系為：Probit（p）=-1.711+0.000175X，按該模型計算得出GP的LC50為9766.18 μg/mL，95%可 信 范 圍 為 7669.52～13927.51μg/mL。

表2 不同濃度的絞股藍葉水提物對斑馬魚耐受性的影響Table 2 Effect of different concentrations of the aqueous extract of gynostemma pentaphyllum（GP）leaves on the lethallty rate of zebrafish

表4 斑馬魚絞股藍葉水提物耐受性影響的參數(shù)估計表Table 4 Parameter estimates of the tolerance of zebrafish larvae in the aqueous extract of gynostemma pentaphyllum leaves

然而，研究中采用MF和GP的藥物處理時間為24 h，所以藥物劑量濃度的選擇空間較大，為統(tǒng)一進行降糖作用評價，均選用200、400和800μg/mL的劑量對基于生理的和病理生理的糖代謝異常斑馬魚模型進行降糖作用評價。

2.5 MF和GP對高糖誘導(dǎo)糖代謝異常斑馬魚GLU值的影響

圖4 不同濃度桑葉水提物和絞股藍葉水提物對高糖誘導(dǎo)斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.4 Effect of different concentrations of in the aqueous extract of moras folium and gynostemma pentaphyllum leaves on the level of glucose of hyperglycemia-induced zebrafish

2.6 MF和GP對糖尿病斑馬魚GLU值的影響

不同濃度MF和GP對胰島損傷型斑馬魚GLU值的影響見圖5。圖5顯示，相比空白組，MC1組斑馬魚GLU值增加了321.36%（p＜0.05）。在造模完成后的藥物干預(yù)治療過程中，MF-T2、MF-T3和GP-T3聯(lián)合處理組中的斑馬魚均全部死亡，因而未能分析GLU值變化情況，表明基于生理和病理生理的藥物劑量濃度篩選上還存在不一致性，還需開展進一步的耐受性分析和藥物劑量篩選。但相比MC1組，MF-T1和GP-T2組斑馬魚GLU值分別降低了28.30%和31.03%，差異均顯著（p＜0.05）。

圖5 不同濃度桑葉水提物和絞股藍葉水提物對糖尿病斑馬魚葡萄糖值的影響Fig.5 Effect of different concentrations of in the aqueous extract of moras folium and gynostemma pentaphyllum leaves on the level of glucose of diabetic zebrafish

3 討論

糖尿病是一種世界性疾病，以糖代謝異常著稱，長期高血糖狀態(tài)可以引起糖耐量受損、胰島素敏感性降低，以及誘發(fā)多種重要臟器衰竭，諸如肝臟、腎臟等。目前，在基礎(chǔ)研究上主要是以大小鼠為對象構(gòu)建糖尿病病理模型開展藥物篩選和功能評價研究，但存在明顯的試驗周期長和成本高等問題。斑馬魚是近年來新興的模式生物，利用斑馬魚構(gòu)建糖尿病模型，具有試驗周期短、成本低等優(yōu)勢，不僅可以快速開展糖尿病治療藥物篩選或研發(fā)而且通過在體實驗研究，可以有效彌補體外實驗（細胞試驗）和哺乳類動物（大小鼠）實驗之間的生物學(xué)斷層。利用斑馬魚開展糖尿病生物模型研究主要是以斑馬魚成魚為對象，與大小鼠造模方式相近，而采用斑馬魚幼魚建模的研究目前還比較鮮見。

GLU是機體中提供能量的最基本糖類物質(zhì)，其可以在腸道上皮細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的輔助下從腸道內(nèi)直接吸收[11]。研究發(fā)現(xiàn)將斑馬魚幼魚直接暴露于GLU溶液中，隨著GLU濃度的增加，斑馬魚GLU水平也會不斷增加，這與GLU在腸道內(nèi)的直接吸收方式是有關(guān)的，最終造成GLU的供給量超過它的消耗量，進而引起糖代謝異常。ALX是嘧啶的一種含氧衍生物，通過產(chǎn)生氧自由基可以選擇性地破壞胰島β細胞，引起細胞死亡，最終導(dǎo)致胰島素分泌量下降，形成胰島素依賴性糖尿病[12]。研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚幼魚直接暴露于ALX溶液中，隨著ALX濃度的增加，斑馬魚GLU水平也在不斷增加。由于并未向斑馬魚提供任何營養(yǎng)物質(zhì)，維持斑馬魚生存所需的GLU主要是來源于幼蟲體內(nèi)卵黃囊內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的分解，而顯著增加的GLU主要是體內(nèi)分解產(chǎn)生的GLU因胰島素分泌不足而未得到有效利用有關(guān)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)以GLU為營養(yǎng)源，再結(jié)合ALX聯(lián)合誘導(dǎo)還可以進一步造成提升GLU水平，因而以高濃度GLU與ALX聯(lián)用可以有效構(gòu)建糖代謝異常斑馬魚模型。

MF是我國傳統(tǒng)經(jīng)濟作物，是蠶的主要食物，中醫(yī)稱其具有疏散風(fēng)熱，清肺潤燥，清肝明目的功效[13]。GP有“南方人參”之稱，具有降血脂，調(diào)血壓防治血栓，調(diào)節(jié)血糖等功效[14]。中醫(yī)講究辨證論治，用證候分型，較為晦澀難懂；西醫(yī)則是辨病論治，以疾病分型，比較具象，注重實驗室結(jié)論。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)步入了整體和系統(tǒng)醫(yī)學(xué)的時代，向世界介紹中醫(yī)藥，應(yīng)該注重中西醫(yī)并重發(fā)展，同時借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，開展靶點研究和功能評價，促進中醫(yī)藥療效具象化辨析論證。研究采用已構(gòu)建的高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚模型，探討MF和GP兩種藥用植物的葉水提取物對其糖代謝的綜合作用。研究發(fā)現(xiàn)MF和GP葉水提取物可以降低高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚GLU水平，在同等劑量作用濃度下，MF的靶向降糖功能明顯強于GP。但同時發(fā)現(xiàn)，在胰島損傷模型中，較高濃度的MF和GP均造成了斑馬魚全部死亡，因而在病理模型適宜劑量濃度選擇方面還需要再進一步優(yōu)化。

GLU是最基礎(chǔ)的營養(yǎng)物質(zhì)，其進入腸道內(nèi)可以直接被吸收，因而MF和GP在本研究中的降糖效應(yīng)與抑制糖類的消化作用是無關(guān)的，推測可能的降糖作用機制與減少GLU腸道吸收量，或者促進胰島素分泌，進而促進體內(nèi)GLU高效利用有關(guān)。MF中包含黃酮、生物堿、多糖等活性成分[15]，GP中包含黃酮、皂苷類、多糖等活性成分[16]。

當前以細胞試驗和大小鼠動物試驗表明，MF和GP具有降糖活性與減少能量物質(zhì)吸收，促進能量物質(zhì)消耗有關(guān)。在MF靶向降糖作用研究方面，呂歡[17]以人結(jié)腸腺癌細胞Caco-2細胞為對象，研究發(fā)現(xiàn)MF提取物能有效降低人結(jié)腸腺癌Caco-2細胞Na+-K+-ATP酶的活性，降低Na+-K+-ATPase、 腸 葡 萄 糖 轉(zhuǎn) 運 載 體（sodium/glucose cotransporters，SGLT）1、葡萄糖協(xié)助擴散轉(zhuǎn)運載體系統(tǒng)（facilitative glucose transporters，GLUT）2以及mRNA的基因表達，表明MF提取物可有效降低GLU的吸收，進而減少GLU的來源。另外，細胞試驗和2型糖尿病大鼠動物試驗表明MF可顯著提高胰島素抵抗（insulin resistance，IR）的3T3-L1脂肪細胞GLU消耗量，增強細胞活力[18-19]，還可以顯著增加骨骼肌組織中胰島素受體底物-1、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）中的p85α、葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4（GLUT4）的mRNA及蛋白的表達[20]，表明MF提取物可以促進GLU的利用，增加GLU的消耗。此外，劉洪鳳等[21]研究發(fā)現(xiàn)MF多糖也具有類似作用，可以上調(diào)2型糖尿病大鼠脂肪組織GLUT4基因的表達，達到降糖作用。在GP靶向降糖研究方面，王同壯等[22]研究發(fā)現(xiàn)500 mg/kg GP葉水提物可以明顯降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的空腹血糖，明顯逆轉(zhuǎn)骨骼肌GLUT4 mRNA及蛋白的表達。趙濤等[23]研究發(fā)現(xiàn)400 mg/kg GP總皂苷可以顯著降低胰腺β細胞凋亡指數(shù)，明顯降低空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素和胰島素抵抗指數(shù)，顯著增加胰島β細胞功能指數(shù)和定量胰島素敏感性檢測指數(shù)，表明GP總皂苷可明顯改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗，提高GLU利用。研究通過高糖誘導(dǎo)型和胰島損傷型糖代謝異常斑馬魚靶向降糖作用評價發(fā)現(xiàn)，MF和GP均具有靶向降糖效應(yīng)，但在同等劑量濃度下MF的降糖效應(yīng)明顯強于GP，且其降糖作用可能與減少GLU吸收以及提高GLU的利用有關(guān)。

4 結(jié)論

高濃度GLU（22～30 mg/mL）溶液、ALX（0.04～0.10 mM）藥物、GLU（22 mg/mL）溶液與四氧嘧啶（0.02～0.08 mM）藥物聯(lián)合誘導(dǎo)可顯著增加斑馬魚（5 dpf）GLU水平，可以建立斑馬魚糖代謝異常生物模型。高濃度的MF和GP對斑馬魚（5 dpf）具有一定殺傷作用，長時孵育時更明顯，但斑馬魚對GP的耐受性強于MF。MF孵育48 h時的LC50為5706.06μg/mL，95%可信范圍為4732.39～7067.28μg/mL，GP孵育72 h時的LC50為9766.18μg/mL，95%可信范圍為7669.52～13927.51μg/mL，按10%～25%LC50推薦MF和GP可用于靶向功效評價的適宜的劑量濃度分別為570.61～1426.52μg/mL、976.62～2441.55μg/mL。同時研究發(fā)現(xiàn)，200、400和800μg/mL ML，800μg/mL GP可以顯著降低高糖溶液誘導(dǎo)型斑馬魚GLU水平，200μg/mL MF和400μg/mL GP可以顯著降低胰島損傷型斑馬魚GLU水平，表明MF和GP具有降糖作用，但在同等劑量濃度下MF的降糖作用明顯強于GP。