缺血性腦卒中與線粒體病理機(jī)制的相關(guān)研究進(jìn)展

穆婷婷 汪寧 吳倩

1安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 安徽合肥 230012；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腦卒中(cerebral stroke)又稱“中風(fēng)”，是因腦部血管突然破裂或血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組急性腦血管疾病，為中醫(yī)學(xué)“風(fēng)、癆、臌、膈”四大疑難病之首[1-2]。其中缺血性卒中占卒中的67.3%～80.5%，是現(xiàn)代社會(huì)危害人類健康的頭號(hào)殺手之一，也是卒中死亡的首要原因[3]。目前臨床上多采用組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator,tPA)溶栓治療，但由于受到時(shí)間窗限制，以及復(fù)灌造成的二次損傷而使其應(yīng)用具有一定的局限性[1]。因此，深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制對(duì)于其預(yù)防和治療意義深遠(yuǎn)。線粒體作為細(xì)胞能量供應(yīng)的主要場(chǎng)所，被稱為細(xì)胞的“動(dòng)力工廠”，對(duì)缺血缺氧極其敏感。缺血性腦卒中血液供應(yīng)不足使能量耗竭，進(jìn)而引起自由基的產(chǎn)生，線粒體膜電位降低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載等，使線粒體首先受到損傷，而受損線粒體又會(huì)成為擴(kuò)大缺血再灌注損傷的繼發(fā)性關(guān)鍵因素，進(jìn)一步加重缺血性損傷。因此，本文就線粒體在缺血性腦卒中的多方面變化作一綜述(見圖 1)，旨在進(jìn)一步了解缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制并為其治療提供理論依據(jù)。

1 缺血性腦卒中與線粒體功能變化

線粒體為腦組織最重要的供能單位之一，生理狀態(tài)下為大腦提供大量且持續(xù)的能量，以維持腦組織的能量供應(yīng)和正常功能。但當(dāng)腦組織缺血缺氧時(shí)，電子傳遞鏈被破壞，不能釋放足夠的能量驅(qū)動(dòng)ADP磷酸化生成ATP，導(dǎo)致能量生成障礙，也使得活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)激增。腦組織啟動(dòng)糖酵解途徑進(jìn)行能量代償，代謝出的乳酸會(huì)使細(xì)胞內(nèi)pH值下降，發(fā)生酸中毒，線粒體膜電位降低。而能量代謝障礙使得ATP酶所依賴的離子泵失活和谷氨酸受體啟動(dòng)增加，協(xié)同促進(jìn)Ca2+相關(guān)通道開放[1]，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，加重腦水腫同時(shí)激活蛋白酶致細(xì)胞死亡。鈣超載協(xié)同ROS激增共同促使線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放，大量小分子物質(zhì)通過線粒體內(nèi)膜，線粒體膜去極化，線粒體膜電位進(jìn)一步下降，激活相關(guān)信號(hào)通路，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑，加重腦組織損傷。過剩ROS攻擊細(xì)胞膜致線粒體嵴排列紊亂[4]，空洞增大，線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，引發(fā)線粒體動(dòng)力學(xué)失衡、線粒體自噬、線粒體免疫炎癥等一系列病理生理過程，神經(jīng)元也因缺少線粒體的供能造成損傷進(jìn)一步加重，從而進(jìn)入線粒體功能紊亂與腦組織損傷的惡性循環(huán)。

大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[5]，腦缺血損傷后大鼠海馬線粒體數(shù)量減少，基質(zhì)透明化，膜磷脂層破壞，水腫、崩解，嵴斷裂溶解、消失、間隙增大。各種檢測(cè)結(jié)果表明海馬線粒體內(nèi)ATP含量顯著降低，游離Ca2+水平顯著升高。熒光顯微鏡下可以觀察到缺血后大鼠海馬線粒體mPTP開放度熒光強(qiáng)度顯著升高、膜電位熒光強(qiáng)度顯著降低。綜上所述，腦缺血后，線粒體出現(xiàn)了一定程度上的結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂。因此，線粒體功能的恢復(fù)對(duì)于缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

圖1 缺血性腦卒中與線粒體級(jí)聯(lián)反應(yīng)示意圖

2 缺血性腦卒中與線粒體代謝

線粒體是細(xì)胞代謝發(fā)生的主要細(xì)胞器。在線粒體內(nèi)膜發(fā)生的三羧酸循環(huán)是三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供能的共同途徑。腦組織所需要的能量主要來源于糖代謝，其余由脂類代謝供給，并盡量減少蛋白質(zhì)代謝。腦組織不能直接利用糖、脂肪、蛋白質(zhì)而以ATP的形式供能。

2.1能量代謝 當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，能量代謝首先受到干擾，三羧酸循環(huán)障礙，過剩丙酮酸被還原成乳酸，造成乳酸大量堆積而發(fā)生乳酸性酸中毒，損傷腦組織，同時(shí)此途徑的產(chǎn)能也較有氧呼吸大大減少。

研究發(fā)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠腦組織中乳酸含量升高，乳酸脫氫酶含量下降，提示腦缺血后發(fā)生無氧呼吸[6]。香丹注射液可以通過降低乳酸含量、升高乳酸脫氫酶水平發(fā)揮缺血后的腦保護(hù)作用。曹東敏等[7]發(fā)現(xiàn)MCAO大鼠腦組織乳酸含量上升，而作為三羧酸循環(huán)主要原料的檸檬酸含量降低，也說明了腦缺血后糖代謝水平下降，無氧呼吸代償性增強(qiáng)。

2.2脂代謝 缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，能量供需失衡是造成脂代謝紊亂的主要原因。脂肪酸通過脂代謝生成酮體，在腦組織線粒體中經(jīng)過一系列催化作用生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量代償。但此過程會(huì)造成能量失衡進(jìn)而引發(fā)脂代謝紊亂，損傷腦組織。同時(shí)由于缺血性腦卒中后自由基的大量積聚，多種不飽和脂肪酸衍生的脂質(zhì)過氧化物易被分解成丙二醛進(jìn)一步加重腦損傷。

馬翠翠等[6]觀察到MCAO模型大鼠腦組織中丙二醛含量升高，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶含量均出現(xiàn)下降，提示腦缺血后發(fā)生脂質(zhì)過氧化和神經(jīng)元受損病理過程。生理狀態(tài)下，α-亞麻酸會(huì)代謝成二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，亞油酸代謝為 γ-亞麻酸和花生四烯酸并維持一定含量的穩(wěn)態(tài)[8]。而缺血性腦卒中引發(fā)的能量失衡則會(huì)打破這一穩(wěn)態(tài)，加重腦組織損傷。對(duì)腦缺血模型大鼠尿樣和血樣中的代謝物分析發(fā)現(xiàn)，給予香丹注射液后，與脂肪酸代謝有關(guān)的二十二碳六烯酸、亞油酸、花生四烯酸等發(fā)生顯著逆轉(zhuǎn)[6]，提示香丹注射液抗腦缺血作用可能與干預(yù)大鼠體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑有關(guān)。

2.3氨基酸代謝 隨著氨基酸代謝水平的代償升高，腦損傷程度也在進(jìn)一步加重。氨基酸通過脫氨基作用被轉(zhuǎn)變?yōu)榘焙挺?酮酸。后者可以通過糖異生進(jìn)入糖代謝或合成酮體進(jìn)入脂代謝供能。但值得注意的是，腦組織對(duì)氨基酸代謝產(chǎn)物氨極為敏感，大量氨進(jìn)入腦組織，與三羧酸循環(huán)原料α-酮戊二酸結(jié)合生成大量谷氨酸，降低三羧酸循環(huán)速率的同時(shí)，也使得谷氨酸-谷氨酰胺代謝失衡，最終導(dǎo)致線粒體功能紊亂和神經(jīng)組織損傷。

張?zhí)焓娴萚9]研究結(jié)果表明，MCAO模型大鼠左腦皮層和紋狀體中谷氨酸含量下降,而皮層和海馬中谷氨酰胺含量上升,這說明缺血引起了腦組織內(nèi)谷氨酸-谷氨酰胺代謝紊亂。馬翠翠研究團(tuán)隊(duì)[6]發(fā)現(xiàn)給予香丹注射液后，與氨基酸代謝有關(guān)的谷氨酸發(fā)生顯著逆轉(zhuǎn)。通過血清分析可以觀察到MCAO模型大鼠谷氨酸含量顯著上升[7]，而給予人參總皂苷后，谷氨酸水平大大降低，也提示腦缺血后谷氨酸-谷氨酰胺代謝失衡，而人參總皂苷能抑制這一現(xiàn)象的發(fā)生。

綜上所述，腦卒中后會(huì)發(fā)生一系列代謝異常，諸如能量代謝、脂代謝以及蛋白質(zhì)代謝異常，通過改善缺血性腦卒中后的代謝對(duì)于神經(jīng)保護(hù)具有重要意義。

3 缺血性腦卒中與線粒體依賴的凋亡途徑

凋亡(Apoptosis)為程序性死亡的一種，是指生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號(hào)誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在相關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。通過抑制腦缺血后的細(xì)胞凋亡有助于受損神經(jīng)元的恢復(fù)[10-11]。在腦缺血中，線粒體過表達(dá)ROS和鈣超載等事件發(fā)生，激活相關(guān)信號(hào)通路，從而引發(fā)由線粒體依賴的凋亡途徑。目前，公認(rèn)的比較經(jīng)典的線粒體依賴的凋亡途徑為：腦缺血后ROS激增和鈣超載事件誘導(dǎo)mPTP開放，從而釋放細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase 9)的蛋白前體形成凋亡小體引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)[12]，最終釋放促凋亡蛋白，損傷腦組織[13-14]。近年來大量研究表明，可以通過干預(yù)凋亡從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。我國(guó)學(xué)者對(duì)缺血后凋亡展開了大量研究，發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及相關(guān)活性成分可以通過抑制凋亡發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[15-17]。

因此，抑制缺血性腦卒中時(shí)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有助于挽回缺血造成的腦損傷。

4 缺血性腦卒中與線粒體動(dòng)力學(xué)

線粒體是一種處于高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器[18]，通過頻繁的融合分裂形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來維持其正常功能與形態(tài)，參與細(xì)胞的能量代謝、自噬與凋亡等即線粒體動(dòng)力學(xué)(mitochondrial dynamics)，也稱線粒體分裂融合。生理狀態(tài)下，神經(jīng)元末梢的長(zhǎng)距離運(yùn)輸和能量均勻分布需要以線粒體融合分裂的動(dòng)態(tài)平衡作為基本保證。而腦缺血發(fā)生時(shí)線粒體功能紊亂所引發(fā)普遍的線粒體動(dòng)力學(xué)異常，產(chǎn)生大量片段化線粒體是致使細(xì)胞死亡的關(guān)鍵過程。通過抑制線粒體動(dòng)力學(xué)異常，則可能在腦缺血損傷早期保護(hù)神經(jīng)元。

熒光顯微鏡可觀察到氧糖剝離/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)細(xì)胞模型損傷后，細(xì)胞線粒體分裂蛋白(dynamin-related protein 1，Drp1)熒光強(qiáng)度較正常組升高、線粒體融合蛋白(Optic atrophy 1，Opa1)熒光強(qiáng)度降低，而這兩種線粒體融合分裂蛋白表達(dá)失衡標(biāo)志著線粒體生理結(jié)構(gòu)被破壞，表明線粒體融合分裂異常[19-20]。予以西紅花苷可以有效下調(diào)Drp1表達(dá)、上調(diào)Opa1表達(dá)，同時(shí)改善線粒體功能[19]，提示西紅花苷可能通過干預(yù)線粒體分裂融合發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。綜上所述，腦缺血后線粒體功能紊亂造成的線粒體動(dòng)力學(xué)失衡會(huì)損傷腦組織，因此盡快恢復(fù)線粒體動(dòng)力學(xué)的正常功能對(duì)于改善腦神經(jīng)功能具有重要意義。

5 缺血性腦卒中與線粒體自噬

線粒體自噬(Mitophagy)一詞由 Lemasters在2005年首次提出。它是一種線粒體選擇性自噬的過程[21]，腦缺血后對(duì)受損線粒體的選擇性清除[22]對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、改善神經(jīng)功能具有重要意義。

袁揚(yáng)[23]在透射電鏡下觀察到小鼠缺血復(fù)灌模型中存在損傷線粒體被雙層膜自噬泡包裹的現(xiàn)象，證明了線粒體自噬的發(fā)生。沈哲[24]利用熒光共定位技術(shù)觀察到神經(jīng)元OGD損傷后線粒體與自噬泡標(biāo)記物L(fēng)C3的共定位情況，同樣也表明了腦缺血后線粒體自噬的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予線粒體自噬抑制劑(Mitochondrial division inhibitor1，mdivi-1)后，線粒體自噬被抑制，并且加重了MCAO復(fù)灌后的腦梗死體積，上述結(jié)果表明了線粒體自噬在缺血復(fù)灌時(shí)的保護(hù)作用。因此，促進(jìn)腦缺血后線粒體自噬，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)神經(jīng)組織損傷等都具有重要意義。

6 缺血性腦卒中與線粒體免疫應(yīng)答

線粒體是自由基產(chǎn)生的主要部位[25]。缺血性腦卒中時(shí)，線粒體ROS的過表達(dá)可以使核因子-κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)[26]、趨化因子、干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRFs-1)等表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等[27]共同激發(fā)炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷，這種病理變化即缺血性腦卒中的免疫炎癥反應(yīng)[28-29]。目前的研究大部分都是通過抑制線粒體ROS的過表達(dá)從而降低炎性因子水平，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，線粒體ROS抑制劑R(+)-普拉克索[R(+)-PPX]可以通過阻止mPTP的開放，保護(hù)線粒體膜完整性，進(jìn)而抑制ROS的產(chǎn)生[30]。Chae U等[31]通過研究證明線粒體ROS可直接調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)。丁錨等[32]猜想R(+)-PPX可以通過抑制ROS從而降低TNF-α等炎性因子的水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。他們通過熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MCAO組大鼠再灌注6h缺血半暗帶區(qū)ROS與TNF-α存在共定位的情況。并且MCAO組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，而予以R(+)-PPX組大鼠再灌注6 h缺血半暗帶區(qū)TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。表明了R(+)-PPX可以通過降低TNF-α等炎性因子的水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，腦缺血后線粒體內(nèi)ROS上調(diào)炎性因子的表達(dá)致腦損傷加重，而抑制線粒體ROS的過表達(dá)可在腦缺血的早期損傷起到重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

線粒體是細(xì)胞能量供應(yīng)最為重要的場(chǎng)所，對(duì)于缺血缺氧極其敏感，缺血性腦卒中發(fā)生后，會(huì)以線粒體為中心，引起一系列病理生理變化，諸如線粒體功能、線粒體能量代謝、線粒體依賴的凋亡途徑、線粒體動(dòng)力學(xué)、線粒體自噬、線粒體免疫炎癥，而受損線粒體造成的能量障礙又會(huì)成為擴(kuò)大損傷的關(guān)鍵繼發(fā)因素，進(jìn)一步加重缺血性腦損傷。本文以線粒體為中心，對(duì)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)線粒體的變化及可能的干預(yù)手段進(jìn)行歸納整理，以對(duì)缺血性腦卒中的研究和治療提供可能的線索。