不同核酸提取試劑對(duì)不同樣本中非洲豬瘟病毒DNA提取效果的比較

陳雪蓉，徐 林，湯 承，岳 華

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省甘孜藏族自治州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將它列為必須及時(shí)申報(bào)的動(dòng)物傳染病[1]，也是國(guó)內(nèi)外動(dòng)物防疫的重點(diǎn)疫病之一[2-3].對(duì)于非洲豬瘟的病原學(xué)檢測(cè)，目前常用的方法是PCR檢測(cè).能否提取高質(zhì)量的核酸直接關(guān)系PCR檢測(cè)試驗(yàn)的成敗.有研究發(fā)現(xiàn)，不同病毒核酸提取試劑盒直接影響病毒核酸的提取效率，從而影響檢測(cè)效率[4].在動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)上，有研究針對(duì)甲型H1N1流感病毒[5]、豬圓環(huán)病毒2型[6]、H5N1禽流感病毒[7]、新城疫病毒[8]、布魯氏菌[9]、豬丹毒桿菌[10]、豬偽狂病毒[11]等采用不同核酸提取試劑盒或不同核酸提取方法進(jìn)行核酸提取的比較研究，結(jié)果表明，不同核酸提取試劑盒或不同核酸提取方法提取的核酸可直接影響PCR的檢測(cè)效果.針對(duì)不同類型的樣品選取核酸提取效率高、純度好、穩(wěn)定性好、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便的核酸提取試劑非常重要.本研究針對(duì)市售的5種病毒核酸提取試劑開展不同樣本中ASFV核酸提取效果比較研究，從提取濃度、純度、效率、時(shí)間、操作簡(jiǎn)便性等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，探索不同樣品最高效的ASFV核酸提取方法.

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

ASFV陽(yáng)性樣本(口腔棉拭子、全血、脾臟、淋巴結(jié)、腎臟)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性，并測(cè)序證實(shí)，由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(四川省ASF定點(diǎn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室)提供，用于ASFV核酸提取效果的比較.

1.2 主要試劑

Premix Ex Taq(Probe qPCR)購(gòu)于寶生物工程(大連)股份有限公司；DNA Marker購(gòu)于TaKaRa公司；DNA經(jīng)典提取(試劑C:酚-氯仿)；DNA專提試劑(試劑B:Viral DNA Kit核酸提取試劑盒由QMEGA BIO-TEK公司生產(chǎn)提供)；DNA/RNA同提試劑(試劑A:DNA∕RNA Extraction Kit由洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司生產(chǎn)提供)；試劑D:TIANamp Virus DNA∕RNA Kit由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)提供；試劑E:PetNAD核酸萃取試劑盒由金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司生產(chǎn)提供.

1.3 主要儀器

各量程移液器購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；核酸蛋白分析儀購(gòu)于日本島津公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于湘儀離心機(jī)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司；熒光定量PCR儀購(gòu)于杭州博日公司；cubee小型高速離心機(jī)購(gòu)于中國(guó)廈門金瑞鴻捷公司.

1.4 引物、探針的合成

本研究采用的PCR方法為中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第172號(hào):豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)方法[12]，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為63 bp，引物序列:F:5‘-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3‘，R:5‘-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3‘.探針序列:5‘-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3‘.引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.5 樣本的處理

本研究采用的樣本處理方法為中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第172號(hào):豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)方法[12].

豬組織 每種組織分別取樣和處理.取不少于2.0 g組織，研磨后用5倍體積滅菌PBS懸浮，70℃滅活30 min，4℃下以2000～3000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行核酸提取.

棉拭子 取棉拭子放于3.5 mL滅菌PBS振蕩渦旋，取上清液進(jìn)行核酸提取.

全血 直接取全血進(jìn)行核酸提取.

1.6 核酸的提取

A、B、D和E四種方法均采用柱純化提取核酸，C為酚-氯仿提取方法，按照試劑盒說明書手動(dòng)提取核酸，初始樣本量均為200 μL，對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行三次平行核酸提取，最后均獲得50 μL總DNA，-20℃保存?zhèn)溆?

1.7 核酸提取完整性的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

5種核酸提取試劑分別對(duì)口腔棉拭子、全血、淋巴結(jié)、脾臟和腎臟5種ASFV陽(yáng)性樣本三個(gè)平行提取的總DNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，比較其DNA的完整性.

1.8 核酸濃度及純度的檢測(cè)

使用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的核酸濃度以及純度，比較5種不同試劑盒所提取的5種樣本中總核酸的濃度和純度.

1.9 ASFV DNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用的PCR方法為中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第172號(hào):豬用生物制品及相關(guān)豬源原輔材料中非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)方法[12]，按照以下程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):50℃2 min，95℃5 min，95℃15 s，58℃退火延伸1 min，45個(gè)循環(huán)(熒光信號(hào)收集在此階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)進(jìn)行)，對(duì)5種核酸提取試劑盒提取的5種樣本的ASFVDNA進(jìn)行三次重復(fù)檢測(cè).

1.10 不同核酸提取試劑盒提取相同數(shù)量的樣本所需時(shí)間及儀器的比較

用5種核酸提取試劑提取5個(gè)樣本，每個(gè)樣本平行提取3份核酸，比較其所需時(shí)間及儀器.

1.11 數(shù)據(jù)處理

使用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA提取液總濃度和純度，純度以A260/A280＝1.8～1.9為較好純度[13]，采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的熒光定量PCR方法對(duì)所提樣本核酸進(jìn)行擴(kuò)增，CT值越小，則樣品病毒含量越高[14].所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS軟件進(jìn)行分析處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 DNA片段完整性的測(cè)定

5種核酸提取試劑分別對(duì)5種不同類型的樣本3份平行提取的ASFV核酸電泳結(jié)果如圖1所示.從5種試劑對(duì)同一樣本的提取核酸完整性來看，B、C、D三種試劑對(duì)口腔棉拭子的核酸提取完整性較好，C試劑對(duì)全血的核酸提取完整性最好，B、C、D三種試劑對(duì)淋巴結(jié)的核酸提取完整性較好，D試劑對(duì)脾臟的核酸提取完整性最佳，A、B、C、D、E五種試劑對(duì)腎臟組織的核酸提取完整性均較好.

圖1 提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳注:M:DNA Marker；N:陰性對(duì)照Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted Note:M:DNA Marker，N:Negative control

2.2 核酸提取的濃度及純度的測(cè)定

結(jié)果如表1a～表1e所示:5種試劑對(duì)同一樣本的核酸提取濃度分析提取效果可見試劑D對(duì)脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、棉拭子4種樣本的核酸提取濃度最高，試劑C對(duì)全血樣本的核酸提取濃度最高.5種試劑對(duì)同一樣本的DNA提取純度分析提取效果可見，對(duì)口腔棉拭子樣本，試劑B的提取純度最好；對(duì)于全血樣本，試劑B的提取純度最好；對(duì)于淋巴結(jié)樣本，試劑B的提取純度好；對(duì)于脾臟樣本，試劑B、C的提取純度最好；對(duì)于腎臟樣本，試劑B、C的提取純度最好.

表1 e DNA提取液濃度純度測(cè)定(腎臟)Table 1e Determination of concentration and purity of DNA extract(kidney)

表1 d DNA提取液濃度純度測(cè)定(脾臟)Table 1d Determination of concentration and purity of DNA extract(spleen)

表1 c DNA提取液濃度純度測(cè)定(淋巴結(jié))Table 1c DNA extract concentration and purity determination(lymph nodes)

表1 b DNA提取液濃度純度測(cè)定(全血)Table 1b Determination of concentration and purity of DNA extract(whole blood)

表1 a DNA提取液濃度純度測(cè)定(口腔棉拭子)Table 1a Determination of the concentration and purity of DNA extracts(oral cotton swabs)

2.3 不同試劑提取樣本核酸RT-qPCR CT值的測(cè)定

結(jié)果如表2所示:在口腔棉拭子組織中，試劑C與A極顯著(p＜0.01)，與D顯著(p＜0.05)，從CT值來看，試劑B提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在全血組織中，C試劑與B、E試劑之間極顯著(p＜0.01)，與A試劑顯著(p＜0.05)，B試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在淋巴結(jié)組織中，C試劑與A、B、D、E試劑均極顯著(p＜0.01)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在脾臟組織中，C試劑與A、D試劑極顯著(p＜0.01)，與E試劑顯著(p＜0.05)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.在腎臟組織中，C試劑與A、D、E試劑間極顯著(p＜0.01)，C試劑提取ASFV DNA樣本初始模板濃度最高.

表2 樣本CT值Table 2 CT values of samples

2.4 不同核酸提取試劑盒提取相同數(shù)量的樣本所需時(shí)間及儀器的比較結(jié)果

如表3所示，在15個(gè)樣本的核酸提取中，試劑C提取所需時(shí)間最長(zhǎng)，所需儀器較多，E核酸提取試劑提取時(shí)間最短、所需儀器最少及最便攜.

表3 5種核酸提取試劑提取相同數(shù)量的樣本所需時(shí)間及儀器Table 3 Time and equipment required for five nucleic acid extraction reagents to extract the same number of samples

3 討論

本研究比較經(jīng)典酚氯仿法、兩種DNA提取試劑以及三種DNA/RNA同提試劑對(duì)ASFV常用檢測(cè)樣本(口腔棉拭子、全血、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟)的核酸提取效果，從核酸片段完整性、核酸濃度及純度、實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)CT值及耗時(shí)便攜性五個(gè)方面進(jìn)行分析.

3.1 不同試劑提取核酸質(zhì)量的比較

對(duì)于病毒核酸檢測(cè)，除了檢測(cè)試劑盒的特異性、敏感性和重復(fù)性等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大外，病毒核酸的質(zhì)量對(duì)其影響也非常大.提取總DNA的方法眾多，采用不同的提取試劑及方法獲得的核酸片段完整性、DNA含量和純度也不同[15-16].本研究中，DNA專提試劑B、C所提總核酸片段完整度較好，總濃度較高，DNA純度較好，其中試劑B更優(yōu)于試劑C，原因可能是因?yàn)镃是傳統(tǒng)的酚氯仿法，而B是采用柱純化技術(shù)的DNA提取試劑盒，因此提取總濃度及DNA純度更好.在DNA/RNA同提試劑A、C、D中，D試劑所提核酸片段完整性好，且總濃度最高，但DNA純度最差.E試劑提取核酸片段較完整，濃度較A高，純度是A、D、E三種DNA/RNA同提試劑中最好的.A試劑在口腔棉拭子和全血樣本中提取核酸片段較差，總濃度最低，DNA純度較差.因此，建議DNA病毒核酸提取用DNA專提試劑，提取核酸質(zhì)量更好，本研究也為今后的ASFV核酸提取提供了參考.

3.2 同一試劑對(duì)不同樣本中ASFV DNA的提取比較

2016年孫盛用五種不同的試劑分別提取腸道內(nèi)容物和糞便DNA，得出不同試劑對(duì)同一樣本提取效果有顯著差異的結(jié)論[17].在本研究中不同試劑對(duì)ASFV同一樣本的提取效果差異顯著(p＜0.05).試劑B提取ASFV口腔棉拭子和全血樣本CT值較低，效果更好；試劑C提取ASFV淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等生物組織樣本CT值較低，效果更好，試劑C為經(jīng)典酚氯仿法，試劑B為商品化DNA提取試劑，都為DNA專提，提取ASFV效果更好.在本研究中，同為DNA/RNA同提試劑盒的A、D、E中，試劑E對(duì)口腔棉拭子、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟等樣本中的ASFV DNA提取效果較好，但對(duì)全血樣本的效果比試劑A和D差.因此，針對(duì)ASFV DNA的提取，可根據(jù)不同樣本選擇合適的提取試劑，會(huì)提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性.

3.3 核酸提取的時(shí)間和便攜性

在核酸提取時(shí)效性方面，以E試劑操作步驟最簡(jiǎn)便，所需儀器最便攜，耗時(shí)最短.C試劑提取時(shí)間最長(zhǎng)，所需儀器較多，所用時(shí)間最長(zhǎng).B試劑操作步驟簡(jiǎn)單，雖所需儀器較多，但耗時(shí)較短.因此，在今后工作中，各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?、樣品?shù)量、提取核酸類型及實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件等情況，合理選擇核酸提取試劑，為動(dòng)物疫病檢測(cè)獲得更合理、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù).