環(huán)狀RNA-ITGA1促進(jìn)三陰性乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移

王澤坤，李亞明，楊靖雯，楊其峰,

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性生命健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率不斷升高，約占全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的24%[1]。目前，國(guó)際通用的乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)可將乳腺癌分為L(zhǎng)uminal A型、Luminal B型、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽(yáng)性型、三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）及其他特殊類型乳腺癌[2-3]。TNBC大約占全部乳腺癌的15%，該類型的乳腺癌以雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及HER2表達(dá)均陰性為特點(diǎn)。TNBC好發(fā)于年輕女性，其相對(duì)于其他類型的乳腺癌具有生長(zhǎng)速率快、侵襲性強(qiáng)、容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，同時(shí)其缺乏內(nèi)分泌及抗HER2治療的靶點(diǎn)，目前尚無(wú)針對(duì)性的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，患者的5年生存率不足30%[4]。因此，急需尋找TNBC的新型診斷標(biāo)記物及分子治療靶點(diǎn)。

非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）是一類缺乏開放閱讀框（open reading frame，ORF）、無(wú)法被翻譯成為蛋白質(zhì)的RNA，其已被證明可以在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性生物學(xué)行為過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[5]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA家族中的一種，不具有編碼蛋白的能力但可參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，其由前體mRNA經(jīng)由反向剪接反應(yīng)形成，因此具有特殊的剪接位點(diǎn)及序列；circRNA在發(fā)現(xiàn)之初被認(rèn)為是mRNA錯(cuò)誤剪接的產(chǎn)物[6-7]。同時(shí)circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解，并具有高度穩(wěn)定性和組織特異性[8]。

近年來(lái)，各種研究表明circRNA在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的異常表達(dá)參與了肺癌、肝癌和膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[9-11]。CircRNA在TNBC中的調(diào)控功能也有過(guò)相關(guān)報(bào)道，如circAGFG1可通過(guò)調(diào)控miR-195-5p/CCNE1信號(hào)軸促進(jìn)TNBC的進(jìn)展[12]，circRNA_069718可以通過(guò)激活Wnt/beta-catenin通路促進(jìn)TNBC的增殖及侵襲能力[13]，circIFI30可以促進(jìn)TNBC的進(jìn)展并與TNBC患者的預(yù)后密切相關(guān)[14]。綜上所述，circRNAs可以在TNBC的進(jìn)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要的作用，但有關(guān)circRNA在TNBC中的具體功能及分子機(jī)制仍不明確，亟待進(jìn)一步的研究。

本研究中首先利用高通測(cè)序技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，circRNA hsa-circ-0004840 [circ-整合素α1（integrin alpha 1，ITGA1）]在高轉(zhuǎn)移能TNBC細(xì)胞中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)狀態(tài)。隨后發(fā)現(xiàn)，干擾circ-ITGA1表達(dá)可以顯著抑制TNBC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，過(guò)表達(dá)circ-ITGA1則可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的上述惡性生物學(xué)行為，并且circ-ITGA1可能是通過(guò)影響miR-624-5p/LMBRL1信號(hào)軸發(fā)揮相應(yīng)的功能。本研究證明了circ-ITGA1在TNBC的進(jìn)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，為進(jìn)一步理解TNBC進(jìn)展轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

人正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞以及乳腺癌MCF-10AT、MCF-10CA1A、MCF-10CA1H、HS578T、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司。LipofectAMINETM 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。RNA抽提試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙艾科瑞生物工程有限公司、PCR擴(kuò)增試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司、EdU試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司、MTT購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，結(jié)晶紫染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。特異性針對(duì)circ-ITGA1的siRNA（sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2）及陰性對(duì)照（negativecontrol，NC）（siNC）購(gòu)自上海鉑尚生物技術(shù)有限公司。siNC的正義鏈序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’反義鏈序列為5’-AAACGTGACACGTTCGGAGAA-3’；sicirc-ITGA1-1的正義鏈序列為5’-AACAGACA CAGGGTGCTTATT-3’，反義鏈 序列為5’-AATAAGCACCCTGTGTCTGTT-3’；sicirc-ITGA1-2的正義序列為5’-TAAACAGACACAGG GTGCTTA-3’，反義鏈序列為5’-TAAGCACCC TGTGTCTGTTTA-3’。攜帶有特異性針對(duì)circ-ITGA1的重組過(guò)表達(dá)（overxexpression，OE）載體（PLCDH-circ-ITGA1-OE）及空載質(zhì)粒PLCDH（對(duì)照）購(gòu)自廣州吉賽生物科技股份有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RNA測(cè)序

建立TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231的高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞MDA-MB-231-M，提取細(xì)胞總RNA；用RNase R將RNA消化為線性RNA，行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。將RNA送聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，并利用生物信息學(xué)分析方法分析測(cè)序結(jié)果，篩選出親本MDA-MB-231細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移能MDA-MB-231-M細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNAs。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞用含青鏈霉素雙抗及10% FBS的DMEM培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)液），置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔24～48 h更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞在融合度為90%～100%時(shí)，更換為無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞；使用LipofectAMINETM 2000分別將siRNA（sicirc-ITGA1-1、sicirc-ITGA1-2及siNC）或重組過(guò)表達(dá)載體（PLCDHcirc-ITGA1-OE及空載體PLCDH）轉(zhuǎn)入MDAMB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中，8～10 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)液，24 h后再更換為有血清的培養(yǎng)液。circ-ITGA1過(guò)表達(dá)組中還需在24～36 h后加入終濃度為2.5 μmol/mL的嘌呤（puro）進(jìn)行篩選，最終篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circ-ITGA1的MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)染24～36 h后，采用RNAeasy法提取MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的總RNA，用DEPC處理后的去離子水溶解RNA。用Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA濃度與純度。將提取獲得的總RNA按照10 μL體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 20 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存。以cDNA為模板，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)circ-ITGA1的表達(dá)水平（以β-actin為內(nèi)參照）；反應(yīng)體系為Syber green、引物（內(nèi)參或目的基因）和cDNA（共計(jì)10 μL）；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性5 s，55～68 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用2-△△Ct法計(jì)算circ-ITGA1在樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

所用引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。circ-ITGA divergent上游引物序列為5’-TG CTGGATGGTTCCAACAGT-3’，下游引物序列 為5’-CACCTCTCCCAACTGGACAC-3’；circ-ITGA convergent上游引物序列為5’-TGC TTATTGGTTCTCCG-3’，下游引物序列為5’-TTGAAATGTGGGGCTGA-3’；ITGA1基因上游引物序列為5’-CCGAAGAGGTACTTG TTGCAGC-3’,下游引物序列為5’-GGCTTCC GTGAATGCCTCCTTT-3’；β-actin基因（內(nèi)參照）上游引物序列為5’-CACCATTGGCAATGA GCGGTTC-3’,下游引物序列為5’-AGGTCT TTGCGGATGTCCACGT-3’。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞中分別干擾及過(guò)表達(dá)circ-ITGA1。將各對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。以1 500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中（共設(shè)置6塊板），每孔中用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液將體積補(bǔ)齊至100 μL。從細(xì)胞接種24 h起，每24 h同一時(shí)間在其中一塊板中加MTT染料，4～6 h后在免疫酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔的D值。連續(xù)檢測(cè)6 d，并根據(jù)D值繪制成細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞系中分別干擾及過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后，將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段，即大約占培養(yǎng)皿面積的60%～70%，然后將細(xì)胞種到96孔板中，每孔約1×104個(gè)細(xì)胞。過(guò)夜（培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段），每孔加入100 μL含Edu的培養(yǎng)液（EdU溶液與細(xì)胞完全培養(yǎng)液的體積稀釋比例為1∶1 000），孵育2 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入在4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.5%在TritonX-100溶液通透10 min后，隨后根據(jù)體外試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下隨機(jī)挑選3個(gè)視野進(jìn)行取像和計(jì)數(shù)。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞中分別干擾及過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后，將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段，將各對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞接種至6孔板中，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔約800個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液并觀察細(xì)胞形態(tài)，3～6周后吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌1遍，用100%甲醇溶液固定細(xì)胞15～20 min，除去甲醇溶液，加入結(jié)晶紫染色15～20 min，用三蒸后的去離子水清洗細(xì)胞，晾干后拍照保留結(jié)果。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的橫向遷移能力

在MDA-MB-231及MDA-MB-468細(xì)胞系中分別干擾及過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后，將細(xì)胞各組細(xì)胞接種于24孔板中（2×105個(gè)細(xì)胞/孔）；24 h后用PBS清洗細(xì)胞3遍，最后1遍清洗時(shí)不吸走PBS，使用10 μL槍頭在24孔板內(nèi)進(jìn)行劃痕，置于倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝0 h劃痕距離，更換無(wú)血清培養(yǎng)液，隨后將24孔板放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再置于倒置光學(xué)顯微鏡下拍攝24 h時(shí)的劃痕距離，然后計(jì)算出愈合率，與0 h進(jìn)行比較，即可得出細(xì)胞的相對(duì)遷移能力。

1.2.8 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的縱向遷移能力和侵襲能力

將700 μL含有20% FBS的DMEM培養(yǎng)液加入24孔板中作為下室，將Transwell小室放入其中，作為上室。將MDA-MB-231細(xì)胞（6×104個(gè)/孔）和MDA-MB-468細(xì)胞（8×104個(gè)/孔）制成200 μL無(wú)血清的細(xì)胞懸液，接種于上室中，將設(shè)有小室的24孔板緩慢水平放置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（MDAMB-468細(xì)胞需培養(yǎng)48 h）。用PBS輕輕洗滌1～2遍，用甲醇溶液固定細(xì)胞15 min，吸棄甲醇溶液，用結(jié)晶紫染料染色15 min后用三蒸去離子水輕柔洗凈，用棉球輕輕擦去上室中未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞，干燥后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中首先在小室膜上鋪設(shè)基質(zhì)膠，其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用Graph Pad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示。對(duì)于2組數(shù)據(jù)，選擇t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，而對(duì)于多組間數(shù)據(jù)首先選擇單因素方差分析，再行組內(nèi)兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Circ-ITGA1在TNBC高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞中高表達(dá)

為了篩選與TNBC進(jìn)展轉(zhuǎn)移相關(guān)的circRNAs，本研究前期即建立了MDA-MB-231細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞MDA-MB-231-M。利用高通量測(cè)序的方法檢測(cè)了2組細(xì)胞間差異表達(dá)的circRNAs。結(jié)果顯示（圖1A），共有6 283個(gè)circRNAs在高轉(zhuǎn)移能MDA-MB-231-M細(xì)胞中高表達(dá)，4 667個(gè)circRNAs在MDA-MB-231-M細(xì)胞中表達(dá)降低。利用該高通量測(cè)序結(jié)果檢出的circRNAs的長(zhǎng)度分布及分類如圖所示（圖1B和圖1C），選擇表達(dá)變化最為顯著的5個(gè)上調(diào)的circRNAs及5個(gè)下調(diào)的circRNAs（圖1D）。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞系中的各circRNAs表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在TNBC細(xì)胞系中顯著上調(diào)且與乳腺癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)（圖1E），同時(shí)通過(guò)檢索Mioncocirc數(shù)據(jù)庫(kù)[15]發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在人體各種類型腫瘤中廣泛表達(dá)（圖1F）。最后，在MDA-MB-231及高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞系MDA-MB-231-M中檢測(cè)了該circRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞系中同樣顯著調(diào)（P＜0.01）（圖1G）。上述結(jié)果提示，circ-ITGA1表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的惡性程度呈正相關(guān)，其可能在TNBC細(xì)胞的進(jìn)展轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

Fig.1 Circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) was up-regulated in metastatic TNBC cells.A:Heatmap of the significantly differentially expressed circRNAs between MDA-MB-231 and its highmetastatic MDA-MB-231-M cells.B:The length of identified circRNAs was presented.C:The types of identified circRNAs were presented.D:Five most significantly up-regulated and down-regulated circRNAs based on RNA-seq were presented.E:The expression level of circ-ITGA1 in breast cancer cells (MCF-10AT,MCF-10CA1A,MCF-10CA1H,HS578T,MCF-7,SK-BR-3,MDA-MB-453,MDA-MB-231 and MDAMB-468),and the human normal breast epithelial cells MCF-10A as the control.F:The expression level of circ-ITGA1 in different tissues based on Mioncocirc database.G:The expression level of circ-ITGA1 was detected in MDA-MB-231 and its high-metastatic MDA-MB-231-M cells with different high-metastatic abilities detected by real-time fluorescent quantitative-PCR.**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).ACC:Adenoid cystic carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COLO:Colorectal cancer;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HCC:Liver hepatocellular carcinoma;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KDNY:Kidney cancer;LUNG:Lung cancer；OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SECR:Secretory cancer;SKCM:Skin cutaneous melanoma.圖1 circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移TNBC細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)

2.2 驗(yàn)證Circ-ITGA1在TNBC細(xì)胞中為circRNA

通過(guò)檢索UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)[16]發(fā)現(xiàn)，circ-ITGA1由ITGA1基因的3～6號(hào)外顯子反向剪接形成，其成熟體circRNA的長(zhǎng)度為442 nt。因此，本研究中首先設(shè)計(jì)了特異性針對(duì)circ-ITGA1反向引物（divergent primer）及正向引物（convergent primer），并利用反向引物擴(kuò)增circ-ITGA1的反向剪接位點(diǎn)，并通過(guò)Sanger測(cè)序技術(shù)成功的檢測(cè)到了circ-ITGA1的剪接點(diǎn)特異性序列，該序列與circBase數(shù)據(jù)庫(kù)[17]展示的序列一致。證明了TNBC細(xì)胞內(nèi)存在circ-ITGA1（圖2A）。

由于circRNA具有抵抗核糖核酸酶R（RNAse R）消化的特性，本研究中利用RNAse R對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞總RNA進(jìn)行處理，并采用PCR法檢測(cè)circ-ITGA1對(duì)RNAse R的抵抗能力。結(jié)果顯示（圖2B），利用divergent引物特異性擴(kuò)增circ-ITGA1，在有無(wú)RNase R處理的情況下均可擴(kuò)增出產(chǎn)物；利用convergent引物擴(kuò)增線性RNA，在無(wú)RNase R處理時(shí)可以有效擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而在RNase R處理的情況下，PCR產(chǎn)物顯著降低（MDA-MB-231細(xì)胞）甚至無(wú)法有效擴(kuò)增（MDA-MB-468細(xì)胞）（P＜0.01）。這一結(jié)果表明，circ-ITGA1為circRNA，并且耐受RNase R消化。同時(shí)，以細(xì)胞基因組DNA（genomic DNA，gDNA）或cDNA為模板，分別用divergent primer和convergent primer對(duì)circ-ITGA1及β-actin（內(nèi)參照）的進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)circ-ITGA1僅在cDNA中可被檢測(cè)出來(lái)，未在gDNA中發(fā)現(xiàn)，符合circRNA的特性（圖2C）。

隨后，用放線菌素D處理MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞（0、4、8、12和24 h），并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)circ-ITGA1及本底基因ITGA1表達(dá)水平的變化。結(jié)果（圖2D）表明，相較于線性ITGA1基因的mRNA，circ-ITGA1具有更高的穩(wěn)定性及更長(zhǎng)的半衰期（P＜0.05）。

Fig.2 Characterization of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) as a circular RNA in triplenegative breast cancer (TNBC) cells.A:The schematic diagram indicates the genomic loci of circ-ITGA1 and the designation of divergent and convergent primers.Sanger sequencing conducted following PCR using the indicated divergent flanking primers confirmed the “head-to-tail” splicing of circ-ITGA1.B:RNase R treatment was subjected to PCR with divergent or convergent primers.The relative expression level was detected by realtime fluorescent quantitative PCR.C:RT-PCR with divergent or convergent primers indicated the existence of circ-ITGA1 in cDNA,but not in gDNA (β-Actin was used as a negative control).D:Quantitative real-time fluorescent quantitative indicated the abundance of circ-ITGA1 and the ITGA1 mRNA in TNBC cells after treatment with actinomycin D at the indicated time points.E:The relative expression levels of circ-ITGA1 and ITGA1 in TNBC cells were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR after normalization to random primers and oligo (dT) primers.*P＜0.05,**P＜0.001,vs ITGA1 group (n=3)圖2 TNBC細(xì)胞系中circ-ITGA1環(huán)狀特性的驗(yàn)證

由 于mRNA具 有poly（A）尾 部，而circRNA因其特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)不具備poly（A）尾部，因此最后分別利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的OligodT引物及Random引物對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，隨后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。結(jié)果（圖2E）顯示，circ-ITGA1在Oligo-dT組中表達(dá)水平顯著降低，而ITGA1 mRNA的表達(dá)水平則無(wú)明顯變化（P均＜0.01），表明circ-ITGA1不具備poly（A）尾部結(jié)構(gòu)。

2.3 干擾circ-ITGA1的表達(dá)水平可以抑制TNBC細(xì)胞的增殖能力

為了檢測(cè)circ-ITGA1對(duì)TNBC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究中在TNBC細(xì)胞中轉(zhuǎn)入針對(duì)circ-ITGA1特異性的siRNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖3A）顯示，相較于轉(zhuǎn)入siNC的對(duì)照組細(xì)胞，sicirc-ITGA1-1和sicirc-ITGA1-2組MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中circ-ITGA1的表達(dá)水平均明顯降低（P均＜0.01），驗(yàn)證了siRNA的干擾效率。

Fig.3 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) inhibited proliferation of TNBC cells.A:The knockdown efficiency of circ-ITGA1 siRNAs.B:The proliferation rates of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by MTT assay.C:The proliferations of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells were examined by colony formation assay.D:The proliferation activities of MDA-MB-231 and MDAMB-468 cells were determined by EdU assay (×200).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs SiNC group (n=3).圖3 下調(diào)circ-ITGA1表達(dá)抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的增殖能力

隨后，采用MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)circ-ITGA1表達(dá)對(duì)MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果（圖3B和圖3C）顯示，干擾circ-ITGA1表達(dá)后，MDAMB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的增殖能力均明顯降低（P均＜0.01）。進(jìn)一步利用EDU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果（圖3D）顯示干擾circ-ITGA1表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性均被明顯抑制（P均＜0.05）。

2.4 下調(diào)circ-ITGA1表達(dá)可以抑制TNBC細(xì)胞的侵襲及遷移能力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證circ-ITGA1的生物學(xué)功能，干擾circ-ITGA1表達(dá)后采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞縱向遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，干擾circ-ITGA1表達(dá)后，MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞的縱向遷移能力均被明顯下調(diào)（P均＜0.01）（圖4A）。同樣，細(xì)胞的侵襲能力也受到的抑制（P均＜0.01）（圖4B）。同時(shí)本研究中采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了對(duì)MDA-MB-231和MDAMB-468細(xì)胞橫向遷移能力的影響，結(jié)果（圖4C）顯示干擾circ-ITGA1表達(dá)后，MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的遷移距離均被明顯降低（P均＜0.01）。結(jié)果表明，干擾circ-ITGA1的表達(dá)水平可以抑制TNBC細(xì)胞的侵襲及遷移能力。

Fig.4 Knockdown of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) suppressed migration and invasion of triple-negative breast cancer cells.A:Transwell assay showed the migration abilities of TNBC cells were inhibited (×100).B:The invasion abilities of TNBC cells were suppressed after circ-ITGA1 knockdown (×100).C:Wound healing assay confirmed the migration abilities of TNBC cells were inhibited(×100).**P＜0.01,***P＜0.001 vs siNC group (n=3).圖4 下調(diào)circ-ITGA1表達(dá)抑制TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞的侵襲及遷移能力

Fig.5 Overexpression of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1) promoted the proliferation,migration and invasion of triple-ngative brease cancer TNBC cells.A:The efficiency of circ-ITGA1 overexpression in TNBC cells.MTT (B) and colony formation (C) assay showed the proliferation rates of TNBC cells were increased by circ-ITGA1.D:The proliferative activities of TNBC cells were enhanced with circ-ITGA1 overexpression (×200).The migration (E) and invasion (F) abilities of TNBC cells were promoted after circ-ITGA1 overexpression (×100).G:Wound healing assays confirmed the migration abilities of TNBC cells were increased by circ-ITGA1 (×100).**P＜0.01,***P＜0.001 pbCON group (n=3).圖5 過(guò)表達(dá)circ-ITGA1促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移

2.5 過(guò)表達(dá)circ-ITGA1表達(dá)水平可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力

為了進(jìn)一步驗(yàn)證circ-ITGA1對(duì)TNBC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究再在MDA-MB-231和MDA-MB-468細(xì)胞中使circ-ITGA1過(guò)表達(dá)。（P均＜0.01）（圖5A）。隨后，采用MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后，TNBC的細(xì)胞增殖速率顯著升高（P均＜0.01）（圖5B、C）。同時(shí)，EDU實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后細(xì)胞的增殖活性顯著升高，與之前所述結(jié)果相吻合（P均＜0.01）（圖5D）。進(jìn)一步利用Transwell實(shí)驗(yàn)證明了過(guò)表達(dá)circ-ITGA1后細(xì)胞的侵襲及遷移能力均有顯著的升高（P均＜0.01）（圖5E，F(xiàn)）。同時(shí)劃痕實(shí)驗(yàn)也證明了circ-ITGA1對(duì)細(xì)胞遷移能力的促進(jìn)作用（P均＜0.01）（圖5G）。綜上所述，我們的結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)circ-ITGA1的表達(dá)水平可以促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。

2.6 circITGA1影響TNBC細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移可能的作用機(jī)制

研究表明，circRNA可以吸附微RNA（microRNA，miRNA），而miRNA又能與mRNA結(jié)合從而誘導(dǎo)基因沉默，故circRNA被當(dāng)作一種內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，從而降低miRNA對(duì)于靶mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，促進(jìn)靶mRNA的表達(dá)，形成circRNA-miRNA-mRNA的調(diào)控體系，在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[18]。通過(guò)Circbank[19]和Circinteractome[20]2個(gè)網(wǎng)站來(lái)預(yù)測(cè)可能與circITGA1結(jié)合的miRNAs，二者取交集，共得到5個(gè)可能的靶miRNAs，分別 為has-miR-136-5p、has-miR-338-3p、hasmiR-582-3p、has-miR-589-3p和has-miR-624-5p（圖6A）。接著用Metabric[21]和TCGA[22]數(shù)據(jù)庫(kù)分析這5個(gè)靶miRNAs對(duì)于TNBC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)僅有高表達(dá)has-miR-624-5p組的預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組，與circ-ITGA1的功能相一致（圖6B）。圖6C則展示了circITGA1與hasmiR-624-5p的結(jié)合位點(diǎn)。接著通過(guò)miRNet[23]網(wǎng)站預(yù)測(cè)到了127個(gè)可能與miR-624-5p結(jié)合的靶基因。進(jìn)一步利用Mioncocirc數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)在乳腺癌患者中與circ-ITGA1表達(dá)呈正相關(guān)的基因共3 861個(gè)，對(duì)2組結(jié)果取交集，共得到3個(gè)感興趣的基因，分別為L(zhǎng)MBR1L、MAP3K1和LONRF2（圖6D）。圖6E則展示了這3個(gè)基因與circ-ITGA1表達(dá)的相關(guān)性。為了進(jìn)一步篩選可能的靶基因，本研究中再利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)探究了TNBC患者中miR-624-5p與基因表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果表明，僅有LMBR1L的表達(dá)與miR-624-5p呈負(fù)相關(guān)，符合ceRNA的表達(dá)趨勢(shì)（圖6F）。同時(shí)，利用Metabric和TCGA分析LMRB1L的表達(dá)對(duì)于TNBC患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)LMBR1L與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（圖6G）。由此推測(cè)，circ-ITGA1可能是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合has-miR-624-5p從而降低has-miR-624-5p對(duì)LMBR1L的，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移的功能（圖6H）。

3 討 論

作為世界3大癌癥之一，乳腺癌深深威脅著女性身體健康[24]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)展，對(duì)乳腺癌的研究有了突破性的進(jìn)展，應(yīng)對(duì)各類乳腺疾病的能力不斷提高，乳腺癌的臨床診治能力不斷提高，人們對(duì)乳腺健康的關(guān)注度不斷提高，但乳腺癌發(fā)病率仍增長(zhǎng)迅速，甚至成為發(fā)病率第一的癌癥類型[25]

專家學(xué)者嘗試從各種途徑來(lái)探討乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)以及RNA-seq的飛速發(fā)展，使得用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析成為可能，能直觀反映出circRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA等的表達(dá)水平，這也推進(jìn)了非編碼RNA的研究，使其逐漸成為當(dāng)下研究領(lǐng)域熱門話題。非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括circRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA、miRNA、rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。這些RNA均由基因組轉(zhuǎn)錄得到，大多不翻譯為蛋白質(zhì)，在RNA水平上就能行使各自的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。

Fig.6 MicroRNA (miR)-624/LMBR1L could be the potential target of circular RNAs (circRNAs)-integrin alpha 1 (ITGA1).A:The target miRNAs of circ-ITGA1 were predicted by circBank and Circinteractome database,and 5 miRNAs were filtered out.B:The prognosis of TNBC patients with different miR-624 expression in Metabric and TCGA databases.C:The predicted binding sites of circ-ITGA1 and miR-624.D:The potential target genes of miR-624 were predicted by using miRNet and Mioncocirc databases,and 3 genes were selected.E:The correlation between circ-ITGA1 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.F:The correlation between miR-624 and LMBR1L,MAP3K1 and LONRF2 expression.G:The prognosis of TNBC patients with different LMBR1L expression in Metabric and TCGA databases.H:The potential molecular mechanisms of circ-ITGA1/ miR-624/LMBR1L axis.圖6 miR-624/LMBR1L信號(hào)軸可作為circ-ITGA1的潛在分子靶點(diǎn)。

circRNA是當(dāng)下熱點(diǎn)的研究方向，其是一種特殊的非編碼RNA，它沒(méi)有5’帽子結(jié)構(gòu)和3’ poly（A）尾，為共價(jià)閉合、單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)核酸外切酶不敏感，因此比普通的線性RNA（linear RNA）更穩(wěn)定。研究還發(fā)現(xiàn)，circRNA具有細(xì)胞和組織特異性，廣泛存在于真核生物轉(zhuǎn)錄組中，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，也有部分位于細(xì)胞核中[26]。研究表明，circRNA可以參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[27]。在乳腺癌中，已有報(bào)道如circRNA_0025202可以調(diào)控乳腺癌細(xì)胞對(duì)它莫西芬的耐藥性[28]；Hsa_circ_001783可以通過(guò)吸附miR-200c-3p影響乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[29]等。然而有關(guān)circRNA影響TNBC的具體功能及機(jī)制仍不甚明確，因此本研究中首先采用RNA高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行了測(cè)序分析，通過(guò)差異表達(dá)譜以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)證實(shí)circ-ITGA1在高轉(zhuǎn)移能細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，因此提示circ-ITGA1可能能夠影響TNBC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移能力。為了進(jìn)一步研究circ-ITGA1的相關(guān)功能，構(gòu)建了針對(duì)circ-ITGA1的siRNA，經(jīng)一系列體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)circ-ITGA1之后，細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為受到抑制；隨后構(gòu)建了針對(duì)circ-ITGA1的重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進(jìn)TNBC細(xì)胞，進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)circ-ITGA1促進(jìn)了TNBC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為，進(jìn)一步驗(yàn)證了circ-ITGA1的異常表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。這些結(jié)果表明，circ-ITGA1在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。

基于文獻(xiàn)報(bào)道，circRNA行使其相關(guān)功能的機(jī)制主要是：（1）作為海綿吸附microRNA，抑制miRNA對(duì)mRNA的降解或阻礙其翻譯；（2）誘導(dǎo)血管生成；（3）與RNA結(jié)合蛋白相互作用；（4）促進(jìn)腫瘤免疫逃逸；（5）促進(jìn)腫瘤微環(huán)境形成等多種方式參與乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等[30]。為了進(jìn)一步研究circ-ITGA1發(fā)揮功能的相關(guān)的分子作用機(jī)制，本研究中首先分析了可能與circ-ITGA1結(jié)合的miRNAs，其中miR-624-5p在數(shù)據(jù)庫(kù)中表現(xiàn)為抑癌基因表型，高表達(dá)miR-624-5p的TNBC患者呈現(xiàn)較好的預(yù)后。同時(shí)基于文獻(xiàn)報(bào)道，miR-624-5p在腫瘤中參與了多種促癌相關(guān)非編碼RNAs的分子機(jī)制，如hsa_circ_0091579可以通過(guò)調(diào)控miR-624/H3F3B信號(hào)軸從而促進(jìn)“Warburg效應(yīng)”并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為[31]；長(zhǎng)鏈非編碼RNA LncRNAZFAS1可以通過(guò)調(diào)控miRNA-624/MDK/ERK/JNK/P38信號(hào)軸從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程等[32]。因此，miR-624可作為circ-ITGA1潛在的靶miRNA。同時(shí)，為了進(jìn)一步分析circ-ITGA1/miR-624的分子機(jī)制，我們利用數(shù)據(jù)庫(kù)分別篩選與circ-ITGA1呈表達(dá)正相關(guān)及與miR-624表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的基因，篩選出LMBR1L可能作為下游靶基因。

綜上所述，circRNA circ-ITGA1可以通過(guò)調(diào)控miR-624/LMBR1L信號(hào)軸進(jìn)而調(diào)控TNBC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移進(jìn)程，有望成為TNBC治療的新靶點(diǎn)。