長穗偃麥草EeSKOR啟動(dòng)子的克隆及功能分析

張 勇，田小霞，鄭明利，毛培春，孟 林

(北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，北京 100097)

鉀(K+)在植物生長發(fā)育中起關(guān)鍵作用。植物通過根系從土壤中吸收所需的K+，然后將其分配到不同的器官，以滿足正常的生長發(fā)育[1-6]。植物體內(nèi)K+的遠(yuǎn)距離分布和動(dòng)態(tài)平衡主要由位于質(zhì)膜上的各種K+通道介導(dǎo)。根據(jù)這些通道蛋白的序列、結(jié)構(gòu)和功能可分為4類，即Shaker、TPK、Kir-like和GNGC鉀通道[2, 5-7]，其中，Shaker 型K+通道的研究最為透徹。Shaker型K+通道對(duì)底物K+的親和常數(shù)約為幾十毫摩爾，是典型的低親和高通量K+通道，對(duì)植物K+營養(yǎng)效率起重要作用[2-4, 6]。根據(jù)電壓依賴性和K+在跨膜過程中運(yùn)動(dòng)方向的不同，Shaker型K+通道可分為3種類型，即包括內(nèi)向整流通道、外向整流通道和弱整通道(雙向整流通道)。SKOR是典型的外向整流K+通道[7-8]，該通道負(fù)責(zé)K+通過根部木質(zhì)部的長距離運(yùn)輸。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，SKOR通道生理功能的分子機(jī)制研究更為詳細(xì)，即AtSKOR主要位于根的中柱軸薄壁細(xì)胞中，負(fù)責(zé)將K+釋放到木質(zhì)部汁液中，從而通過植物蒸騰作用轉(zhuǎn)移至地上部分，實(shí)現(xiàn)K+離子遠(yuǎn)距離運(yùn)輸；同時(shí)發(fā)現(xiàn)AtSKOR通道功能的缺失會(huì)使地上部K+含量降低50%左右，影響植物生長發(fā)育。近年來，SKOR在水稻(Oryzasativa)[8]、甜瓜(Cucumismelo)[9]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[10]和霸王(Zygophyllumxanthoxylum)[11]中得到了廣泛的研究，進(jìn)一步證實(shí)了SKOR基因在維持植物體內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，特別是植物在缺鉀、干旱和鹽脅迫條件下均能誘導(dǎo)SKOR基因表達(dá)。

啟動(dòng)子位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，為不同的轉(zhuǎn)錄因子提供不同的結(jié)合位點(diǎn)，這進(jìn)一步促成RNA聚合酶進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄[12-13]。不同的啟動(dòng)子元件用于結(jié)合激活物或阻遏物，從而充當(dāng)順式調(diào)節(jié)元件[14]。啟動(dòng)子作為控制基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，已成為研究基因功能的新方向。通過分析啟動(dòng)子順式作用元件，可預(yù)測(cè)該基因可能具備的功能。

長穗偃麥草(Elytrigiaelongata)具有很強(qiáng)的抗旱耐鹽性，是小麥的近緣種，已成為改良小麥重要的野生基因庫[15]，同時(shí)也是改良鹽堿土壤的理想草本植物之一。先前的研究中我們通過cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法獲得了長穗偃麥草SKOR基因，鹽脅迫能誘導(dǎo)EeSKOR轉(zhuǎn)錄，表明EeSKOR在維持植物K+的穩(wěn)態(tài)、改善植物的耐鹽性方面起著重要作用[16]。然而SKOR基因是否在長穗偃麥草生長發(fā)育中發(fā)揮其他的功能尚未知曉。本研究利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Tail-PCR)的方法克隆了長穗偃麥草EeSKOR啟動(dòng)子序列，分析該啟動(dòng)子干旱誘導(dǎo)(PEG)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)等響應(yīng)元件，分析不同脅迫處理下長穗偃麥草EeSKOR的表達(dá)模式，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究EeSKOR功能提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用擬南芥野生型Columbia-0(Col-0)購自ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center) 生物公司，長穗偃麥草(PI 531747)種子由美國國家植物種質(zhì)資源庫(The U. S. National Plant Germplasm System, NPGS)提供，并參照周妍彤等[17]描述的組織培養(yǎng)方法獲得長穗偃麥草組培苗，生根后的組培苗置于光照16 h/8 h(白天/黑夜)、26 ℃的人工氣候室培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1EeSKOR啟動(dòng)子的克隆以長穗偃麥草基因組DNA為模板，根據(jù)已獲得的EeSKOR基因cDNA序列，設(shè)計(jì)下游特異性套嵌引物EeSKORsp1、EeSKORsp2、EeSKORsp3(表1)；使用染色體步移試劑盒(TaKaRa)，按孫君[18]所用的程序進(jìn)行巢式PCR。第3輪PCR獲得單一條帶，PCR產(chǎn)物膠回收后連入PMD20-T載體，繼而轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定，選擇陽性菌液送至北京博睿興科生物公司測(cè)序。

1.2.2EeSKOR啟動(dòng)子順式作用元件分析及表達(dá)載體構(gòu)建測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接、比對(duì)，獲得正確的EeSKOR啟動(dòng)子序列，利用啟動(dòng)子在線分析軟件PlantCARE和PLACE對(duì)啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行對(duì)比分析。并根據(jù)已知的啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)酶切引物(表1)進(jìn)行PCR，分別使用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶消化植物表達(dá)載體pBI121-GUS和PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化回收后構(gòu)建EeSKOR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的植物表達(dá)載體，重組植物表達(dá)載體pEeSKOR∷GUS繼而轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3301。

表1 本研究所用的引物序列及用途

1.2.3 農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥及GUS染色將含有pEeSKOR∷GUS的農(nóng)桿菌接種至添加有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，于28 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600值0.8，參照郭勇等[19]擬南芥瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。

GUS染色液的制備：200 mmol/L的磷酸緩沖液50 mL(pH 7.0)，5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]溶液10 mL，5 mmol/L的K4[Fe(CN)6] 溶液10 mL，100 mmol/L的Na2EDTA溶液10 mL，0.1 mL Triton-100，加入60 mg X-GLUC用蒸餾水定容至100 mL。將浸染后的擬南芥轉(zhuǎn)移至GUS染色液，37 ℃避光培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)完畢，棄染色液，用95%酒精脫色，觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)長穗偃麥草EeSKOR基因表達(dá)分別用10%聚乙二醇(PEG)、100 mmol/L氯化鈉(NaCl)、0.1 mmol/L脫落酸(ABA)和0.5 mmol/L水楊酸(SA)處理長穗偃麥草組培苗，分別取不同處理時(shí)間(0、12、24和72 h)長穗偃麥草的根，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以長穗偃麥草Actin為內(nèi)參基因，使用qEeSKOR定量引物按照王琳等[20]描述的qPCR反應(yīng)程序檢測(cè)EeSKOR基因的表達(dá)量，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EeSKOR啟動(dòng)子克隆

通過3輪熱不對(duì)稱PCR分析，獲得約1 000 bp單一條帶(圖1，A)。該電泳條帶經(jīng)膠回收，連入克隆載體。菌液PCR結(jié)果表明，該條帶已成功連接至T載體(圖1，B)。測(cè)序結(jié)果與EeSKOR基因cDNA序列比對(duì)，我們獲得了EeSKOR基因起始密碼子上游798 bp啟動(dòng)子序列，命名為pEeSKOR。經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對(duì)分析顯示，pEeSKOR序列與中國春小麥(Triticumaestivum)、預(yù)測(cè)的節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)和預(yù)測(cè)的野生二粒麥(Triticumdicoccoides)基因存在部分高度相似序列。

2.2 啟動(dòng)子作用元件分析

將pEeSKOR上傳至PLACE和PlantCARE網(wǎng)站對(duì)啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析(圖2和表2)。該啟動(dòng)子含有特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(MYB、MYC和BoxⅢ等)、植物激素響應(yīng)元件(ABRE和TGA-element)、光響應(yīng)元件(GAG-motif、CATT-motif和LAMP-element等)、組織特異的啟動(dòng)元件(CAT-box、RY-element和CCGTCC-box)、脅迫響應(yīng)順式元件(MBS、ARE和W box等)和核心啟動(dòng)元件(TATA box和CAAT box)。

A. EeSKOR 啟動(dòng)子擴(kuò)增：1—3分別代表1—3輪PCR產(chǎn)物；B. EeSKOR 啟動(dòng)子克隆載體PCR鑒定：1—6代表不同的樣品；—代表陰性對(duì)照?qǐng)D1 EeSKOR啟動(dòng)子克隆 A. Amplified EeSKOR promoter：1-3 represents 1-3 rounds of PCR products respectively；B. PCR identification of EeKSOR promoter cloning vector：1-6 represent different samples；— represents negative controlFig.1 Cloning of EeSKOR promoter

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)G標(biāo)記為“+1”, 上游位置為負(fù)；黑體代表起始密碼子圖2 EeSKOR啟動(dòng)子序列及調(diào)控元件The nucleotide at position “+1” is the transcription start site, the upstream of which are negative position; Bold represents the start codonFig.2 Sequence and regulatory elements of EeSKOR promoter

2.3 啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

采用雙酶切的方法，將pEeSKOR構(gòu)建到pBI121-GUS植物表達(dá)載體(圖3，A)，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證結(jié)果表明pEeSKOR已成功整合到植物表達(dá)載體中(圖3，B-C)，構(gòu)建好的pEeSKOR植物表達(dá)載體命名為pEeSKOR∷GUS。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，pEeSKOR驅(qū)動(dòng)GUS基因在擬南芥中的表達(dá)如圖4所示，在擬南芥幼苗期的葉、葉柄和根中呈藍(lán)色(圖4，A)，同樣在擬南芥生殖生長期的葉、葉柄和根觀測(cè)到GUS活性(圖4，B-E)，但并未在花中觀測(cè)到GUS活性(圖4，F(xiàn))。

2.4 不同脅迫處理下長穗偃麥草根中EeSKOR表達(dá)分析

啟動(dòng)子元件顯示pEeSKOR含有干旱誘導(dǎo)、ABA和SA響應(yīng)元件，利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PEG、NaCl、ABA和SA處理下EeSKOR在長穗偃麥草組培苗根中的表達(dá)量。如圖5所示， NaCl處理下EeSKOR的表達(dá)量在12 h處下調(diào)為正常表達(dá)水平的54%，之后恢復(fù)至正常表達(dá)水平且呈上調(diào)趨勢(shì)；PEG處理下EeSKOR基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，處理的12 h并未與正常表達(dá)水平產(chǎn)生差異，處理24 h和72 h分別上調(diào)為正常表達(dá)水平的2.1倍和5.9倍；ABA處理下EeSKOR的表達(dá)量低于正常表達(dá)水平，且隨著處理時(shí)間增加顯著下調(diào)；SA處理導(dǎo)致EeSKOR表現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)趨勢(shì)，其在12 h上調(diào)至正常表達(dá)水平的2倍，在24 h較正常水平稍有上調(diào)(1.4倍)，而在72 h顯著下調(diào)至正常表達(dá)水平的44%。

3 討 論

長穗偃麥草是小麥族禾本科偃麥草屬多年生根莖疏叢型草本植物，具有較強(qiáng)的抗旱耐鹽性，是改良鹽堿地的理想草本植物之一，因此深入了解其耐鹽生理機(jī)制尤為重要。外整流鉀通道蛋白基因SKOR在增強(qiáng)植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要作用，充分揭示SKOR基因的功能，將有針對(duì)性地通過基因工程方法對(duì)物種進(jìn)行遺傳改良；而啟動(dòng)子是調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)開關(guān)，分析啟動(dòng)子順式作用元件，可以推測(cè)基因潛在的功能。本研究通過Tail-PCR技術(shù)獲得長穗偃麥草EeSKOR起始密碼子前798 bp啟動(dòng)子片段，啟動(dòng)子元件分析結(jié)果顯示，該啟動(dòng)子含有多種順式作用元件。如組織特異的啟動(dòng)元件RY-element和CAT-box、干旱誘導(dǎo)元件MBS、脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element等；而啟動(dòng)子區(qū)的ABA響應(yīng)元件和SA響應(yīng)元件與基因參與的逆境脅迫和相應(yīng)激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)[21-24]，表明EeSKOR基因的表達(dá)可能受到干旱、脫落酸和水楊酸的誘導(dǎo)。此外，EeSKOR啟動(dòng)子還含光響應(yīng)元件、厭氧反應(yīng)元件、傷害與病原反應(yīng)元件，表明EeSKOR可能在長穗偃麥草光響應(yīng)和防御機(jī)制中起作用。

表2 EeSKOR啟動(dòng)子中的順式作用元件及相關(guān)功能預(yù)測(cè)

A. 表達(dá)載體示意圖；B. 表達(dá)載體菌落PCR；C. 表達(dá)載體酶切鑒定圖3 EeSKOR啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建及酶切驗(yàn)證A. Schematic diagram of expression vector; B. Expression vector colony PCR; C. Expression vector restriction digestion identificationFig.3 Construction of EeSKOR promoter expression vector and restriction enzyme digestion verification

A. 幼苗期植株；B. 生殖生長期植株；C.葉片；D.葉柄；E.根；F.花序圖4 pEeSKOR∷GUS擬南芥的組織化學(xué)GUS測(cè)定A. Juvenile plants; B. Reproductive growth plants; C. Leaves; D. Petioles; E. Root; F. InflorescenceFig.4 Histochemical GUS determination of pEeSKOR∷GUS Arabidopsis thaliana

*和**分別表示處理后與未處理(0 h)間在0.05和0.01水平的差異顯著性圖5 不同脅迫處理下長穗偃麥草根中EeSKOR表達(dá)分析* and ** indicate the significance of the difference between the treated and untreated (0 h) at the levels of 0.05 and 0.01, respectivelyFig.5 Expression analysis of EeSKOR in the roots of Elytrigia elongata under different stress treatments

為了鑒定獲得的啟動(dòng)子是否具備啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)驗(yàn)證EeSKOR啟動(dòng)子在長穗偃麥草不同組織的表達(dá)模式。我們構(gòu)建了長穗偃麥草EeSKOR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)浸染擬南芥組織，結(jié)果顯示在幼苗和生殖生長時(shí)期，擬南芥的根、葉和葉柄均被染成藍(lán)色，且幼苗生長期的擬南芥染色程度較生殖生長期更深，表明EeSKOR可能在長穗偃麥草根、葉和葉鞘的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，尤其是幼苗期。

SKOR是負(fù)責(zé)植物中K+長距離運(yùn)輸?shù)囊活愔匾耐ǖ赖鞍祝诰S持植物細(xì)胞K+的穩(wěn)態(tài)和抗逆性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[25]。SKOR的轉(zhuǎn)錄水平極易受到各種脅迫的影響，300 mmol/L NaCl條件下，甜菜(Betavulgaris)和甜瓜根中的SKOR表達(dá)量在12、24和72 h顯著增加[9, 26]， NaCl或滲透脅迫下霸王ZxSKOR在其根和莖中的轉(zhuǎn)錄水平為正常生長條件下的2.0～2.8倍[11]。基于啟動(dòng)子元件分析的結(jié)果，我們檢測(cè)了NaCl、PEG、ABA和SA誘導(dǎo)下，長穗偃麥草根中EeSKOR的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，NaCl處理下，EeSKOR的表達(dá)量在12 h處顯著下調(diào)后繼而恢復(fù)至正常表達(dá)水平且呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，這與已報(bào)道的結(jié)果[9, 11, 25]略有差異，表明鹽處理下SKOR基因在不同物種中表達(dá)模式存在差異；PEG處理下，長穗偃麥草EeSKOR基因的表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的延長顯著上調(diào)，表明EeSKOR基因在表達(dá)模式上與其他物種SKOR具備相似的功能。高玉龍等[27]認(rèn)為煙草NtSKOR1受植物激素的調(diào)控，在擬南芥[7]和灰楸樹(Catalpafargesii)[28]中SKOR的表達(dá)受到ABA的強(qiáng)烈抑制，我們?cè)陂L穗偃麥草EeSKOR啟動(dòng)子元件中發(fā)現(xiàn)了響應(yīng)ABA的順式作用元件，在ABA處理下EeSKOR的表達(dá)量低于正常表達(dá)水平，且隨著處理時(shí)間增加顯著下調(diào)，證實(shí)了外源ABA可抑制EeSKOR表達(dá)。目前對(duì)SKOR基因的研究主要集中在干旱和鹽脅迫方面鮮有報(bào)道SKOR與水楊酸之間的關(guān)系，本研究中發(fā)現(xiàn)EeSKOR啟動(dòng)子含有水楊酸響應(yīng)元件，表明EeSKOR可能受到水楊酸的誘導(dǎo)，而水楊酸處理12 h和24 h后EeSKOR在長穗偃麥草根中的表達(dá)量顯著高于正常表達(dá)水平，而處理72 h的表達(dá)量顯著低于正常表達(dá)水平，呈先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，證實(shí)了EeSKOR在長穗偃麥草響應(yīng)水楊酸的過程中發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)是對(duì)SKOR功能特性的重要補(bǔ)充，可作為探討EeSKOR基因功能的重點(diǎn)方向加以深入研究。