杧果GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的鑒定及表達(dá)分析

孫瑞青，楊 楠，劉志鑫，夏煜琪，孫 宇，高慶遠(yuǎn)，蒲金基，黨志國(guó)，張 賀，2b

（1.海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.環(huán)境與植物保護(hù)研究所；b.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.熱帶生物技術(shù)研究所；d.熱帶作物品種資源研究所，海南 海口 571101）

植物表皮毛（trichome）是大多數(shù)陸地植物表皮組織特有的一種結(jié)構(gòu)，其種類多樣[1]，通?？煞窒傩悦珷铙w和非腺性毛狀體兩種類型[2]。表皮毛能在一定程度上增加植物表皮的厚度，減輕昆蟲、病原體對(duì)植物造成的損傷，防止熱量、水分的散失，從而起到保護(hù)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的作用[3-4]，但是，不同植物表皮毛在不同環(huán)境中發(fā)揮的作用有所不同[5-6]。左香君等[7]發(fā)現(xiàn)，野生甘藍(lán)Brassica incana的表皮毛在一定程度上對(duì)蚜蟲具有抗性；宋?；踇8]認(rèn)為，毛狀體豐富的番茄Lycopersicon esculentum更加耐冷、抗旱，這說明植物表皮毛對(duì)生物及非生物均有抵御作用。

在擬南芥Arabidopsis thaliana中，無表皮毛增強(qiáng)子（Glabrous-enbancer binding protein, GeBP）可通過調(diào)控GLABROUS1（GL1）基因的表達(dá)來控制表皮毛的發(fā)生[9-10]。GeBP是一種核蛋白，其與黃色熒光蛋白（YFP）的共定位結(jié)果表明，該基因的表達(dá)僅限于3～5個(gè)亞核中，有一個(gè)中央結(jié)合的DNA結(jié)構(gòu)域[11]，C端區(qū)的主要特征是存在一種假定的亮氨酸拉鏈，表明GeBP中心區(qū)域可能形成同二聚體[12]。隨后，GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族在黃瓜Cucumis sativus[13]、水稻Oryza sativa[14]、毛竹Phyllostachys edulis[15]等種植物中均被發(fā)現(xiàn)，其均參與了植物表皮毛的形成。單雪萌等[15]對(duì)毛竹P.edulis的GeBP進(jìn)行了qRT-PCR分析，結(jié)果表明，在16個(gè)GeBP家族成員中，有12個(gè)在帶有表皮毛的葉、籜、籜片和纖毛中的表達(dá)量均高于其在沒有表皮毛的筍中的表達(dá)量；擬南芥A.thaliana的AtGeBP/GPL基因在某些特定的組織中表達(dá)，對(duì)細(xì)胞分裂素信號(hào)作出響應(yīng)[16]，調(diào)控AtCPR5信號(hào)途徑中的反應(yīng)和細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因的表達(dá)[11]，但二者對(duì)細(xì)胞的增大存在著拮抗作用[17]。為給杧果種質(zhì)資源的抗病性鑒定提供參考依據(jù)，鑒于植物表皮毛在其防御病害過程中的作用，對(duì)與杧果Mangifera indica表皮毛形成相關(guān)的GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族的功能展開研究，對(duì)其MiGeBPs基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR方法對(duì)MiGeBPs在杧果組織中及其在杧果受杧果膠孢炭疽菌和細(xì)菌性黑斑病菌侵染時(shí)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，以期為杧果GeBP家族作用與功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 杧果病害的脅迫處理及組織取樣

從位于海南省儋州市寶島新村的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州杧果種質(zhì)資源圃（東經(jīng)109.49°，北緯19.50°）中選取供試的杧果嫁接苗，選取‘貴妃杧’為供試的杧果品種，其砧木品種為‘海南土杧’。將樹齡為1 a、葉齡為7 d、株高一致的杧果嫁接苗置于室溫為25 ℃、相對(duì)濕度為70%～90%、光照12 h/黑暗12 h（即在室內(nèi)黑暗與光照各12 h）的條件下以促進(jìn)杧果嫁接苗的生長(zhǎng)發(fā)育。

對(duì)杧果嫁接苗分別進(jìn)行膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides（以下縮寫為“Cg”）和細(xì)菌性黑斑病菌Xanthomonas campestrispv.mangiferaeindicae（以下縮寫“Xcm”）兩種病害的接種處理。分別用含量為1 mL的2×106個(gè)分生孢子的膠孢炭疽菌分生孢子懸浮液、含量為2×107CFU的細(xì)菌性黑斑病菌懸浮液對(duì)杧果嫁接苗葉片進(jìn)行均勻的噴霧侵染處理，處理時(shí)間分別設(shè)為0、3、6、12、24、48、72 h，其中的0 h處理組為對(duì)照組。每個(gè)處理組各取3株杧果嫁接苗的葉片樣品，剪碎后置于液氮中快速冷凍并保存于-80 ℃的溫度條件下以備用。

從位于海南省東方市的島西林場(chǎng)（東經(jīng)108.67°，北緯19.11°）選擇研究所需的‘貴妃杧’成年果樹，砧木為‘海南土杧’，將嫁接后新梢上抽出新葉的時(shí)間記為0 d，取其幼葉（7 d，即葉片的形態(tài)初形成）、老葉（35 d，即葉子已完全老化、革質(zhì)化，用作對(duì)照）、芽、盛花、幼果（7 d）、中果（21 d）、大果（35 d）和成熟果作為供試材料。將所采集的試材置于液氮中快速冷凍并保存于-80 ℃的溫度條件下，以備于杧果GeBP基因家族的組織特異性相對(duì)表達(dá)量分析之用。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

按照天根生化科技有限公司RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的說明方法對(duì)杧果葉片進(jìn)行總RNA的提取，通過超微量紫外分光光度計(jì)（Nanodrop 2000C型）對(duì)總RNA的濃度進(jìn)行測(cè)定，并保存于-80 ℃的溫度條件下以備用[18]。第一鏈cDNA由RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄而成。

1.3 杧果全基因組數(shù)據(jù)的來源

杧果全基因組數(shù)據(jù)來源于NCBI（PRJNA487154）數(shù)據(jù)庫(kù)，擬南芥A.thaliana、番茄L.esculentum、水稻O.sativa這3個(gè)物種的GeBP序列均下載自PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 杧果GeBP基因家族成員的鑒定

AtGeBPs氨基酸序列從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)和PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，以此作為查詢對(duì)象，使用Blastp在線程序在杧果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較，將E值調(diào)整為10-5。利用Pfam（http://pfam.xfam.org/）在線工具獲取杧果蛋白序列結(jié)構(gòu)域，最終獲得所有杧果GeBP基因家族成員[19]。其他物種的GeBP基因家族成員直接下載于PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.5 杧果GeBP基因家族的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy - ProtParam tool在線工具對(duì)杧果GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員的內(nèi)含子、分子量、理論等電點(diǎn)、基因長(zhǎng)度等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)[20]，利 用SOPMA（https://www.expasy.org/）、NCBI Conserved Domain Search、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）等在線工具對(duì)其蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、基因的保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用MEME在線工具（http://meme-suite.org/tools/meme）[21-22]分析杧果基因家族的蛋白質(zhì)保守基序。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用ClustalW程序，將存在于杧果和其他3個(gè)物種的GeBP基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比。采用MEGA 7.0軟件，使用鄰近法，以獲得的GeBP蛋白序列構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，將校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap值調(diào)整為1 000次重復(fù)[23-24]。

1.7 熒光定量PCR分析

采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)PCR特異擴(kuò)增引物[25-26]，構(gòu)建18 μL的反應(yīng)體系，每個(gè)處理各設(shè)3次重復(fù)，使用UltraSYBR Mixture 試劑盒（北京康為世紀(jì)），利用Quant Studio 6 Flex軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。采用的qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0 min、95 ℃預(yù)變性，15 s、95 ℃變性，1 min、60 ℃退火/延伸，45個(gè)循環(huán)；在60 ℃時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)的收集[19]。根據(jù)MiGeBPs的CDS序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)所用的引物，以杧果MiActin1（Actin）作為內(nèi)參基因[27]，引物序列見表1。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀軟件（Quant StudioTM 6 Flex）分析獲得各個(gè)樣品的Ct值，以0 h的表達(dá)量作為對(duì)照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以確定MiGeBPs的相對(duì)表達(dá)量[28]，并在此基礎(chǔ)上使用HeatMap 2.0軟件繪制MiGeBPs相對(duì)表達(dá)量的熱圖。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)所用引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 杧果GeBP基因家族成員的鑒定結(jié)果

對(duì)杧果GeBP基因家族成員理化性質(zhì)的分析結(jié)果見表2。表2顯示，10個(gè)基因家族成員其理化性質(zhì)的差異明顯。10個(gè)基因家族成員的氨基酸個(gè)數(shù)差異較大；MiGeBP3的氨基酸數(shù)最多，達(dá)到527個(gè)；MiGeBP8的氨基酸數(shù)最少，僅有156個(gè)。其內(nèi)含子數(shù)量，僅有MiGeBP3的為2個(gè)，其余9個(gè)基因的內(nèi)含子數(shù)均為1個(gè)。10個(gè)基因家族成員的蛋白質(zhì)分子量為18 020.02～58 488.64 Da，最大的約為最小的3倍。MiGeBP1、MiGeBP3、MiGeBP4、MiGeBP5、MiGeBP6、MiGeBP7的 等電點(diǎn)PI值均小于7，說明這6個(gè)蛋白均屬于酸性；而MiGeBP2、MiGeBP8、MiGeBP9和MiGeBP10的等電點(diǎn)PI值均大于7，說明這4個(gè)蛋白均屬堿性。其親水性平均系數(shù)均為負(fù)值。其脂溶性系數(shù)范圍為54.94～82.50。10個(gè)基因家族成員的不穩(wěn)定指數(shù)為34.53～68.76；其中，MiGeBP6的不穩(wěn)定指數(shù)最大，為68.76；MiGeBP2的不穩(wěn)定指數(shù)最小，為34.53。由此可推測(cè)，MiGeBP基因家族成員均為不穩(wěn)定的親水蛋白。

表2 杧果GeBP基因家族成員基本理化性質(zhì)的分析結(jié)果Table 2 Physical and chemical property of GeBP in M.indica

2.2 杧果GeBP基因家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果

利用SPOMA在線工具預(yù)測(cè)到的10個(gè)MiGeBPs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示。其中，無規(guī)則卷曲和α-螺旋均為MiGeBPs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件，此二者的占比之和均大于85%；但是，在MiGeBP2和MiGeBP6蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則曲和α-螺旋的占比相差較大。延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角在MiGeBPs蛋白結(jié)構(gòu)中的占比均小于15%；其中，延伸鏈的占比，MiGeBP5、MiGeBP7、MiGeBP10的均僅在5%以下；β-轉(zhuǎn)角，該基因家族各個(gè)基因的占比均很小，其在MiGeBP4與MiGeBP5中的占比僅分別為1.88%和1.57%

圖1 MiGeBPs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的在線預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 On line prediction results of MiGeBPs secondary structure

2.3 杧果GeBP基因家族保守結(jié)構(gòu)域與三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果

利用NCBI在線軟件分析得到的MiGeBPs保守結(jié)構(gòu)域如圖2a所示。從圖2a中可以看出，MiGeBPs基因家族的各個(gè)成員都有保守結(jié)構(gòu)域DFU573（domain of unknown function 573）基序，其保守結(jié)構(gòu)域位置見表1，其氨基酸數(shù)為66～96個(gè)，MiGeBP1、MiGeBP2、MiGeBP3、MiGeBP4、MiGeBP5、MiGeBP6、MiGeBP7、MiGeBP8、MiGeBP9、MiGeBP10蛋白中所含有的氨基酸數(shù)分別為70、71、96、91、96、69、89、90、92、66個(gè)。這些數(shù)據(jù)清晰地顯示出，MiGeBPs中10個(gè)基因家族成員其保守結(jié)構(gòu)域的位置存在差異；另外，MiGeBP3蛋白質(zhì)中還有含F(xiàn)e（SCys）4中心的非血紅素鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)MiGeBPs基因家族成員的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2b所示。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MiGeBP6、MiGeBP7、 MiGeBP8、MiGeBP9、MiGeBP10蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的相似性極高，且無規(guī)則卷曲和α-螺旋均為10個(gè)基因家族成員結(jié)構(gòu)的主要組成部分，這一預(yù)測(cè)結(jié)果與該基因家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果（圖1）一致。

圖2 MiGeBPs保守結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 MiGeBPs conserved domain and tertiary structure

2.4 杧果GeBP基因家族10個(gè)成員的保守基序分析

利用MEME Suite（Suithttps://meme-suite.org/meme/）在線網(wǎng)站對(duì)杧果GeBP的10個(gè)基因家族成員的序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。圖3表明，MiGeBPs基因家族成員包含1～5個(gè)基序，均含有基序4，其中，基序5的序列最長(zhǎng)（48個(gè)）且最為保守，但僅有MiGeBP2、MiGeBP8和MiGeBP9成員中含有基序5；MiGeBP3、MiGeBP4、MiGeBP5、MiGeBP6、MiGeBP9和MiGeBP10蛋白中均包含了4個(gè)基序，其自N端向C端的排列順序依次是基序1、基序2、基序4、基序3。

圖3 MiGeBPs蛋白質(zhì)保守基序Fig.3 Conserved motifs of MiGeBPs proteins

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果

利用ClustalW程序和MEGA 7.0在線軟件構(gòu)建了包含杧果（10個(gè)）、擬南芥（23個(gè)）、番茄（11個(gè)）、水稻（13個(gè)）的GeBP基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4所示。圖4表明，4個(gè)物種的57個(gè)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以分為5個(gè)分支（ClassⅠ～Ⅴ），其中的MiGeBPs分 布 在4個(gè)分支中。MiGeBP2、MiGeBP7、MiGeBP8和MiGeBP9均分布在Class Ⅰ分支中，但MiGeBP2、MiGeBP8和MiGeBP9與 番茄的Solyc05g051330.1.1聚為1個(gè)小的分支，而MiGeBP7與擬南芥的2個(gè)成員（AT5G41765.1、AT4G00232.1）聚為1個(gè)小的分支；MiGeBP5、MiGeBP6均分布在Class Ⅱ分支中；MiGeBP1、MiGeBP10均分布在Class Ⅲ分支中；MiGeBP3和MiGeBP4均分布在Class Ⅳ分支中，且聚為1個(gè)小的分支；Class Ⅴ分支中聚集了擬南芥中的AT4G00390.1和水稻中除LOC Os01g14720.1之外的12個(gè)水稻GeBP基因家族成員。綜合分析可知，杧果GeBP基因家族成員全部分布在以雙子葉為主的Class Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分支中，沒有家族成員分布在以單子葉水稻為主的Class Ⅴ分支中。

圖4 杧果GeBP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed from GeBP proteins

2.6 病原菌侵染時(shí)MiGeBP基因家族的表達(dá)分析

利用Quant Studio 6 Flex軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的溶解曲線檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。從圖5a—b中可以看出，供試的10個(gè)MiGeBP基因家族成員的qRT-PCR引物的溶解曲線均具有單一的峰值，說明引物具有特異性，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析中。采用瓊脂糖凝膠電泳（2%）檢測(cè)[29]實(shí)時(shí)熒光定量PCR的產(chǎn)物，結(jié)果（圖5c）顯示，目的基因擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期的結(jié)果一致，這進(jìn)一步說明所設(shè)計(jì)的引物具有特異性，并可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析中。

圖5 杧果GeBP基因的溶解曲線及瓊脂凝膠電泳圖Fig.5 GeBP gene dissolution curve and AGAR gel electrophoresis of M.indica

2.7 MiGeBP基因家族在杧果各組織中的特異性表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法分析獲得相應(yīng)的Ct值，采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以老葉（35 d）的相對(duì)表達(dá)量作為對(duì)照（記為1），將相對(duì)表達(dá)量高于1.5的定義為顯著上調(diào)表達(dá)，將相對(duì)表達(dá)量小于0.5的定義為顯著下調(diào)表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6所示。圖6表明，在供試的8個(gè)組織中，MiGeBP9、MiGeBP10基因在4個(gè)組織中均顯著上調(diào)表達(dá)，MiGeBP9基因在芽、盛花、大果（35 d）和成熟果中均顯著上調(diào)表達(dá)，MiGeBP10基因在幼葉（7 d）、盛花、大果（35 d）和成熟果中均顯著上調(diào)表達(dá)；MiGeBP2、MiGeBP3、MiGeBP7和MiGeBP10基因在4個(gè)組織器官中均有顯著表達(dá)。

圖6 杧果GeBP基因家族在不同組織相對(duì)表達(dá)量熱圖Fig.6 Heatmap of relative expression of M.indica GeBP family in different tissues

在杧果各組織中進(jìn)行特異表達(dá)的10個(gè)GeBP基因家族成員中，MiGeBP1基因在幼葉和盛花中均上調(diào)表達(dá)，且在幼葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，其在中果（21 d）、大果（35 d）、成熟果中的表達(dá)量均顯著下調(diào)；MiGeBP2、MiGeBP3和MiGeBP7基因在各組織中均顯著表達(dá)，但此3個(gè)基因都僅在幼葉（7 d）和盛花中顯著上調(diào)表達(dá)，而在芽、幼果（7 d）、中果（21 d）、大果（35 d）及成熟果中的表達(dá)均顯著下調(diào)；MiGeBP4基因在芽、盛花、幼果（7 d）和成熟果中的表達(dá)均顯著下調(diào)；MiGeBP5基因僅在幼葉中上調(diào)表達(dá)，且其相對(duì)表達(dá)量最高，而在幼果中的相對(duì)表達(dá)量最低；MiGeBP6基因在幼果（7 d）、中果（21 d）、大果（35 d）中的表達(dá)均顯著下調(diào)，大果（35 d）中的相對(duì)表達(dá)量最低，在幼葉（7 d）、芽及成熟果中上調(diào)表達(dá)，其在幼葉中的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；MiGeBP8基因在除芽以外的其他組織中均顯著表達(dá)，其在幼葉（7 d）、盛花和成熟果中均顯著上調(diào)表達(dá)，而在幼果（7 d）、中果（21 d）和大果（35 d）中均顯著下調(diào)表達(dá)；MiGeBP9基因在芽、盛花及大果（35 d）、成熟果中均顯著上調(diào)表達(dá)，而在幼果（7 d）、中果（21 d）中均顯著下調(diào)表達(dá)；MiGeBP10基因在各組織中均顯著表達(dá)，而在芽、幼果（7 d）和中果（21 d）中均顯著下調(diào)表達(dá)，但在其他組織中均上調(diào)表達(dá)，其在成熟果中的相對(duì)表達(dá)量最高，而在中果（21 d）中的相對(duì)表達(dá)量最低。綜上所述，MiGeBP基因家族成員在杧果不同組織中的表達(dá)存在特異性。

2.8 病原菌侵染時(shí)MiGeBP基因家族的表達(dá)分析

利用qRT-PCR方法獲得相應(yīng)的Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以MiGeBP基因家族成員經(jīng)細(xì)菌性黑斑病菌或膠包炭疽菌侵染0 h時(shí)的表達(dá)量作為對(duì)照（記為1），將表達(dá)量高于1.5的定義為顯著上調(diào)表達(dá)，將表達(dá)量小于0.5的定義為顯著下調(diào)表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖7所示。圖7a表明，經(jīng)細(xì)菌性黑斑病菌侵染后，在2個(gè)及2個(gè)以上檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)的基因分別有MiGeBP2、MiGeBP4、MiGeBP9和MiGeBP10，在2個(gè)及2個(gè)以上檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)表達(dá)的基因分別有MiGeBP1、MiGeBP 7、MiGeBP8、MiGeBP10；在侵染處理后6 h時(shí)各個(gè)基因都有顯著性的表達(dá)，其中，MiGeBP1、MiGeBP3、MiGeBP4、MiGeBP5基 因均下調(diào)表達(dá)，其他基因均上調(diào)表達(dá)。MiGeBP8基因在侵染處理后的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著表達(dá)，但僅在侵染處理后6 h時(shí)是上調(diào)表達(dá)的，而在其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)表達(dá)；MiGeBP9基因同樣在侵染處理后的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)都是顯著表達(dá)的，其在侵染處理后24 h時(shí)內(nèi)一直下調(diào)表達(dá)，而在其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)。

圖7b表明，經(jīng)膠孢炭疽菌侵染后，MiGeBP5、MiGeBP6基因在0～72 h內(nèi)的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)表達(dá)，分別在侵染處理后24、12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高；另外，在3個(gè)及3個(gè)以上檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)表達(dá)的基因分別有MiGeBP1、MiGeBP2、MiGeBP3、MiGeBP10，MiGeBP1、MiGeBP2、MiGeBP3、MiGeBP10基因分別在侵染處理后24、48、24、12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最高，在2個(gè)及2個(gè)以上的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均下調(diào)表達(dá)的基因是MiGeBP9，其在侵染處理后3 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最低。侵染處理后的48 h時(shí)，MiGeBP基因家族的多個(gè)成員均顯著表達(dá)，而MiGeBP7和MiGeBP9基因均下調(diào)表達(dá)。

圖7 杧果GeBP基因家族在病原菌侵染后的相對(duì)表達(dá)量熱圖Fig.7 Heatmap of relative expression of the mango GeBP family after pathogen infection

3 討 論

植物轉(zhuǎn)錄因子存在特殊結(jié)構(gòu)，可以調(diào)控基因表達(dá)，是重要的調(diào)節(jié)基因之一，如與植物表皮毛形成密切相關(guān)的GeBP轉(zhuǎn)錄因子。GeBP中的亮氨酸拉鏈（75%相似）和基本域（75%相似）兩個(gè)基序的排列特點(diǎn)及鄰近性表明了GeBP可能屬于bZip轉(zhuǎn)錄因子家族，但兩個(gè)基序間的距離大于9個(gè)殘基，所以，其又不完全屬于標(biāo)準(zhǔn)意義上的bZip蛋白[12,30]，通過敲除擬南芥的GeBP（AtGeBP）中心域、bZip基序的假定基本區(qū)域和C端區(qū)域后發(fā)現(xiàn)，基本結(jié)構(gòu)域的刪除對(duì)酵母的生長(zhǎng)沒有影響，這表明GeBP沒有bZip轉(zhuǎn)錄因子的作用，因?yàn)榛窘Y(jié)構(gòu)域是bZip蛋白結(jié)合DNA所必需的[12]。以上結(jié)果表明，這是一個(gè)新的蛋白家族。

杧果基因組測(cè)序的完成，有利于杧果轉(zhuǎn)錄因子功能的深入研究。本研究從全基因組水平上對(duì)杧果GeBP基因家族的10個(gè)成員進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，MiGeBPs轉(zhuǎn)錄因子在氨基酸個(gè)數(shù)、蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)上均有較大的差異，且除MiGeBP3中含有2個(gè)內(nèi)含子之外，其余家族成員都只有1個(gè)內(nèi)含子；而毛竹的16個(gè)基因中含有內(nèi)含子的基因僅有3個(gè)，番茄的10個(gè)基因中含有內(nèi)含子的基因僅有2個(gè)。這一鑒定結(jié)果表明，GeBP基因家族結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單、穩(wěn)定。對(duì)GeBP基因家族成員的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，無規(guī)則卷曲和α-螺旋是其結(jié)構(gòu)中的主要元件；在對(duì)MiGeBPs保守結(jié)構(gòu)域的分析中發(fā)現(xiàn)，該家族成員均有DUF573結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)果與陳凱等[10]對(duì)番茄GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族的研究結(jié)果一致，說明DUF573結(jié)構(gòu)域在該基因家族中具有普遍性。在構(gòu)建杧果與番茄、擬南芥和水稻這4個(gè)物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)發(fā)現(xiàn)，MiGeBP2、MiGeBP3、MiGeBP4、MiGeBP5、MiGeBP6、MiGeBP7、MiGeBP8、MiGeBP9與番茄和擬南芥的GeBP家族成員分別聚集在ClassⅠ、Ⅱ、Ⅳ分支中，MiGeBP1、MiGeBP10所在Class Ⅲ分支的8個(gè)蛋白中僅存在水稻的1個(gè)蛋白（LOC Os09g014750.1.1），而水稻GeBP基因家族中的剩余成員與AT4G00390.1聚集在ClassⅤ分支中。由此可以推測(cè)，杧果與番茄、擬南芥均有較近的親緣關(guān)系，而與水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這一研究結(jié)果表明，杧果與雙子葉植物的親緣關(guān)系較近，而與單子葉植物間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。陳凱等[10]在構(gòu)建番茄與擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)發(fā)現(xiàn)，番茄的Solyc07g052760.1、Solyc07g052830.1、Solyc07g052900.1和擬南芥的GeBP/GPL間的關(guān)系均較近，他們由此推測(cè)，GeBP這個(gè)家族參與了番茄表皮毛細(xì)胞伸長(zhǎng)的調(diào)控。研究中發(fā)現(xiàn)，上述番茄的Solyc07g052760.1、Solyc07g052830.1、Solyc07g052900.1這3個(gè)成員與MiGeBP 5均聚集在Class Ⅱ分支中，暗示著該基因可能與杧果表皮毛的形成或發(fā)育相關(guān)。

有關(guān)研究者在對(duì)番茄的研究中發(fā)現(xiàn)，番茄GeBP家族成員在其花、葉、根、果等組織中均有表達(dá)，但是不同的基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異[10]。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，MiGeBP1～MiGeBP10在杧果不同組織中均表現(xiàn)出明顯的組織表達(dá)特異性，其中，MiGeBP8基因在杧果的芽、盛花、大果（35 d）和成熟果中均顯著上調(diào)表達(dá)，且在盛花中的相對(duì)表達(dá)量最高；MiGeBP4基因在杧果各組織中的表達(dá)量均較低。隨著果實(shí)的發(fā)育，MiGeBP8與MiGeBP9基因的表達(dá)量均逐漸增高，且其在成熟果中的表達(dá)量最大。植物不同物種的GeBP轉(zhuǎn)錄因子在其不同組織中和不同發(fā)育時(shí)期均有差異表達(dá)[10-11]。黃瓜中的GeBP轉(zhuǎn)錄因子與GL1基因順式調(diào)控原件結(jié)合調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控葉片、花、果實(shí)上毛狀體的形成，但對(duì)根毛的形成卻無明顯影響，這也反映出GeBP組織表達(dá)的特異性[31]；Lu等[32]采用掃描電鏡觀察了杧果葉片上的表皮毛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老葉片上的表皮毛較少，這暗示著杧果葉片上表皮毛的形成受到了抑制。而筆者采用qRT-PCR的方法分析了杧果不同組織中GeBP轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GeBP家族的多數(shù)成員在幼葉、花等器官中均上調(diào)表達(dá)，而在果實(shí)等器官中均下調(diào)表達(dá)，這說明GeBP家族成員調(diào)控杧果不同組織表皮毛形態(tài)建成的機(jī)制可能不盡相同。有關(guān)研究結(jié)果表明，植物在受到鹽、干旱等脅迫時(shí)其表皮毛的長(zhǎng)度與密度均會(huì)增加[33]；Weinhold等[34]的研究結(jié)果表明，煙草憑借其表皮毛的分泌物抵御天蛾幼蟲的侵害，這表明植物表皮毛在抗病抗逆中發(fā)揮著重要作用。而GeBP基因調(diào)控著植物表皮毛細(xì)胞的伸長(zhǎng)，由此推測(cè)，GeBP基因直接或間接地參與了植物抗病抗逆反應(yīng)。檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，以分屬于不同類型的杧果細(xì)菌性黑斑病菌和膠孢菌侵染杧果葉片時(shí)，MiGeBPs基因的響應(yīng)程度有所不同：以細(xì)菌性黑斑病菌侵染時(shí)，多數(shù)基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)，由此可以推測(cè)，MiGeBPs基因以負(fù)調(diào)控的方式參與了杧果的免疫反應(yīng)；而以膠孢炭疽菌侵染時(shí)，多數(shù)基因均持續(xù)性顯著上調(diào)表達(dá)，這說明MiGeBPs基因以正調(diào)控的方式參與了杧果的免疫反應(yīng)。因此，有關(guān)“病原菌—GeBP基因—表皮毛”三者之間的調(diào)控關(guān)系將是下一步研究的重點(diǎn)，通過研究其調(diào)控關(guān)系也許可以解析GeBP基因在植物免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究采用生物信息學(xué)的方法分析了杧果GeBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因成員的分子特征和表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家族基因成員均屬于DUF573超家族，其與雙子葉植物的親緣關(guān)系均較近。在病原菌的侵染過程中，各個(gè)家族成員均有不同程度的響應(yīng)：以杧果細(xì)菌性黑斑病菌侵染后，MiGeBP8在侵染處理后0～72 h內(nèi)的各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著表達(dá)，除侵染處理后6 h時(shí)呈顯著上調(diào)表達(dá)外，其余檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均呈顯著性下調(diào)表達(dá)，MiGeBP9在侵染處理后0～72 h的檢測(cè)時(shí)段內(nèi)也都呈顯著性表達(dá)，除侵染處理后24 h時(shí)呈顯著下調(diào)表達(dá)外，其余時(shí)間段均呈顯著上調(diào)表達(dá)；以杧果膠孢炭疽菌侵染后，MiGeBP5、MiGeBP6在侵染處理后0～72 h的檢測(cè)時(shí)段內(nèi)均顯著上調(diào)表達(dá)。由此可以推測(cè)，GeBP基因家族成員不同程度地參與了杧果的免疫反應(yīng)。