不同紅河橙居群果實(shí)表型的變異

高玉紅，魏 萌，2，李凱迪，牟鳳娟

（1.西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

紅河橙Citrus hongheensis，為蕓香科Rutaceae柑橘屬Citrus高大喬木，又稱紅河大翼橙，為大翼橙的一個(gè)種類，是較為原始的柑橘類型。該物種主要分布于云南紅河流域較為狹窄的區(qū)域，生于海拔800～2 000 m的山坡雜木林中，當(dāng)?shù)毓嶙迦朔Q其“阿蕾”[1-5]。紅河橙的發(fā)現(xiàn)為“中國(guó)是世界柑橘類植物起源中心之一”這一觀點(diǎn)提供了佐證[6]。紅河橙的翼葉較為發(fā)達(dá)，比本葉長(zhǎng)1～3倍；株高約8 m，花白色，5～9朵排列成總狀花序，稀單花腋生，花絲分離，柱頭較大，花柱長(zhǎng)6.5 mm；果淡黃色或黃綠色，大多橢圓形，果皮厚1.5～2.0 cm，油胞較大，果肉白色至淡黃色，味甚酸，微苦；種子長(zhǎng)12 mm，寬10～12 mm，厚6～8 mm，種皮較平滑[1,7]。

廣義的遺傳多樣性指地球上所有生物的遺傳信息的總和，反映了物種基因的豐富程度，是研究物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)[8-9]。作為生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，植物遺傳多樣性水平對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)有著舉足輕重的作用[10]。大量研究結(jié)果表明，隨著植物遺傳多樣性水平升高，營(yíng)養(yǎng)級(jí)動(dòng)物的多樣性也相應(yīng)增加，從而間接地改變了群落結(jié)構(gòu)甚至是生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)[11-13]，其中植物種群遺傳變異和維持變異的機(jī)制可通過遺傳多樣性來體現(xiàn)[14]。研究植物遺傳多樣性的方法主要有形態(tài)標(biāo)記、染色體標(biāo)記、等位酶標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記等[15]。雖然染色體標(biāo)記、等位酶標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記能更準(zhǔn)確地在某些方面反映出物種的遺傳多樣性，但形態(tài)標(biāo)記仍具有無(wú)法替代的地位[16]。經(jīng)典植物分類學(xué)中，花、果、種子性狀是最受重視的植物形態(tài)學(xué)性狀，果實(shí)的果皮和種子是植物繁殖系統(tǒng)的重要特征[17]，果實(shí)表型是樹木分類和遺傳研究的重要參考指標(biāo)。不少學(xué)者通過果皮或種子的遺傳多樣性研究，對(duì)植物種質(zhì)資源利用提出了新的建議和方法[18-22]。

近年來，多位國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)柑橘屬及其近緣屬的遺傳多樣性進(jìn)行了研究[23-24]。李映志采用cpSSR和nSSR分子標(biāo)記法對(duì)我國(guó)19份野生寬皮柑橘Citrus reticulata和33份地方寬皮柑橘進(jìn)行品種間遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)野生柑橘的遺傳多樣性遠(yuǎn)大于地方寬皮柑橘[23]。Garcia-Lor等[24]采用nSSR、SNP、Indel等多種分子標(biāo)記法分析了橘類種質(zhì)的遺傳多樣性，結(jié)果表明大部分寬皮柑橘品種間均不同程度摻雜了枸櫞C.medica、柚C.maxima等的基因，不同的寬皮柑橘互相雜交形成橘的部分品種。關(guān)于紅河橙的研究大部分集中于分子遺傳多樣性分析[2-3]以及該種在柑橘分類中的系統(tǒng)地位[25-29]。楊楊等[2]和Yang等[3]采用ISSR分子標(biāo)記的方法對(duì)云南紅河地區(qū)的6個(gè)紅河橙居群進(jìn)行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)紅河橙的遺傳多樣性較高，認(rèn)為紅河橙遺傳多樣性水平較高是生境異質(zhì)化和有限基因流共同作用的結(jié)果。牟鳳娟等[30]對(duì)紅河橙野生居群和栽培居群的葉表型性狀進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)栽培居群有8個(gè)表型性狀指標(biāo)的平均值大于野生居群，野生居群有5個(gè)表型性狀指標(biāo)的平均值稍大于栽培居群，且居群內(nèi)不同葉表型變異程度不同，同一表型在不同居群間變異程度均不同。目前鮮見紅河橙果實(shí)多樣性方面的研究報(bào)道。本研究中對(duì)紅河橙不同居群的果實(shí)表型性狀多樣性進(jìn)行了分析，旨在為紅河橙的資源利用和保育研究等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年12月初果實(shí)成熟期，對(duì)分布在云南南部的綠春縣大興鎮(zhèn)、紅河縣甲寅鄉(xiāng)、紅河縣大羊街鄉(xiāng)、元江縣那諾鄉(xiāng)打芒村、元江縣那諾鄉(xiāng)豬街村等5個(gè)紅河橙居群進(jìn)行調(diào)查和取樣。每個(gè)居群至少取樣10株，不足10株時(shí)，取全部結(jié)實(shí)的植株，每個(gè)樣株隨機(jī)采集成熟果實(shí)，編號(hào)待用。

1.2 果實(shí)表型性狀指標(biāo)測(cè)定

測(cè)量果實(shí)高度、果實(shí)寬度、果皮厚度、瓢囊厚度，并計(jì)算瓢囊與果皮厚度的比值。其中，縱徑為果實(shí)高度，橫徑為果實(shí)寬度，果皮厚度取果皮最厚處和果皮最薄處厚度的平均值，瓢囊厚度取果實(shí)髓心至內(nèi)果皮距離的最大值和最小值的平均值。

收集果實(shí)瓢囊中的種子，洗凈粘液后，自然風(fēng)干備用。將每單株的所有種子混勻后隨機(jī)取樣，每個(gè)居群每個(gè)樣株至少取50粒種子，分別測(cè)量種子的長(zhǎng)度、寬度以及厚度，并計(jì)算種子長(zhǎng)寬比值。

為簡(jiǎn)化分析，定義紅河橙果實(shí)的形狀表型性狀包括果實(shí)高度和寬度，果皮表型性狀包括果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度的比值，種子表型性狀包括種子長(zhǎng)度、種子寬度、種子厚度、種子長(zhǎng)寬比。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將紅河橙表型數(shù)據(jù)錄入Excel 2010軟件中，計(jì)算各指標(biāo)值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。使用Excel 2010和SPSS 19.0軟件對(duì)紅河橙的各項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)分組設(shè)計(jì)方差分析、差異顯著性檢驗(yàn)、聚類分析以及主成分分析。系統(tǒng)分組設(shè)計(jì)方差分析的線性模型為

式中：Yijk為第i個(gè)居群第j個(gè)植株的第k個(gè)觀測(cè)值，μ為總均值，Si為第i個(gè)居群的居群效應(yīng)（固定），Tj(i)為第i個(gè)居群內(nèi)單株效應(yīng)（隨機(jī)），ε(ij)k為試驗(yàn)誤差。

以表型分化系數(shù)（Vst）表示居群間變異占遺傳總變異的比例。

式中：為居群間方差分量，бT2為居群內(nèi)方差分量。

以性狀的變異系數(shù)（CV）表示性狀離散程度。

CV=(Ds/V)×100%。

式中：Ds為標(biāo)準(zhǔn)差，為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紅河橙居群果實(shí)的表型性狀

5個(gè)紅河橙居群果實(shí)的表型性狀見表1。

表1 不同紅河橙居群果實(shí)的表型性狀?Table 1 Phenotypic characters of C.hongheensis fruit in different populations

由表1可知，豬街村居群的果實(shí)高度、果實(shí)寬度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比均為最大，說明該居群果實(shí)的個(gè)頭較大，出肉率較高。打芒村居群的種子長(zhǎng)度、種子寬度為最大值，種子長(zhǎng)寬比居第2位，種子厚度居第3位，說明該居群種子形狀相對(duì)細(xì)長(zhǎng)。種子最厚的是大興鎮(zhèn)居群，種子長(zhǎng)寬比值較小，表明該居群種子最為飽滿，可優(yōu)先將其作為良種選育的來源。

由表1可知，紅河橙9個(gè)果實(shí)表型在居群間和居群內(nèi)均存在豐富的遺傳變異。果實(shí)高度、果實(shí)寬度、果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比、種子長(zhǎng)度、種子寬度這7個(gè)表型性狀在居群間和居群內(nèi)存在極顯著差異（P＜0.01）；種子厚度、種子長(zhǎng)寬比等表型在居群間存在顯著差異（P＜0.05），在居群內(nèi)存在極顯著差異（P＜0.01）。

2.2 不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的變異分析

不同紅河橙居群果實(shí)表型的變異系數(shù)見表2。由表2可知，紅河橙果實(shí)形狀表型、果皮表型性狀的變異程度相對(duì)較大，種子表型性狀的變異程度相對(duì)較小。果實(shí)形狀表型和果皮表型變異系數(shù)為20.76%～31.04%，其中變異程度最大的是瓢囊與果皮厚度比（31.04%），最小為果實(shí)高度（20.76%），其變異系數(shù)均大于20%，說明不同居群的紅河橙果實(shí)形狀和果皮表型性狀差異較大，可考慮將二者作為判別紅河橙居群來源的依據(jù)。此外，紅河橙果實(shí)4個(gè)種子表型性狀的變異系數(shù)為13.96%～18.47%，變異系數(shù)最大的是種子長(zhǎng)度（18.47%），最小的是種子厚度（13.96%）。

由表2可知，不同居群內(nèi)同一性狀也有差異。果實(shí)高度（16.62%）、果實(shí)寬度（16.57%）、瓢囊厚度（16.39%）均為大興鎮(zhèn)居群變異程度最大，果皮厚度（28.55%）為甲寅鄉(xiāng)居群的變異程度最大，種子長(zhǎng)度（15.06%）和種子寬度（21.32%）均為大羊街鄉(xiāng)居群的變異程度最大，瓢囊與果皮厚度比（30.49%）和種子長(zhǎng)寬比（17.45%）均為打芒村居群的變異程度最大，種子厚度（14.06%）為豬街村居群的變異程度最大。綜合來看，居群內(nèi)果實(shí)表型變異系數(shù)由大到小排序依次為打芒村群居群（16.83%）、大興鎮(zhèn)居群（15.28%）、大羊街鄉(xiāng)居群（15.01%）、甲寅鄉(xiāng)居群（14.07%）、豬街村居群（13.33%）。

表2 不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的變異系數(shù)Table 2 Coefficient of variation of fruit phenotypic traits in different populations of C.hongheensis %

2.3 不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的分化

不同紅河橙居群果實(shí)表型的系統(tǒng)分組設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，紅河橙居群間的方差分量為24.26%～95.58%，居群內(nèi)為4.39%～75.35%，表明居群間分化程度相對(duì)較高，而居群內(nèi)分化程度較低。從表型分化系數(shù)來看，各性狀表型分化系數(shù)為24.36%～95.61%，變異程度最大的是瓢囊厚度（95.61%），然后依次是瓢囊與果皮厚度比（93.68%）、果實(shí)高度（92.81%）和種子長(zhǎng)度（92.51%），變異程度最小的是種子厚度（24.36%）。平均表型分化系數(shù)為75.58%，表明居群間表型分化系數(shù)為75.58%，居群內(nèi)分化系數(shù)為24.42%，居群間變異是紅河橙果實(shí)性狀變異的主要來源。

表3 不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的系統(tǒng)分組設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 3 Systematic grouping design and analysis of variance of fruit traits in different C.hongheensis populations

2.4 紅河橙果實(shí)表型性狀的相關(guān)性分析

紅河橙果實(shí)表型性狀的相關(guān)系數(shù)見表4。由表4可知，紅河橙果實(shí)的形狀表型、果皮表型、種子表型有不同程度的關(guān)聯(lián)性。其中，果實(shí)高度與果實(shí)寬度極顯著正相關(guān)，果實(shí)高度和果實(shí)寬度與果皮厚度、瓢囊厚度、種子長(zhǎng)度、種子寬度間均呈極顯著正相關(guān)，瓢囊厚度與瓢囊和果皮厚度比、種子長(zhǎng)度呈極顯著正相關(guān)，種子厚度與果實(shí)形狀表現(xiàn)相關(guān)性較小，說明紅河橙果實(shí)大小和瓢囊厚度與種子大小的關(guān)系較為密切。

表4 紅河橙果實(shí)表型性狀的相關(guān)系數(shù)?Table 4 Correlation coefficient of fruit traits of C.hongheensis

2.5 紅河橙果實(shí)表型性狀的主成分分析

紅河橙果實(shí)表型性狀的主成分分析結(jié)果見表5。由表5可知，前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.541%。第1主成分的特征值為4.098，貢獻(xiàn)率為45.539%，在其特征向量中，絕對(duì)值較高的性狀是果實(shí)高度（0.911）、果實(shí)寬度（0.905）、瓢囊厚度（0.827）、種子長(zhǎng)度（0.821）、種子寬度（0.668），該類性狀與果皮和種子表型有關(guān)，故第1主成分為果實(shí)形狀因子。第2主成分的特征值為1.853，貢獻(xiàn)率為20.586%，第1主成分和第2主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為66.125%。在第2主成分的特征向量中，絕對(duì)值較高的性狀是瓢囊與果皮厚度比（0.815）、果皮厚度（0.805），瓢囊與果皮厚度比反映的是果實(shí)的出肉率，與果實(shí)品質(zhì)有關(guān)，故第2主成分為果實(shí)品質(zhì)因子。第3主成分的特征值為1.359，貢獻(xiàn)率為15.416%，第1主成分、第2主成分和第3主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為81.541%。在第3主成分的特征向量中，絕對(duì)值最高的性狀是種子長(zhǎng)寬比（0.873），種子長(zhǎng)寬比反映的是種子的飽滿程度，與種子品質(zhì)有關(guān)，故第3主成分為種子品質(zhì)因子。

表5 紅河橙果實(shí)表型性狀的主成分分析結(jié)果Table 5 Principal component analysis of fruit traits of C.hongheensis

2.6 不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的聚類分析

基于歐式距離對(duì)5個(gè)紅河橙居群的表型性狀進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，在歐式距離為5時(shí)，紅河橙居群被分為3大類，其中第I類包括大羊街鄉(xiāng)、甲寅鄉(xiāng)和大興鎮(zhèn)3個(gè)居群，打芒村居群構(gòu)成第Ⅱ類，豬街村居群為第III類。

圖1 基于歐氏距離的不同紅河橙居群果實(shí)表型性狀的聚類分析結(jié)果Fig.1 Cluster analysis result of fruit traits of different C.hongheensis populations on Euclidean distance

紅河橙的分布范圍雖然較為狹窄，5個(gè)居群在地理位置上較為接近，但其3大類群的劃分與其地理分布格局基本相一致。大羊街鄉(xiāng)、甲寅鄉(xiāng)和大興鎮(zhèn)3個(gè)居群的果實(shí)表型近似，在地理位置上也更為相近。該大類表現(xiàn)為果實(shí)形態(tài)略小，瓢囊平均厚度略小，種子較短小。元江縣那諾鄉(xiāng)的豬街村和打芒村在地理位置上較近，但其種實(shí)差異較大。豬街村居群的果實(shí)最大，種子較大，其果實(shí)皮薄肉多，較為飽滿；打芒村居群的果實(shí)個(gè)頭較大，在外形上呈現(xiàn)“扁圓”的特點(diǎn)，種子最大，略飽滿。暴卓然等[31]報(bào)道的紅河橙變種元江大翼橙果實(shí)的各表型性狀特征與本研究中元江縣那諾鄉(xiāng)的豬街村和打芒村2個(gè)居群的特征相符，這2個(gè)居群與其他3個(gè)紅河橙居群在果實(shí)形態(tài)上存在明顯差異。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，不同紅河橙居群間果實(shí)形態(tài)差異較大，遺傳多樣性豐富，居群間變異是紅河橙遺傳變異的主要來源。其中，果實(shí)高度、果實(shí)寬度、瓢囊厚度、種子長(zhǎng)度、種子寬度等表型是紅河橙居群間果實(shí)性狀變異的主要表現(xiàn)，果實(shí)形狀和果皮表型變異占了絕大部分比例，因此可將果皮表型作為種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和良種選育的主要參考指標(biāo)之一。元江縣那諾鄉(xiāng)打芒村居群的果實(shí)變異最豐富，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)變異的可能性較高，可考慮將其作為優(yōu)良種質(zhì)資源選育的主要來源。

表型多樣性是遺傳多樣性的基礎(chǔ)，經(jīng)過長(zhǎng)期適應(yīng)和自然選擇，野外物種在不同居群間已經(jīng)產(chǎn)生明顯的變異和分化，各表型性狀在居群內(nèi)和居群間均存在豐富的遺傳變異[32-33]。本研究結(jié)果表明，紅河橙果實(shí)形狀表型（果實(shí)高度、果實(shí)寬度）、果皮表型（果皮厚度、瓢囊厚度、瓢囊與果皮厚度比）和種子表型（種子長(zhǎng)度、種子寬度、種子厚度、種子長(zhǎng)寬比）在不同居群間差異顯著，說明紅河橙果實(shí)各表型在不同居群間存在著豐富的變異，其果實(shí)表型變異主要來源于居群間的變異，與有關(guān)麻櫟Quercus acutissima[34]、絲栗栲Castanopsis fargesii[35]、文冠果Xanthoceras sorbifolium[36]以及青海云杉Picea crassifolia[37]等植物果實(shí)表型變異的研究結(jié)果相似，與板栗Castanea mollissima刺苞的刺束長(zhǎng)度變異的研究結(jié)果不一致，后者居群內(nèi)變異是其表型性狀呈多樣性的主要來源[38]。本研究中，紅河橙不同居群間果實(shí)形狀表型和果皮表型的多樣性普遍高于種子表型多樣性，果實(shí)9個(gè)表型性狀的變異系數(shù)為13.96%～31.04%，表明紅河橙多樣性水平普遍較高，與楊楊等[2]和Yang等[3]的研究結(jié)果相一致。

同一物種在不同居群間發(fā)生的變異可以反映出該物種對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)能力，物種的變異程度也表明了其適應(yīng)不同生境的廣泛程度，通常變異程度較大的物種，其適應(yīng)的生境也越廣[11]。紅河橙果實(shí)各表型在居群之間的差異顯著或極顯著，其主要原因可能是受自身的遺傳組成和生境的共同影響，說明紅河橙果實(shí)這9個(gè)表型性狀的多態(tài)性較為豐富，是紅河橙適應(yīng)環(huán)境的具體表現(xiàn)。此外，紅河橙的種子長(zhǎng)度、種子寬度、種子厚度這3個(gè)性狀的平均值分別是16.52、11.24、5.60 mm，相應(yīng)的變異系數(shù)分別為18.47%、17.65%、13.96%，牟鳳娟等[39]報(bào)道西雙版納地區(qū)分布的大翼厚皮橙這3個(gè)性狀的平均值分別為15.30、6.97、3.89 mm，相應(yīng)的變異系數(shù)分別是10.10%、11.37%、12.34%，與之相比，紅河橙種子更大、更飽滿，變異程度更豐富，且5個(gè)居群間的遺傳多樣性水平較高。

據(jù)報(bào)道，文冠果的株高、地徑、葉長(zhǎng)、葉寬、果橫徑、果縱徑、種子長(zhǎng)、種子寬等21個(gè)表型性狀間的變異明顯，且單株種子質(zhì)量與多個(gè)性狀間存在顯著相關(guān)性[40]。相關(guān)分析結(jié)果表明，紅河橙僅種子長(zhǎng)度和種子寬度與果實(shí)形狀和瓢囊厚度有極顯著或顯著相關(guān)性，其余各指標(biāo)間相關(guān)性較小，說明種子表型的遺傳多樣性可能受基因調(diào)控的影響更顯著，受環(huán)境影響較小，還有待進(jìn)一步從其他角度進(jìn)行深入研究。

主成分分析是在不損失或較少損失原來表型性狀信息的情況下將形態(tài)學(xué)信息通過降維的方法，分類出若干個(gè)綜合因子來反映原先具有眾多性狀變量的信息量，從而簡(jiǎn)化形態(tài)學(xué)的分類工作[40]。本研究中通過對(duì)5個(gè)不同來源的紅河橙果實(shí)的9個(gè)表型性狀進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)81.541%，其中果實(shí)高度、果實(shí)寬度、瓢囊厚度、種子長(zhǎng)度、種子寬度等表型是紅河橙果實(shí)性狀變異的主要表現(xiàn)，且果實(shí)形狀表型和果皮表型變異占了絕大部分比例，這種現(xiàn)象是否為環(huán)境飾變產(chǎn)生的結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)[41]。

聚類分析結(jié)果表明，在歐氏距離為5時(shí)，不同地區(qū)的紅河橙被分為3個(gè)大類。第Ⅰ類包括紅河縣大羊街鄉(xiāng)、紅河縣甲寅鄉(xiāng)、綠春縣大興鎮(zhèn)3個(gè)居群，該類群表現(xiàn)為果實(shí)略小，瓢囊平均厚度較薄，種子較短小，形態(tài)略微不飽滿，特別是大興鎮(zhèn)居群，其種子最小，推測(cè)該3個(gè)居群的紅河橙種質(zhì)來源與元江縣那諾鄉(xiāng)2個(gè)居群不同。第II類為元江縣那諾鄉(xiāng)打芒村居群，其果實(shí)變異程度最大，變異最為豐富，果實(shí)高度和寬度的平均值較大，在外形上呈現(xiàn)“扁圓”的特點(diǎn)，種子長(zhǎng)度和寬度最大，厚度適中，從該居群篩選出優(yōu)質(zhì)資源的可能性較高，可考慮將其作為優(yōu)質(zhì)種質(zhì)選育材料的重要來源。第III類為元江縣那諾鄉(xiāng)豬街村居群，其果實(shí)最大，種子較大，果實(shí)皮薄肉多、形態(tài)飽滿，可以考慮將其作為中藥“枳殼”的材料來源[29]。

花、葉、果、種子等為植物的重要器官，進(jìn)行表型研究時(shí)應(yīng)盡可能涵蓋這些器官的性狀。本研究中僅涉及紅河橙果實(shí)的形狀表型、果皮表型和種子表型，還應(yīng)從花、葉及植株等多項(xiàng)表型進(jìn)行更深入的研究。同時(shí)，生境對(duì)表型的影響較大，僅通過表型性狀對(duì)紅河橙進(jìn)行多樣性研究存在一定的局限性。后續(xù)考慮將表型研究與基因水平的研究相結(jié)合，綜合分析紅河橙的遺傳多樣性，并對(duì)紅河橙野生資源進(jìn)行深入調(diào)查研究。