體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)在優(yōu)質(zhì)基因種豬群快速擴繁中的應(yīng)用

陳海云 林曉 滕麗瓊 蘇院司 梁啟賢/南寧壯博生物科技有限公司 530007

體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)是一種優(yōu)質(zhì)的種豬育種技術(shù)。種豬行業(yè)在豬只養(yǎng)殖行業(yè)的上游，擁有豬只繁殖所需的資源與技術(shù)，對整個豬只養(yǎng)殖行業(yè)極為關(guān)鍵。

根據(jù)國家統(tǒng)計局最新數(shù)據(jù)顯示，2021 上半年全國生豬存欄4.4 億頭，能繁母豬存欄4564 萬頭。2018 年，2019 年受到非洲豬瘟影響，種豬市場規(guī)模經(jīng)歷大幅衰退。2019 年末以后，全國各地對豬肉的需求上升，預(yù)計2021 年市場規(guī)模可達(dá)到865 億元。我國每年超過97%的核心純種豬依賴進口。我國育種水平低，國內(nèi)種豬業(yè)長期處于“引種—擴繁—銷售—退化—再引種”惡性循環(huán)模式。常規(guī)育種幾年甚至十幾年才能培育一頭特級公豬。而運用體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)一年可以獲得上百頭甚至上千頭的特級公豬。實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種豬的快速擴繁，大大提高效率，降低了育種成本。

體細(xì)胞克隆技術(shù)技術(shù)原理是從特級種豬采集少量的耳朵組織體外培養(yǎng)，提取細(xì)胞核。選取供體母豬卵巢，提取卵母細(xì)胞，去掉細(xì)胞核，獲得去核卵母細(xì)胞。進行體外融合、體外培養(yǎng)3d，后進行胚胎移植，114d 左右即可獲得克隆后代?，F(xiàn)如今研究豬的克隆與基因編輯技術(shù)結(jié)合，體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)的改進與提升是該研究的前提。隨著豬的繁殖生物技術(shù)的需要，豬胚胎移植技術(shù)是豬生產(chǎn)中不可或缺的技術(shù)環(huán)節(jié)，是豬繁殖和改良的重要手段。

相比于誘變育種，雜交育種等這類傳統(tǒng)育種方式，將體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)相結(jié)合，能夠生產(chǎn)出更優(yōu)質(zhì)的種豬且耗時少，成本低。對豬的基因組進行修飾，能夠生產(chǎn)出抗病性強的豬。生產(chǎn)出來的優(yōu)質(zhì)種豬，就可以進行保種保育，防止其優(yōu)良品系的流失。該技術(shù)能生產(chǎn)出高品質(zhì)的肉豬，抗病能力更強，肉質(zhì)好又健康。

1 材料與方法

1.1 試驗動物由廣西壯族自治區(qū)南寧市壯博生物科技有限公司提供的長白豬母豬13 頭，豬重均在 200 kg 左右，術(shù)前檢查身體狀況健康，良好。采豬的咽拭子進行病毒檢測，結(jié)果為陰性后禁食 24h，可以喝少量的水。

1.2 胚胎此實驗的卵母細(xì)胞在南寧市的屠宰場中選取，在該屠宰場母豬的豬卵巢中獲取并培養(yǎng)，體細(xì)胞用的是五指山豬耳細(xì)胞，胚胎由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.3 試驗器材及藥品常規(guī)外科手術(shù)器械；鹽酸腎上腺素注射液，購自遂成藥業(yè)；鹽酸利多卡因注射液，購自遂成藥業(yè)；酚磺乙胺注射液，購自華牧動物保健品；待孕母豬篩選表；開口導(dǎo)管與適配器等。

1.4 麻醉與消毒母豬保定確實后，在耳靜脈消毒后注射麻醉藥；大約注射40mL 麻醉藥后，母豬開始暈眩，大約注射50mL 麻醉藥后，母豬倒地。其中有母豬在注射完50mL 還繼續(xù)強烈掙扎，繼續(xù)注射達(dá)60mL。手術(shù)時助理監(jiān)測記錄各環(huán)節(jié)母豬心跳頻率，耗時，用藥量與體征狀況。

1.5 術(shù)式手術(shù)前將母豬麻醉倒地，麻醉完成后，用聽診器探測母豬的心跳頻率，心跳頻率均大致在80Hz 左右為正常。消毒母豬腹部，在接近腹中處用手術(shù)刀切開一個大約8cm 左右的口子，手術(shù)過程中4 人分別按壓豬的腿部，1 人消毒腹腔刮毛后，將手伸入腹部內(nèi)準(zhǔn)確拉出輸卵管傘，用生理鹽水沖掉溢出的血。術(shù)者鋪開輸卵管傘并捋直輸卵管，這時，另一個助手在立體顯微鏡下找出胚胎，在醫(yī)用注射器套上約20cm 導(dǎo)管，吸入約200 枚左右的胚胎，植入輸卵管傘的一側(cè)子宮。移植完畢后將器官放回腹腔正確位置，用針線縫補好傷口，然后涂抹頭孢，再噴涂血云南白藥，用紗布包好傷口。整個手術(shù)過程高效快速，每臺胚胎移植手術(shù)不超過10min。

圖1 手術(shù)過程

1.6 術(shù)后護理手術(shù)后，注意觀察受體母豬手術(shù)恢復(fù)情況，防范手術(shù)傷口感染。每天測量體溫2 次，在傷口處涂抹頭孢與魚腥草混合物，1d 1 次，連續(xù)3d，如無異常，3d 拆外面的紗布，7d 拆皮膚上線，拆后涂紫藥水，防止發(fā)炎。對受體母豬進行細(xì)致管理，時刻注意受體母豬的環(huán)境衛(wèi)生，身體狀況，進食情況以及調(diào)整飼喂量。

1.7 妊娠診斷

25d 后使用 B 超進行妊娠診斷，第一次診斷間隔25d，第二次診一次診斷間隔55d 左右。

2 結(jié)果

手術(shù)完成后，初步觀察到13 頭受體母豬在手術(shù)后的3d左右，食欲減退不主動吃食，4d 后母豬食欲、體溫與精神狀態(tài)均恢復(fù)正常，一個月后進行B超檢查，發(fā)現(xiàn)有9頭母豬妊娠，1 頭流產(chǎn)，耳號193602 母豬流產(chǎn)，耳號309001 和333402 移植母豬已超預(yù)產(chǎn)期，分別注射氯前列醇鈉2 支，未見有小豬產(chǎn)出。本次移植母豬13 頭，實際產(chǎn)仔5 頭母豬，164101，039604，307105，187201，034904，總產(chǎn)21 頭。克隆小豬編號703 由于體重太低（0.37kg），不能吃奶，吞咽困難，已死亡。還有的豬仔的舌頭比較大，不能自主吸奶，體質(zhì)較弱。本團隊尚未查到相關(guān)資料說明克隆豬舌頭偏大的原因，還需進行相關(guān)的研究。

表1 試驗豬的生產(chǎn)情況

3 討論

綜上所述，應(yīng)用胚胎移植技術(shù)只需要簡單的保溫設(shè)備，一次手術(shù)耗時不到10min，相比于普通育種模式有顯著優(yōu)勢。不僅節(jié)約開支而且防止了各種病原的傳播。應(yīng)用體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)還需要投入更多的研究，才能更好的保證代孕分娩率與后代存貨率。在后續(xù)的實驗中需優(yōu)化實驗方案，提高團隊的技術(shù)水平，配套基因測序技術(shù)保障供體質(zhì)量，顯微操作克隆技術(shù)提高效率，母豬的情期管理技術(shù)及胚胎精準(zhǔn)著床技術(shù)提升代孕分娩率。體細(xì)胞克隆及胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用前景廣闊，未來可期。