丹皮酚通過(guò)雌激素受體α調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換

連娜琦，朱子涵，殷凡章，李文文，周喆聿，王中揚(yáng)，吳 祥，李 育，卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，2. 藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種由脂質(zhì)代謝紊亂等多種因素引起的血管炎性病變。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期女性由于卵巢功能衰竭，體內(nèi)雌激素水平降低，導(dǎo)致患AS的風(fēng)險(xiǎn)急劇增加[1]。雌激素通過(guò)雌激素受體(estrogen receptor，ER)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，其主要分為ERα、ERβ兩個(gè)亞型；研究表明ERα表達(dá)下降會(huì)促進(jìn)AS的發(fā)生[2]。在AS早期，外周血的單核細(xì)胞在趨化因子作用下跨內(nèi)皮細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移并分化成巨噬細(xì)胞[3]，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝異?？纱偈蛊浔硇桶l(fā)生改變，進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)，并逐步轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞[4-5]。巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6]，其可通過(guò)血管內(nèi)微環(huán)境改變轉(zhuǎn)化成不同的表型，主要分為經(jīng)典激活的M1型和非經(jīng)典激活的M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎、促氧化應(yīng)激作用，而M2型巨噬細(xì)胞能發(fā)揮抗炎和促組織修復(fù)作用[7]。丹皮酚(Paeonol)是毛茛科植物牡丹根皮和蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿全草的主要活性成分，具有抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗血栓形成、抗腫瘤等作用。已有研究表明丹皮酚具有減輕動(dòng)脈粥樣硬化炎性損傷的作用[8-9]，但是丹皮酚對(duì)AS中巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化這一方面的研究較少。本研究利用小鼠源Raw264.7巨噬細(xì)胞復(fù)制M1極化模型，觀察丹皮酚是否通過(guò)ERα影響巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞株Raw264.7由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.1.2試劑 丹皮酚(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物公司，150914)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測(cè)定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB13412)、白介素10(IL-10)測(cè)定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB12344)、白介素1β(IL-1β)測(cè)定試劑盒(南京聯(lián)科生物公司，ARB132112)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物公司，20151210)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物公司，ARB12843)；Arg-1抗體(北京博奧森公司，bs-23837R)；CD163抗體(北京博奧森公司，bsm-54015R)、iNOS抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；CD86抗體(北京博奧森公司，bs-2072R)；β-actin抗體(Bioword公司，bs-10966R)；二抗(Proteintech公司，10285-1-AP)；β-雌二醇(Sigma公司，E2758)、ERα選擇性阻斷劑MPP(Sigma公司，WAY-200070)、ERβ選擇性阻斷劑PHTPP(Sigma公司，SML1355)。

1.2 方法

1.2.1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和經(jīng)典活化模型的建立 將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。根據(jù)文獻(xiàn)選用100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ聯(lián)用刺激巨噬細(xì)胞，復(fù)制M1極化模型[10-11]。

1.2.2活化巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為6組：對(duì)照組(control)加入DMSO(0.02%,W/V)；模型組(model)加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ；其余4組藥物干預(yù)組分別在模型組的基礎(chǔ)上加入100 nmol·L-1雌激素(E2)、30 μmol·L-1丹皮酚(Paeonol)[12]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1PHTPP[13]、30 μmol·L-1丹皮酚+50 μmol·L-1MPP[13]。細(xì)胞加入相應(yīng)濃度的藥物后，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的含量 選取第3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L-1，以每孔2 mL接種入6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞同期化后分組處理，分組與藥物干預(yù)方法同“1.2.2”，作用24 h后終止。收集培養(yǎng)上清液，3 000 r·min-1離心15 min，小心吸去上清液，按照試劑盒說(shuō)明書ELISA法測(cè)定上清液中IL-10、TNF-α、IL-1β、SOD與MDA的含量。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組和藥物干預(yù)同“1.2.2”。作用24 h后，提取細(xì)胞總蛋白并進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。TBST洗膜，加入一抗，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，用顯影液進(jìn)行顯色反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5shRNA干擾巨噬細(xì)胞ERα的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染Control shRNA和ERα shRNA的細(xì)胞各分為3組，分別為：對(duì)照組加入DMSO(0.02%,W/V)、模型組加入100 μg·L-1LPS和20 μg·L-1IFN-γ、丹皮酚組在預(yù)先進(jìn)行極化造模(同模型組)的細(xì)胞上加入30 μmol·L-1丹皮酚。再另設(shè)一組非轉(zhuǎn)染的空白組，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后檢測(cè)巨噬細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)，以及提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到100 μg·L-1LPS及20 μg·L-1INF-γ作用后，與對(duì)照組相比抗炎細(xì)胞因子IL-10含量和SOD含量明顯降低，促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β含量增加以及MDA的含量明顯升高。在細(xì)胞造模基礎(chǔ)上給予E2和丹皮酚后，與模型組相比，IL-10和SOD含量明顯升高，且TNF-α、IL-1β及MDA含量明顯降低。與此同時(shí)，丹皮酚+MPP組與模型組相比所有細(xì)胞因子均無(wú)差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比所有細(xì)胞因子表達(dá)依然有差異，說(shuō)明丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞因子的效應(yīng)可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對(duì)丹皮酚的效應(yīng)影響不明顯(Fig 1)。以上結(jié)果提示，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS和IFN-γ刺激后，巨噬細(xì)胞分泌促炎因子增多并加劇氧化應(yīng)激過(guò)程中的活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生，丹皮酚對(duì)其抑制作用與ERα有關(guān)。

2.2 丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS及INF-γ作用后，巨噬細(xì)胞M1表型標(biāo)志物iNOS、CD86的表達(dá)升高，M2表型標(biāo)志物Arg-1、CD163的表達(dá)降低，與空白對(duì)照組比較差異均具有顯著性。給予E2和丹皮酚后，iNOS、CD86的表達(dá)降低，Arg-1、CD163的表達(dá)升高，與模型組比較差異均具有顯著性。同樣，丹皮酚+MPP組與模型組相比對(duì)目的蛋白的影響無(wú)差異，而丹皮酚+PHTPP組與模型組相比目的蛋白的表達(dá)存在差異，說(shuō)明丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白的影響可能被ERα選擇性阻斷劑MPP阻斷，但ERβ選擇性阻斷劑PHTPP對(duì)丹皮酚的效應(yīng)影響不明顯(Fig 2)。以上結(jié)果提示，LPS和IFN-γ可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型向M1型轉(zhuǎn)化，丹皮酚能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型從M1型向M2型的轉(zhuǎn)化，此過(guò)程與ERα相關(guān)。

2.3 ERα對(duì)丹皮酚抗巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響利用慢病毒干擾ERα的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證ERα在丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對(duì)IL-10、TNF-α和IL-1β的作用。而使用慢病毒干擾ERα后，丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS+INF-γ誘導(dǎo)極化模型的干預(yù)作用消失，表現(xiàn)為與極化模型組相比，丹皮酚對(duì)極化模型下的IL-10、SOD、TNF-α、IL-1β和MDA的干預(yù)無(wú)明顯差異(Fig 3)。上述結(jié)果表明，丹皮酚對(duì)M1型巨噬細(xì)胞活化的抑制作用主要是通過(guò)ERα來(lái)調(diào)控的。

2.4 ERα對(duì)丹皮酚抗巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響首先驗(yàn)證空載慢病毒對(duì)丹皮酚的作用沒(méi)有影響，然后在此基礎(chǔ)上使用慢病毒干擾ERα觀察丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的調(diào)控作用是否發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空載慢病毒control shRNA不影響丹皮酚對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)的調(diào)控，具體表現(xiàn)為在control shRNA組中，丹皮酚可以明顯降低由LPS+INF-γ引起的iNOS、CD86高表達(dá)，同時(shí)明顯上調(diào)由LPS+INF-γ引起的Arg-1和CD163蛋白低表達(dá)。而在ERα shRNA組中，丹皮酚的這種調(diào)控作用明顯減弱，丹皮酚給藥組和模型組之間無(wú)差異(Fig 4)。以上結(jié)果提示，丹皮酚促進(jìn)LPS和IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，且通過(guò)ERα介導(dǎo)。

Fig 1 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

Fig 2 Effects of paeonol on LPS and IFN-γ-induced expression of macrophage phenotype-related proteins in

Fig 3 Effects of paeonol on the expression of cytokines induced by LPS and IFN-γ in macrophages

A: level of IL-10; B: level of TNF-α; C: level of IL-1β; D: level of MDA; E:level of SOD. **P<0.01 vs Control; ##P<0.01 vs Control shRNA Model；△△P<0.01 vs ERα shRNA Model

Fig 4 Effects of paeonol on the expression of LPS and IFN-γ-induced macrophage phenotype-related protein expression after ERα shRNA

3 討論

AS所致多種心腦血管疾病是全球最大的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，2020年死亡人數(shù)已增加至2 500萬(wàn)，占全球死亡總數(shù)的1/3，嚴(yán)重威脅人類健康。研究表明，絕經(jīng)前婦女心腦血管疾病的發(fā)病率明顯低于同齡男性，而絕經(jīng)后婦女心腦血管疾病發(fā)病率明顯高于育齡婦女，更年期雌激素水平降低，雌激素受體表達(dá)異常，是更年期AS發(fā)生的病理基礎(chǔ)[14]。AS是一種慢性炎癥性病變，巨噬細(xì)胞參與了AS病理進(jìn)程的多個(gè)環(huán)節(jié)，具有維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用，是一種可塑性較強(qiáng)的多功能免疫細(xì)胞，其表型和功能隨機(jī)體組織微環(huán)境的變化而變化，繼而激活不同亞型相關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮促炎或抗炎作用。越來(lái)越多證據(jù)表明，闡明巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化機(jī)制有助于為治療心血管慢性炎癥性疾病提供新策略。

丹皮酚在臨床上已用于防治AS，具有保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集、抗氧化、調(diào)血脂等作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，LPS及IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)并分泌炎性因子，產(chǎn)生大量iNOS、TNF-α、IL-1β等，丹皮酚能抑制M1型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)，上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，此過(guò)程與ERα相關(guān)。當(dāng)ERα被特異性阻斷劑或慢病毒干擾沉默后，丹皮酚的抗炎作用降低，而特異性阻斷ERβ對(duì)丹皮酚的抗炎作用沒(méi)有明顯影響。因此，丹皮酚的抗炎作用主要是通過(guò)ERα介導(dǎo)的。

綜上所述，丹皮酚抑制巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化發(fā)揮抗炎抗氧化應(yīng)激的作用是通過(guò)ERα介導(dǎo)的，有助于延緩AS的發(fā)生發(fā)展。