基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術(shù)探討川芎治療緊張型頭痛潛在分子機制

冉春龍 ， 趙欣杰，李文輝，白 琛， 李夢君，劉向哲

(1. 河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省科學院生物研究所，河南 鄭州 450008； 3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南 鄭州 450000)

緊張型頭痛 (tension-type headache，TTH) 是1988年國際頭痛協(xié)會制定的診斷名稱,TTH以往稱緊張性頭痛或肌收縮性頭痛，臨床也稱為神經(jīng)性頭痛,指雙側(cè)枕部或全頭部的緊縮性或壓迫性頭痛,多數(shù)為發(fā)作性，也可表現(xiàn)為持續(xù)性鈍疼, 一般可伴有頭昏、失眠、焦慮或(和)抑郁等癥狀，也可出現(xiàn)懼光怕聲、惡心嘔吐等植物神經(jīng)癥狀。本病約占頭痛患者的40%[1]，是臨床常見的原發(fā)性頭痛。近年來其患病率有明顯上升的趨勢，且應激、緊張、抑郁等情緒波動也可加重其癥狀。目前應用的治療藥物雖然有效但有較大的依賴性，甚者還可能造成抑郁障礙、嗜睡等副作用[2]。中醫(yī)藥對于頭痛有著完整的理論體系及豐富的治療經(jīng)驗，總結(jié)出川芎茶調(diào)散、芎芷石膏湯等諸多經(jīng)典方劑，并在臨床上被廣泛應用且療效顯著[3-5]。川芎在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

川芎(LigusticumchuanxiongHort)，別名芎藭、生川軍、香果，為傘形科，阿米芹族，藁本屬[6]，性味辛溫，有“血中之氣藥”之稱，因其善于活血祛風而止頭痛，亦稱之為“諸經(jīng)頭痛要藥”。臨床上更有“頭痛不離川芎”一說，目前已發(fā)現(xiàn)川芎具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、 抗凝血、抗抑郁、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、細胞保護、改善心功能等作用[7]。然而，雖然川芎作為經(jīng)驗用藥在臨床上被廣泛應用于治療頭痛，且效果明顯，但大多數(shù)研究只停留在臨床或動物實驗等宏觀效果,而對于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子水平作用機制等方面尚不明確。本文欲通過中藥網(wǎng)絡藥理學及分子對接，對川芎治療TTH可能的靶點進行數(shù)據(jù)挖掘，解析其對TTH具體的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫中草藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；疾病數(shù)據(jù)庫Genecard(https://www.genecards.org/)；Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)；反向藥效團匹配數(shù)據(jù)庫PharmMapper (http://59.78.98. 102 /pharmmapper/submit_file.php )；蛋白互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫 String (https://string-db. org/cgi/network.pl)；Cytoscape軟件 3.8.0(https://cytoscape.org/)；GO、KEGG 富集分析數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；Venny2.1；Rx64 3.6.0；ChemBio3D Ultra 17.0；RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)；AutodockTools 1.5.6；Free Maestro 11.9。

1.2 篩選川芎的有效活性成分及靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“川芎”為關(guān)鍵詞，挖掘出與川芎有關(guān)的所有活性成分，根據(jù)藥物代謝動力學(ADME-吸收、分布、代謝、排泄)原理，規(guī)定藥物口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18的化合物為川芎的有效活性成分，再通過PharmMapper平臺，檢索出每個活性成分的相關(guān)靶點，然后使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫中記錄的Human的相關(guān)基因，將篩選出的川芎活性成分靶點轉(zhuǎn)換為對應的Gene symbol,為接下來構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡做準備。

1.3 獲取TTH相關(guān)基因，并與川芎活性成分的靶基因做交集處理，構(gòu)建Venn圖以“Tension type headache”為關(guān)鍵詞，檢索Genecard 疾病數(shù)據(jù)庫，獲取相關(guān)疾病基因。將得到的疾病基因與活性成分的靶基因錄入，利用Venny2.1軟件，取兩者交集基因，得到川芎-TTH靶點，并繪制Venn圖。

1.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡將1.2獲得的川芎靶點和1.3獲得的川芎-TTH靶點運用 Cytoscape 軟件進行拓撲計算，得到“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡，不同的節(jié)點分別代表“藥物、活性成分、靶點基因、疾病”，并描述各節(jié)點之間的聯(lián)系。

1.5 構(gòu)建中藥-疾病靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡利用STRING在線軟件將中藥-疾病靶點輸入軟件，以種屬選擇homo sapiens為篩選條件，構(gòu)建川芎-TTH的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡，又稱PPI網(wǎng)絡。最低互動評分設定為0.4。網(wǎng)絡中各節(jié)點度值代表該蛋白在相互作用中的地位，并用柱狀圖直觀表示前25名蛋白及節(jié)點連接數(shù)量，各個節(jié)點互相連接數(shù)量的大小可直接代表其在PPI網(wǎng)絡中的重要程度。

1.6 關(guān)鍵靶點的GO功能和KEGG通路富集分析GO功能富集分析是為了進一步分析中藥化合物的靶點蛋白在基因功能中的作用，并對其差異基因富集在哪些生物學功能、途徑或者細胞定位上有一個粗略了解。KEGG通路富集分析是對基因進行pathway分析，可以了解實驗條件下顯著改變的代謝通路。將“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡中的蛋白利用metascape數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。以P<0.01為標準，并繪制氣泡圖。

1.7 分子對接采用ChemBioDraw Ultra 17.0畫出化合物的結(jié)構(gòu)，然后用ChemBio3D Ultra 17.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，并使用MMFF94力場進行優(yōu)化。靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)從RCSB Protein Data Bank 下載得到，選取各個蛋白三維結(jié)構(gòu)的PDB ID。本研究采用Autodock vina 1.1.2進行分子對接研究。為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness設置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用原始默認數(shù)值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象用Free Maestro 11.9進行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 川芎中有效活性成分篩選通過對TCMSP數(shù)據(jù)庫中川芎所有有效活性成分及其相關(guān)靶點篩選，共搜索到有效成分 189個。以OB≥30%和DL≥0.18為標準進行篩選，共獲得有效成分7個。詳見Tab 1。

Tab 1 Effective active ingredients of Ligusticum Chuanxiong

2.2 獲取有效成分靶點及轉(zhuǎn)換Gene symbol使用PharmMapper平臺，以川芎有效成分的MOLID為關(guān)鍵詞，逐一挖掘有效活性成分的相關(guān)靶點，排除沒有相對應基因和重復存在的靶點，以擬合標準≥0.8為要求，最終獲取川芎有效活性成分作用靶點105個。然后將篩選出來的靶點基因名利用Uniport數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成Gene symbol。

2.3 繪制Venn圖利用 GeneCard 疾病數(shù)據(jù)庫,篩選出TTH相關(guān)的疾病靶點信息，共獲取靶點2 139個，與川芎最終獲得的105個有效活性成分所對應的靶點基因作取交集處理，獲得57個共同基因靶點，為川芎治療TTH的關(guān)鍵靶點。利用Venny2.1軟件繪制Veen圖，如Fig 1。

Fig 1 Veen diagram of key target points

2.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡使用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建川芎治療TTH的“藥物-活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡圖，節(jié)點之間連線表明成分-靶點-通路之間的靶向關(guān)系，連線兩端分別代表著藥物的活性成分和疾病靶點，線條的數(shù)量代表著對應的靶點數(shù)量，連線越多越密集，節(jié)點在網(wǎng)絡中越占據(jù)核心地位。通過網(wǎng)絡圖可知，谷甾醇與疾病靶點之間有1條連線，楊梅酮、洋川芎醌、川芎哚均有5條連線，川芎萘呋內(nèi)酯有12條連線，F(xiàn)A有13條連線，而扁桃醇有16條連線。這表明川芎的7個有效成分均能對疾病靶點產(chǎn)生作用，其中以扁桃醇和川芎萘呋內(nèi)酯與疾病關(guān)系最為密切，在網(wǎng)絡圖中居于核心位置。

2.5 關(guān)鍵靶點蛋白互相作用網(wǎng)絡在String 數(shù)據(jù)庫中以combined_score(關(guān)聯(lián)評分)設定為0.4為標準，得到靶點相互作用網(wǎng)絡圖(Fig 2)，其中“邊”代表作用靶點之間的關(guān)聯(lián)，節(jié)點代表作用靶點。由圖可知，共有54個互相關(guān)聯(lián)的節(jié)點、235條邊，平均節(jié)點度為8.25，平均局部聚類系數(shù)為0.688。在網(wǎng)絡中，鄰接節(jié)點數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大。根據(jù)degree大于中位數(shù)值6，制作前25名的柱狀圖(Fig 3)。對 PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，以BC大于中位數(shù)0.001 666 625，CC大于中位數(shù)0.516 129 032，degree大于2倍中位數(shù)值12，篩選得到ALB、MAPK1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK14、MAPK8、ESR1、PGR、AR、IGF1R、ANXA5、PLG、MMP3、BMP2等15個核心靶點(Tab 2)。其中ALB度值最高，處在核心地位。這些靶點可能在川芎治療TTH中發(fā)揮重要作用。

Tab 2 Topological properties of 15 core targets

Fig 2 Interaction network of key target proteins

Fig 3 Bar chart of node degree value

2.6 GO富集分析基因組中的所有基因都被用作富集背景。收集P<0.01、最小計數(shù)為3、富集系數(shù)為1.5%。GO富集分析得到相關(guān)條目共215條，其中生物學過程(biological process,BP)143條，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、肽基絲氨酸磷酸化、對脂多糖的反應、細胞外結(jié)構(gòu)組織、蛋白質(zhì)定位建立的積極調(diào)控、氮化合物的細胞反應等方面；細胞定位(cellular compon,CC) 23條，主要表現(xiàn)在血液微粒、谷氨酸能突觸、薄膜筏、質(zhì)膜蛋白復合物、軸突等方面；分子功能(molecular function,MF) 49條，主要表現(xiàn)在蛋白激酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、磷酸腺苷激酶活性、α-淀粉酶活性、激活素結(jié)合、胰島素受體結(jié)合等方面。根據(jù)P<0.01，取3個分支各自數(shù)量排名前20位相關(guān)條目信息制作氣泡圖，見Fig 4。

2.7 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析，根據(jù)P<0.01，共獲得68條通路，結(jié)果中主要涉及松弛素信號通路、前列腺癌、粘附結(jié)、孕酮介導的卵母細胞成熟、病毒致癌作用、淀粉和蔗糖代謝、foxo信號通路、白介素-17信號通路、MAPK信號通路、Th17細胞分化等。取前20位信號通路制作氣泡圖，見Fig 4。

2.8 分子對接驗證對篩選得到的7個有效成分和15個核心靶點進行分子對接，配體及蛋白基本信息見Tab 3。為了從分子水平闡明蛋白和化合物的作用模式，將化合物對接至蛋白的活性口袋，其親和力見熱圖(Fig 5)，并取打分較高的結(jié)合較好的蛋白和小分子作圖分析，CASP3-MOL000433、CASP3-MOL002151、MAPK1-MOL000359、MAPK14-MOL002 140,見Fig 6。

MOL000433結(jié)合到CASP3蛋白活性位點，并且和LYS 155、ASN 73、SER 85 3個氨基酸形成氫鍵相互作用，此外與LYS形成一個PI-cation相互作用。MOL002151結(jié)合到CASP3蛋白活性位點，并且和LYS 174和TYR 239兩個氨基酸形成氫鍵相互作用。MOL000359結(jié)合到MAPK1蛋白活性位點，并和MET 108形成氫鍵相互作用。MOL002140結(jié)合到MAPK14蛋白活性位點，并和MET 108形成氫鍵相互作用，此外與TRP 197形成多個PI-PI相互作用和PI-cation相互作用。這些氫鍵相互作用是蛋白和化合物之間最主要的作用力。所有的這些相互作用使得蛋白3CL pro和化合物形成穩(wěn)定的復合物。

總之，分子對接研究表明MOL000433(FA)、MOL002151(洋川芎醌)、MOL000359(谷甾醇)、MOL002140(川芎哚)與靶點蛋白結(jié)合較好，可能是川芎治療TTH過程中發(fā)揮療效的關(guān)鍵成分。

Tab 3 Molecular docking protein information table

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術(shù)初步探討了川芎治療TTH的作用機制，通過活性成分篩選及PPI網(wǎng)絡拓撲分析得出相關(guān)的7個有效成分與15

Fig 5 Molecular docking thermogram

個核心靶點。其中主要活性成分有川芎萘呋內(nèi)酯、楊梅酮、扁桃醇、川芎哚、洋川芎醌、谷甾醇、FA等，涉及 ALB、MAPK1、SRC、EGFR、CASP3、MAPK14、MAPK8、ESR1、PGR、AR、IGF1R、ANXA5、PLG、MMP3、BMP2等15主要靶點。

多數(shù)學者認為緊張型頭痛的發(fā)病與心理壓力、焦慮或(和)抑郁等精神因素、血管痙攣、肌肉緊張等有關(guān)。相關(guān)研究指出,焦慮及抑郁是TTH的常見心理因素,氧化應激與抑郁及(或)焦慮的關(guān)系匪淺,而谷甾醇具有抗氧化作用[8]，可通過氧化應激對抑郁及(或)焦慮的緩解從而達到減輕TTH疼痛的作用。另有實驗證明[9]，川芎在抗抑郁方面有顯著效果。改善腦部循環(huán)，解除血管痙攣同樣可以有效地緩解TTH[10]，而洋川芎醌具有顯著的擴張血管作用[11]，可通過改善腦部灌注, 糾正腦血管痙攣，從而達到治療TTH的作用。川芎哚除了具有通過增加血小板內(nèi)cAMP和cGMP含量、解除血小板聚集等環(huán)節(jié)發(fā)揮抗凝作用，從而達到疏通血管的作用。馬寧寧等[12]實驗研究確定了川芎發(fā)揮抗炎功效的有效成分為其所含有的洋川芎內(nèi)酯，可有效抑制炎性信號的轉(zhuǎn)錄，進而干預其下游因子的表達，并有效發(fā)揮抗炎的作用。孫存霞等[13]亦指出川芎中所含有的洋川芎內(nèi)酯A和洋川芎內(nèi)酯C具有較好的抗炎功效，可用于減輕各種疾病中的炎癥反應，故推測通過減少炎癥因子異常分泌可起到治療TTH的療效。

Fig 6 Molecular docking diagram

PPI網(wǎng)絡結(jié)果顯示，15個核心靶點中以CASP3、MAPK1、MAPK14與川芎有效成分結(jié)合活性最強烈。CASP3是細胞凋亡中關(guān)鍵的蛋白酶，在細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應中處于核心地位。MAPK1是MAPK信號通路中的關(guān)鍵激酶。MAPK1在突觸可塑性、神經(jīng)活動和連接中起著關(guān)鍵作用。此外, MAPK1能通過激活MAPK級聯(lián)反應在缺血神經(jīng)元和完整腦細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用[14]。MAPK14表達異常與炎癥反應密切相關(guān)，當機體受到刺激后，可通過活化MAPK14蛋白來啟動炎癥級聯(lián)反應[15]。MAPK信號通路是細胞內(nèi)信息傳遞的主要信號通路之一，可調(diào)節(jié)細胞多種病理生理過程，其過度激活或表達減少會導致各種疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。松弛素可通過其相應的受體-G蛋白偶聯(lián)受體7和8發(fā)揮舒血管效應[17]，還可通過抑制前纖維化因子, 刺激金屬蛋白酶誘導基質(zhì)降解, 起到抗纖維化作用，從而實現(xiàn)對血管的保護，保證腦部循環(huán)的充盈，以緩解TTH的發(fā)作。白介素-17是一種致炎細胞因子，可通過活化的T細胞產(chǎn)生，并可促進炎性細胞因子的釋放來放大炎癥反應。

綜上所述，本研究以臨床常用藥物-川芎為探討對象，通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接分析，初步論證了川芎主要通過谷甾醇以抗氧化；川芎哚及洋川芎醌以疏通血管；抑制CASP3以實驗細胞保護；調(diào)節(jié)松弛素信號通路以抗纖維化；調(diào)控白介素-17信號通路及MAPK信號通路，作用于MAPK1和MAPK14等靶點以抗炎等可能。提示川芎可能通過抗炎、抗氧化及細胞保護作用對緊張型頭痛發(fā)揮治療作用，為進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。但該研究沒有具體實驗驗證，有效成分的責任靶點及關(guān)鍵療效通路尚不明確，且臨床中川芎多配伍其他藥物使用，其他藥物的作用及相互之間的協(xié)同作用亦需要進一步分析，這也是作者及其團隊接下來研究的一個出發(fā)點。