基于石灰石粉鈣源的微生物固化砂土試驗(yàn)研究

程瑤佳，唐朝生，劉 博，泮曉華，王殿龍，呂 超，李 昊

南京大學(xué) 地球科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023

微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積（Microbial Induced Calcite Precipitation，簡(jiǎn)稱(chēng)MICP）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型土體改良技術(shù)。微生物分泌的脲酶水解尿素產(chǎn)生碳酸根離子，與土體中的鈣離子結(jié)合，生成具有膠結(jié)作用的碳酸鈣，從而粘結(jié)土顆粒，填充土體孔隙，達(dá)到改善土體物理力學(xué)性質(zhì)的目的（Haouzi et al., 2018; Liu et al., 2019; Jiang et al., 2020）。相比于傳統(tǒng)的土體改良技術(shù)，該技術(shù)具有生態(tài)環(huán)保、經(jīng)濟(jì)高效、對(duì)土體擾動(dòng)小的優(yōu)勢(shì)（錢(qián)春香等，2015; 李明東等，2016；Choi et al., 2017）。因此，近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并圍繞改性土體的工程性質(zhì)進(jìn)行了廣泛研究。

微生物固化土體的影響因素眾多，菌液濃度、營(yíng)養(yǎng)液成分、反應(yīng)溫度和pH等對(duì)固化效果的影響不容忽視。梁仕華等（2018）分別選用氯化鈣和硝酸鈣作為營(yíng)養(yǎng)液中的鈣源，發(fā)現(xiàn)硝酸鈣的微生物固化效果較氯化鈣更好。彭劼等（2018）通過(guò)MICP水溶液試驗(yàn)和一維砂柱加固試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在10~30℃范圍內(nèi)，相對(duì)低溫條件下，鈣離子消耗量大，砂柱固化效果更好。李成杰等（2018）探究了氯化鈣、醋酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣四種不同鈣源及Ca2+濃度對(duì)MICP的影響，結(jié)果表明，氯化鈣作為鈣源生成的碳酸鈣晶體最穩(wěn)定，其濃度為0.25 M時(shí)，碳酸鈣沉積效率最高。Jiang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)0.2 M和1.0 M膠結(jié)液濃度條件下，微生物固化砂土邊坡提高其抗侵蝕性的效果最好，而2.0 M的膠結(jié)液改性效果較差。Cheng等（2014）研究不同因素對(duì)微生物固化砂土效果的影響，結(jié)果表明，較高的土體初始干密度，室溫和中性條件下，膠結(jié)的砂柱強(qiáng)度較好。Zhang等（2014）通過(guò)單軸抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)和微觀形態(tài)分析，研究表明，以醋酸鈣作為鈣源比以氯化鈣和硝酸鈣作為鈣源處理的砂柱強(qiáng)度更高，用醋酸鈣處理生成的碳酸鈣晶體類(lèi)型主要為文石，用其他兩種鈣源處理生成的主要為方解石。在微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積過(guò)程中，微生物作為成核位點(diǎn)，吸引大量鈣離子積聚在細(xì)胞表面，使得碳酸鈣沉淀得以產(chǎn)生（Whiffin et al., 2007）。因此，鈣源的種類(lèi)對(duì)微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積的效果有十分重要的影響。

目前，MICP技術(shù)多用鈣鹽（如CaCl2、Ca(NO3)2、Ca(CHCOO)2）等作為鈣源，其中應(yīng)用最廣泛的為CaCl2，其價(jià)格昂貴，具有腐蝕性，且對(duì)環(huán)境有污染（Dejong et al., 2006; Cheng et al., 2014）。因此，尋找一種成本低、污染小的鈣源具有十分重要的意義。石灰石粉是一種廉價(jià)而豐富的材料，可以從廢棄建筑材料和采石場(chǎng)中大量獲得，如能將其成功應(yīng)用于MICP中，將大大節(jié)約成本和提高環(huán)保性（楊華山等，2006；馬燁紅等，2007；劉數(shù)華和閻培渝，2008）。

為此，本文提出利用石灰石粉成為鈣源，用于微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積作用來(lái)固化土體。通過(guò)加入乙酸溶解石灰粉釋放鈣離子，作為微生物固化土體過(guò)程的鈣源。通過(guò)開(kāi)展無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)，微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察、碳酸鈣含量測(cè)定等測(cè)試分析，對(duì)將石灰石作為取鈣源用于微生物固化土體的可行性進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，與氯化鈣和醋酸鈣進(jìn)行對(duì)比，探討不同鈣源對(duì)改性土體力學(xué)特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響，分析其固化機(jī)制和固化效果。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 石灰石粉

本文所用石灰石粉為重質(zhì)碳酸鈣，由天然石灰石磨碎而成。表1為所用石灰石粉成分表，其中碳酸鈣含量達(dá)到98.5%以上。

表1 石灰石粉成分表Table 1 Table of limestone powder composition

1.1.2 砂

本文所用砂為石英質(zhì)河砂，砂的比重為2.65，內(nèi)摩擦角為43°。試驗(yàn)前將砂過(guò)0.25 mm和2 mm篩，經(jīng)過(guò)顆分試驗(yàn)得到砂的不均勻系數(shù)Cu為1.78，曲率系數(shù)Cc為1.05，為級(jí)配不良砂。

1.2 樣品制備與處理

1.2.1 鈣源的提取與制備

鈣離子通過(guò)石灰石粉和乙酸溶液反應(yīng)獲得，其化學(xué)原理見(jiàn)式（1）。為了確定石灰石粉和乙酸溶液反應(yīng)的最優(yōu)配比（w：v），試驗(yàn)共設(shè)置五組1：1、1：2、1：4、1：6和1：8不同配比的反應(yīng)溶液。將20 g石灰石粉分別與不同體積的20%濃度醋酸溶液混合，在室溫（30℃）下反應(yīng)3 d后，對(duì)生成物進(jìn)行過(guò)濾，取上清液，用鈣離子計(jì)測(cè)定其鈣離子濃度。取鈣離子濃度最大時(shí)的配比作為最優(yōu)配比，進(jìn)行后續(xù)鈣離子的提取。之后，參照最優(yōu)配比，將足量的石灰石粉和對(duì)應(yīng)體積的20%濃度醋酸溶液混合。充分反應(yīng)后，取上清液測(cè)定反應(yīng)后的pH，并用250 g/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至6.96，再次測(cè)定溶液的鈣離子濃度。之后，將溶液稀釋至鈣離子濃度為0.5 M，作為最終石灰石粉提取鈣源，以待后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)菌與培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用菌株為巴氏芽孢八疊球菌（Sporosarcina pasteurii, ATCC 11859），購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。該菌為為化能異養(yǎng)型革蘭氏陽(yáng)性菌，產(chǎn)生的脲酶具有較高的活性，其在巖土工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有代表性。試驗(yàn)采用NH4-YE液體培養(yǎng)基，每升（L）含酵母提取物20 g，硫酸銨10 g和三羥甲基氨基甲烷（Tris-base，pH=9.0）15.75 g。培養(yǎng)基配置完成后，在高壓滅菌鍋內(nèi)120 ℃高溫滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻，將菌液以3：100的比例接種至培養(yǎng)基。之后，在30℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中以150轉(zhuǎn)/分的速度震蕩培養(yǎng)24 h。用分光光度計(jì)測(cè)得菌液的OD600值為1.68，同時(shí)用電導(dǎo)率儀測(cè)得其脲酶活性為3.85 mM urea hydrolysed/min。

1.2.3 膠結(jié)液配制

膠結(jié)液包括尿素（0.5 M），鈣源（0.5 M）和營(yíng)養(yǎng)肉湯（3 g/L），主要用于為MICP過(guò)程提供Ca2+和CO32-，以及為細(xì)菌的新陳代謝和生長(zhǎng)繁殖提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。為探究不同鈣源的影響，同時(shí)由于乙酸根離子可以很容易地被自然微生物降解，對(duì)環(huán)境的負(fù)面影響較小。本文采用了醋酸鈣、氯化鈣和石灰石提取鈣源作為鈣源，分別進(jìn)行了試驗(yàn)。

1.2.4 土樣制備

試驗(yàn)所用制備砂柱的模具為高72 mm，直徑36 mm，厚度1 mm的多孔塑料軟管，孔直徑和孔間距均為5 mm，軟管外圍包裹一層紗布以防漏砂。制樣時(shí)，稱(chēng)取一定質(zhì)量的砂裝入模具中，控制砂柱干密度為1.52 g/cm3。在模具底部和頂部分別放置一塊透水石，透水石用紗布包裹，以保證后續(xù)浸泡過(guò)程菌液和膠結(jié)液能夠順利入滲，同時(shí)防止砂顆粒流失，試驗(yàn)砂柱模型如圖1所示。本次試驗(yàn)共制備3組砂柱試樣，每組試樣包含3個(gè)平行樣。

圖1 試驗(yàn)砂柱模型Fig. 1 Sand pillar model of test

1.2.5 MICP處理

將制備好的試樣在菌液中浸沒(méi)30 min，以保證試樣飽和和細(xì)菌充分定植。之后將三組試樣分別轉(zhuǎn)移入石灰石粉提取鈣源、氯化鈣和醋酸鈣三種不同鈣源的膠結(jié)液中，并確保試樣被完全浸沒(méi)，浸泡過(guò)程如圖2所示。在30℃恒溫條件下養(yǎng)護(hù)7 d之后，將試樣取出置于室內(nèi)風(fēng)干15 d直至試樣質(zhì)量不再變化，室內(nèi)溫度控制在30±1℃，相對(duì)濕度控制在50±5%。完成第一輪膠結(jié)后，更換模具外圍和透水石四周的紗布，防止紗布上沉積的碳酸鈣影響后續(xù)溶液的入滲，之后重復(fù)上述步驟，共進(jìn)行3輪膠結(jié)。

圖2 試樣浸泡過(guò)程Fig. 2 Process of sample soaking

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)

為評(píng)價(jià)MICP處理后固化砂柱的力學(xué)特性，對(duì)試樣開(kāi)展無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)。試樣養(yǎng)護(hù)完成后進(jìn)行拆模，并用去離子水清洗試樣以去除殘余鹽分。將試樣放入烘箱烘干后，進(jìn)行無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)。將試樣放在試驗(yàn)機(jī)平臺(tái)上，調(diào)整平臺(tái)位置，使試樣和上部加載板剛好接觸后，開(kāi)始試驗(yàn)，軸向應(yīng)變加載速率為1 mm/min，并記錄量力環(huán)變形和位移值，直到試樣破壞。

1.3.2 碳酸鈣含量測(cè)定試驗(yàn)

用酸洗法測(cè)定試樣碳酸鈣含量，其化學(xué)原理見(jiàn)式（2）。取破壞后未壓碎的砂塊，稱(chēng)其質(zhì)量為m1，用研缽研磨粉碎后，加入燒杯中，為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組選取的砂塊質(zhì)量均為20 g左右。再用5 M的鹽酸溶液浸泡，直至沒(méi)有氣泡產(chǎn)生，視為碳酸鈣完全溶解。將反應(yīng)后的砂樣用去離子水清洗，烘干后，稱(chēng)砂樣質(zhì)量為m2（g）。碳酸鈣含量λ（%）可用式（3）計(jì)算得到。

1.3.3 掃描電鏡試驗(yàn)

為分析試樣的微觀結(jié)構(gòu)特征，對(duì)試樣進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）試驗(yàn)。在對(duì)試樣開(kāi)展無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)后，選取一些典型塊狀樣品用于SEM觀測(cè)。本文選用的掃描電鏡型號(hào)是ZEISS Sigma 500。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣源提取

圖3為在不同石灰石粉和乙酸溶液配比（W：V）下，反應(yīng)后溶液中的鈣離子濃度。從圖中可以看出，在1:1，1:2，1:4和1:6配比下，鈣離子濃度隨著配比的減小而略有減小，但相差不大，基本維持在1.99左右。而在1:8配比下，鈣離子濃度顯著減小，僅為1.41 M，這主要是因?yàn)橐宜崛芤哼^(guò)量，溶液體積增大。為獲得較高的鈣離子濃度，并避免石灰石粉的浪費(fèi)，試驗(yàn)確定1:6的石灰石粉和乙酸溶液配比為最優(yōu)配比，在此配比下進(jìn)行后續(xù)鈣源的提取。

圖3 不同配比（W：V）下反應(yīng)溶液中鈣離子濃度Fig. 3 Concentration of calcium ion in reaction solution under different proportioning (W:V)

2.2 無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度

無(wú)側(cè)限抗壓情況下不同鈣源固化砂柱的應(yīng)力—應(yīng)變曲線見(jiàn)圖4。從圖中可以看出：不同鈣源固化的砂柱表現(xiàn)出了相似的曲線特征，在加載前期，砂柱內(nèi)的孔隙逐漸被壓密，曲線呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)。隨后，應(yīng)力隨應(yīng)變線性快速增加，達(dá)到峰值后，應(yīng)變繼續(xù)增加，應(yīng)力急劇減小到零，呈現(xiàn)典型的脆性破壞模式。

圖4 三組試樣的應(yīng)力-應(yīng)變曲線Fig. 4 Stress-strain curves of three soil samples

圖5展示了不同鈣源固化砂柱的平均無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度。醋酸鈣固化砂柱的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度略高于石灰石粉提取鈣源固化砂柱。而氯化鈣固化砂柱的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度遠(yuǎn)低于前兩者，僅為2.49 MPa，是醋酸鈣固化砂柱的一半。這一研究結(jié)果與Zhang等（2014）的研究結(jié)果一致，即醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源試樣的強(qiáng)度高于氯化鈣試樣的強(qiáng)度。

圖5 三組試樣無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度Fig. 5 Unconfined compression strengths of three soil samples

圖6為不同鈣源固化砂柱的表觀圖和破壞形態(tài)。觀察圖6a、c和e固化砂柱的表觀圖可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的表面較光滑，孔隙少，而氯化鈣固化砂柱的表面較粗糙，可見(jiàn)明顯砂顆粒，孔隙較多。其原因是醋酸鈣和石灰石鈣源條件下產(chǎn)生的碳酸鈣較多，填充了砂柱與模具接觸的孔隙以及表面砂顆粒間的孔隙，因而其強(qiáng)度也更高。從圖6b、f中可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的破壞主要發(fā)生在薄弱區(qū)，而其他部分仍然保持完整，試樣的整體性較高。觀察圖6e，氯化鈣固化砂柱破壞后的殘余砂塊較小，試樣整體發(fā)生破壞。這主要是由于氯化鈣條件下，碳酸鈣產(chǎn)量更小，試樣的強(qiáng)度低，松散度高，完整性差。

圖6 砂柱表觀圖和破壞形態(tài)Fig. 6 Sand column view and damage morphology

2.3 碳酸鈣產(chǎn)量

學(xué)界普遍認(rèn)為，評(píng)價(jià)微生物固化土體效果的重要指標(biāo)之一是微生物誘導(dǎo)生成的碳酸鈣含量。圖7為三組試樣中各個(gè)平行樣的平均碳酸鈣含量。如圖所示，同一組試樣的碳酸鈣相差不大。醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源固化砂柱的平均碳酸鈣含量分別為16.6%和17.1%，二者相差不大，氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣含量最少，僅為13.4%。醋酸鈣和石灰石粉提取鈣源的產(chǎn)量更高，說(shuō)明二者作為鈣源與巴氏芽孢八疊球菌的生物化學(xué)反應(yīng)更加充分。

圖7 三組試樣的碳酸鈣含量Fig. 7 Calcium carbonate content of three soil samples

圖8給出了各組試樣的平均碳酸鈣含量以及無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度。從圖中可以看出，不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量和無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度基本呈正相關(guān)關(guān)系，這與以往的研究結(jié)果相似（Cheng et al., 2014; 梁仕華等，2018）。

圖8 不同鈣源對(duì)碳酸鈣含量和無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度的影響Fig. 8 Influence of different calcium on calcium carbonate content and unconfined compression strengths

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

為探究不同鈣源對(duì)微生物固化砂柱微觀結(jié)構(gòu)的影響，選取試樣的SEM圖像進(jìn)行分析，如圖9所示。觀察30倍放大條件下的SEM圖像可以看出，醋酸鈣固化砂柱中砂土顆粒的表面和接觸點(diǎn)間均沉積大量碳酸鈣，土體結(jié)構(gòu)較致密。碳酸鈣主要通過(guò)沉積在砂土顆粒接觸點(diǎn)之間，聯(lián)結(jié)相鄰的土顆粒，從而促進(jìn)土顆粒的膠結(jié)，土體完整性上升，強(qiáng)度提高（Van Paassen et al., 2009; Soon et al., 2013, 2014; Cheng et al., 2016; 季斌等, 2017）。而氯化鈣作為鈣源固化的砂柱中，砂土顆粒表面和孔隙間沉積的碳酸鈣較醋酸鈣少，存在更多的土顆粒接觸處以及土顆粒表面未被碳酸鈣覆蓋。石灰石鈣源固化砂柱中，砂土顆粒表面和顆粒之間亦形成了大量的碳酸鈣沉積。

圖9 不同鈣源在不同放大倍數(shù)下的SEM圖像Fig. 9 SEM photos of of different calcium sources at different magnification

從200~1000倍放大條件下的SEM圖像中可以看出，以醋酸鈣作為鈣源，利用巴氏芽孢桿菌誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體主要為薄片狀堆疊的方解石。氯化鈣誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體主要為六面體狀的方解石。利用石灰石鈣源誘導(dǎo)生成的晶體亦為薄片狀堆疊的方解石型碳酸鈣，但其尺寸和致密性略小于醋酸鈣誘導(dǎo)生成的碳酸鈣晶體。

對(duì)石灰石鈣源固化砂柱試樣的位置1和位置2（圖9）進(jìn)行EDS元素分析，試驗(yàn)結(jié)果如圖10所示。位置1的主要元素為O、Si和C（圖10a），這主要是由于該處位置為砂土顆粒以及少量CH3COO-。位置2的主要元素為O、C和Ca，驗(yàn)證了該位置處大量碳酸鈣沉淀的存在。

圖10 石灰石鈣源固化砂柱試樣的EDS圖Fig. 10 EDS photos of sand column sample treated by calcium source from limestone

從以上結(jié)果可以看出，醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的性質(zhì)類(lèi)似。這是由于利用石灰石粉提取鈣源過(guò)程中使用的是醋酸提取石灰石粉中的鈣離子，生成的鈣源主要為醋酸鈣，故二者性質(zhì)類(lèi)似。而醋酸鈣和氯化鈣誘導(dǎo)生成不同的形狀的方解石型碳酸鈣，這是因?yàn)槲⑸镎T導(dǎo)碳酸鈣沉積過(guò)程中，鈣源作為重要的反應(yīng)物，對(duì)于生成的碳酸鈣晶體形貌有一定的影響（李沛豪等，2010; Liu et al., 2017）。由此可見(jiàn)，不同的鈣源主要通過(guò)影響微生物成礦過(guò)程的晶型晶貌、晶體含量、晶體分布及膠結(jié)特征來(lái)改變固化效果。

3 結(jié)論

本文將石灰石粉提取鈣源用于微生物固化土體反應(yīng)，通過(guò)開(kāi)展無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度試驗(yàn)，對(duì)石灰石鈣源固化砂柱的力學(xué)特性進(jìn)行研究，并與醋酸鈣和氯化鈣鈣源進(jìn)行對(duì)比，結(jié)合不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣產(chǎn)量和微觀結(jié)構(gòu)的分析，得到以下主要結(jié)論：

（1）將石灰石粉提取鈣源用于微生物誘導(dǎo)碳酸鈣固化土體是可行的，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的鈣源，固化砂柱的強(qiáng)度和碳酸鈣含量較高，結(jié)構(gòu)致密，完整性高。

（2）不同鈣源固化砂柱的力學(xué)特性不同。三者均呈典型的脆性破壞模式，但醋酸鈣固化砂柱的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度略高于石灰石鈣源固化砂柱，而氯化鈣固化砂柱的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度遠(yuǎn)低于前兩者。氯化鈣固化砂柱破壞后的完整性低于其他兩者。

（3）不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量不同。醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量相差不大，氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣含量更少。不同鈣源固化砂柱的碳酸鈣含量和無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度基本呈正相關(guān)關(guān)系。

（4）醋酸鈣和石灰石鈣源固化砂柱中砂土顆粒的表面和接觸點(diǎn)間均沉積大量碳酸鈣，碳酸鈣晶體主要為薄片狀堆疊的方解石。氯化鈣固化砂柱中碳酸鈣沉積量低于前兩者，碳酸鈣晶體主要為六面體狀的方解石。

（5）不同的鈣源主要通過(guò)影響微生物成礦過(guò)程的晶型晶貌、晶體含量、晶體分布及膠結(jié)特征來(lái)改變固化效果。