非生物脅迫處理后擬南芥過氧化氫含量變化的分析

楊麗萍，韓 晗，石 淼，閔 菲，丁曉月，金太成

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

植物的生長(zhǎng)發(fā)育隨著環(huán)境的變化而變化，不良的生存環(huán)境會(huì)嚴(yán)重限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育.而這種環(huán)境的限制被稱為環(huán)境脅迫，它從概念上可以分為生物脅迫和非生物脅迫[1].其中生物脅迫包括各種病原體支原體對(duì)植物的感染侵害、食草類動(dòng)物對(duì)植物的入侵等[2].而非生物脅迫根據(jù)外界環(huán)境條件因素的改變可以分為干旱脅迫、鹽脅迫、低溫脅迫、熱脅迫與重金屬污染等[3].生物脅迫和非生物脅迫嚴(yán)重影響了植物已經(jīng)建立的抗逆體系，擾亂了植物的正常代謝，有些脅迫甚至?xí)霈F(xiàn)敗育現(xiàn)象，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量[4].

植物細(xì)胞每時(shí)每刻都在進(jìn)行有氧的生命活動(dòng)，在這個(gè)過程中會(huì)產(chǎn)生一類代謝副產(chǎn)物，它們統(tǒng)稱為活性氧.過氧化氫(H2O2)是植物體內(nèi)中以最穩(wěn)定形式存在的活性氧之一，并且它還參與了體內(nèi)外光合作用時(shí)電子的傳遞[5].植物在非生物脅迫條件下過氧化氫含量急劇升高，導(dǎo)致脅迫信號(hào)途徑傳遞加強(qiáng)，植物抵抗非生物脅迫能力增強(qiáng)[6].活性氧包括H2O2和單線態(tài)氧(1O2)[7-9].因此，可以通過檢測(cè)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化，推斷植物中活性氧含量的變化[10].

本實(shí)驗(yàn)對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型Col-0進(jìn)行干旱、低溫和鹽脅迫處理，并通過對(duì)未處理的Col-0和三種非生物脅迫處理的Col-0進(jìn)行H2O2含量的測(cè)定.結(jié)果表明，非生物脅迫處理后Col-0中過氧化氫含量有顯著增加，為深入研究植物應(yīng)答非生物脅迫的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究使用擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態(tài)型Col-0.

1.2 植物材料播種

用新配置體積濃度為30%的84消毒液對(duì)野生型擬南芥(Col-0)種子消毒8 min，然后分別使用新配置75%的酒精和高溫滅菌后的蒸餾水沖洗2—3次，然后播種到MS培養(yǎng)基上用封口膜封好培養(yǎng)皿，最后放置到冰箱4 ℃春化2 d；2 d后放置到25 ℃恒溫培養(yǎng)房，14 d后將擬南芥移栽至滅菌土中.

1.3 植物材料處理

我們對(duì)擬南芥(Col-0)進(jìn)行干旱、鹽、低溫處理，同時(shí)選取相同苗齡的野生型擬南芥作為對(duì)照.干旱處理：選取長(zhǎng)勢(shì)相同的擬南芥(Col-0)作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行缺水處理7～10 d，對(duì)照組的Col-0持續(xù)正常澆水，連續(xù)缺水處理7～10 d.鹽處理：對(duì)擬南芥(Col-0)澆灌150 mmol/L的NaCl溶液，連續(xù)鹽處理3 d，對(duì)照組Col-0正常澆水.低溫處理：擬南芥Col-0放置于4 ℃條件下低溫處理24 h，對(duì)照組Col-0放在 25 ℃恒溫光照培養(yǎng)室中培養(yǎng).

1.4 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

H2O2測(cè)試盒(分光光度法)；PBS(pH=7.4)緩沖液；考馬斯亮藍(lán)；牛血清蛋白.

1.5 主要儀器設(shè)備

HC-2518高速冷凍離心機(jī)；WHY-2型水浴恒溫振蕩器；DG-800漩渦混合器；紫外分光光度計(jì)；研磨機(jī)等.

1.6 組織中H2O2的測(cè)定

1.6.1 樣本前處理

稱取0.3 g擬南芥葉片，放入提前用液氮預(yù)冷好的研缽中手動(dòng)迅速研磨直至將植物材料完全破碎，然后加入0.1 mol/L PBS緩沖液(pH=7.4)2.7 mL，在4 ℃的條件下高速離心10 min，最后用1 mL移液槍吸取0.3 mL的上清液.

1.6.2 操作步驟

需要準(zhǔn)備3個(gè)5 mL玻璃試管，分別標(biāo)注為空白對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)滴定管和樣本測(cè)定管.然后分別向3支試管中加入1 mL試劑一(37 ℃的水浴鍋預(yù)熱10 min)；向空白對(duì)照管加0.3 mL去離子水(ddH2O)，向標(biāo)準(zhǔn)滴定管加入0.3 mL標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液，樣本測(cè)定管中和0.3 mL上清液；混勻后分別向三支試管中加入1 mL 的試劑二，立刻手動(dòng)搖勻，并迅速用紫外分光光度計(jì)于405 nm處測(cè)各管吸光度，用雙蒸水調(diào)零.最后將剩余的葉片用紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)組織均漿蛋白濃度和勻漿蛋白含量.

1.6.3 計(jì)算公式

Cpr：組織勻漿蛋白質(zhì)量濃度(g/L).

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示；用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件Prism進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析；用Prism軟件制作柱狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 非生物脅迫處理擬南芥表型

由于鹽處理與低溫處理時(shí)間較短，并未觀察到實(shí)驗(yàn)組擬南芥(Arabidopsisthaliana)形態(tài)及表型發(fā)生明顯變化.我們以干旱處理的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為主，進(jìn)行表型分析.未處理的擬南芥(Col-0)作為對(duì)照植株(圖1(A))，實(shí)驗(yàn)組擬南芥(Col-0)干旱處理4 d(圖1(B))，擬南芥植株受干旱影響逐漸開始顯現(xiàn)，擬南芥少數(shù)葉片邊緣出現(xiàn)輕微黃化現(xiàn)象；葉片有少量花青素積累；干旱處理7 d(圖1(C))，擬南芥葉片邊緣開始向內(nèi)卷曲變形，部分葉片干枯，花青素積累明顯增加；隨著干旱處理時(shí)間延長(zhǎng)，10 d時(shí)，擬南芥葉片邊緣向內(nèi)卷曲變形情況加劇，葉片嚴(yán)重黃化、萎蔫甚至死亡，花青素積累大大增加(圖1(D)).

(A)擬南芥(Col-0)；(B)干旱4 d擬南芥；(C)干旱7 d擬南芥；(D)干旱10 d擬南芥圖1 野生型擬南芥和干旱處理擬南芥表型差異Fig.1 Phenotypic differences between wild-type Arabidopsis and drought-treated Arabidopsis

2.2 H2O2含量變化

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)擬南芥H2O2含量進(jìn)行檢測(cè)，以未處理的野生型擬南芥(Col-0)作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽脅迫(150 mmol/L的NaCl溶液)鹽處理3 d后的擬南芥(Col-0)中H2O2含量成倍數(shù)增加(P<0.05)；干旱脅迫(缺水處理7～10 d)后的10 株Col-0中H2O2含量大幅增加 (P<0.05)；4 ℃低溫處理24 h的擬南芥中 H2O2含量顯著上升 (P<0.05)(見圖2).

圖2 干旱、低溫和鹽脅迫處理后擬南芥中H2O2含量變化Fig.2 Changes of H2O2 content in Arabidopsis thaliana after drought，low temperature and salt stress

3 討論

全球糧食產(chǎn)量的減少是由于干旱、鹽脅迫、低溫脅迫以及金屬離子污染等非生物脅迫的干擾導(dǎo)致[11].如今，隨著氣候環(huán)境越來越惡劣，極端天氣情況更加頻繁，非生物脅迫對(duì)植物的迫害更加嚴(yán)重[12].非生物脅迫會(huì)影響植物的一系列形態(tài)、生理、生化和分子變化，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[13].極端的環(huán)境刺激可以導(dǎo)致植物有過量的活性氧(ROS)積累，并通過一系列的氧化還原使植物代謝通路受損[7].根據(jù)已有的研究表明，在非生物脅迫條件下H2O2是相對(duì)穩(wěn)定的一類活性氧分子，它的含量變化嚴(yán)重影響著脅迫信號(hào)的傳遞[14-15]；在植物自然生長(zhǎng)發(fā)育這一生理過程中，H2O2扮演著重要的角色.如果植物對(duì)H2O2免疫，那么植物對(duì)非生物脅迫的抗性將會(huì)大大的增強(qiáng)[16].

本研究測(cè)定了干旱、低溫和鹽處理三種非生物脅迫處理的擬南芥(Col-0)與未處理擬南芥Col-0之間的H2O2含量變化，結(jié)果表明：非生物脅迫處理后擬南芥中H2O2含量顯著上升，其中鹽脅迫和低溫脅迫H2O2含量成倍增長(zhǎng)，干旱脅迫后H2O2含量也顯著增加.說明在非生物脅迫條件下，植物的過氧化氫含量迅速積累，對(duì)植物細(xì)胞會(huì)造成一定的傷害甚至死亡.根據(jù)已有研究表明，非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的DNA甲基化和去甲基化水平，甲基化水平的高低嚴(yán)重影響著植物對(duì)脅迫環(huán)境的抗性[17].本研究能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究植物通過信號(hào)分子激活植物響應(yīng)基因表達(dá)的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù).