張新圖,肖輝
(1.湖南中醫(yī)藥高等專科學校附屬第一醫(yī)院/湖南省直中醫(yī)醫(yī)院藥學部,湖南 株洲 412000;2.湖南中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥學部,湖南 長沙 410007)
心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)是伴隨于缺血性心臟病的病理生理過程,其受損程度可影響病情的預后,當前臨床上尚缺乏針對心肌缺血再灌注損傷的有效治療手段。雷帕霉素(rapamycin)為新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,常用于治療自身免疫性疾病及器官移植排斥反應[1,2];近年有報道稱,雷帕霉素對心肌缺血再灌注損傷動物具有保護作用[3]。本研究通過制備心肌缺血再灌注損傷大鼠模型,進一步探索雷帕霉素的心肌保護作用機制。
SD 大鼠,清潔級,♀♂各半,體重(180±20)g,由武漢生物制品研究所有限責任公司實驗動物室提供,所有動物相關操作均經(jīng)本單位動物倫理委員會批準。
雷帕霉素,美國Sigma 公司,臨用前用0.5% 羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium salt, CMC-Na) 配制。氯化硝基四氮唑藍(nitro blue tetrazolium chloride, NBT)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 試劑盒,南京建成生物工程研究所。細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)多克隆抗體及免疫組織化學試劑盒,上海哈靈生物科技有限公司。
生物顯微鏡,日本Olympus 公司;自動勻漿機,金瑞鴻捷公司;冷凍離心機,德國Hettich 公司;醫(yī)學影像分析系統(tǒng),北京眾實迪創(chuàng)公司;紫外可見分光光度計,美國Thermo 公司;十二導聯(lián)心電圖機,日本Nihon 公司;小動物人工呼吸機,安徽正華公司。
參照文獻[4],行冠脈結(jié)扎術(shù)。簡言之,大鼠以戊巴比妥鈉麻醉,仰位固定于手術(shù)臺,頸部備皮、分離氣管,連接小動物人工呼吸機以輔助呼吸,四肢連接十二導聯(lián)心電圖機以監(jiān)測心電圖;將左胸第3、4 肋骨處備皮、分離筋肉,將肋骨間隙撐大以暴露心臟,取縫合線穿過左冠脈前降支的起始部,于縫合線和冠脈間墊一軟管,將縫合線結(jié)扎以使心肌進入缺血狀態(tài),最后將心臟納回原處;約30min 左右可見心電圖ST 段或T 波明顯抬高,繼而松開冠脈結(jié)扎處再灌注2h,可見抬高的ST 段或T 波明顯下降。假手術(shù)組大鼠開胸但不結(jié)扎冠脈,余操作同上。
將30 只大鼠隨機分3 組(n=10):模型組(等體積溶媒)、雷帕霉素組(5mg/kg)、假手術(shù)組(等體積溶媒)。造模前1 周開始灌胃給藥(體積按10 mL/kg),每天1 次。
再灌注結(jié)束后,動物處死,取心臟,清洗后,從心尖起將左心室平行切片,置于0.1% NBT 染色液15min,拍攝圖像并通過ImagePro 軟件分別測量心肌梗死區(qū)面積和心室總面積,計算心肌梗死率(%)。
取部分洗凈的心臟,勻漿,低溫離心10min(3500r/min)后取上清,上紫外可見分光光度計比色法測定光密度(OD)值,并按說明書規(guī)程計算MPO 活力(U/g)。
取部分洗凈的心臟,固定于4%多聚甲醛液,按免疫組化說明書規(guī)程,常規(guī)脫水、包埋、切片、封片,采集圖像,導入醫(yī)學影像系統(tǒng)進行分析,ICAM-1 陽性表達以積分光密度(IOD)值表示。
假手術(shù)組大鼠心肌未見梗死,模型組心肌梗死率37.92%,雷帕霉素組可使心肌梗死率降低至31.99%,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。
圖1 各組大鼠心肌梗死率比較(± s, n = 10)
模型組動物心肌MPO 活力顯著升高至425.70 U/g,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);雷帕霉素組心肌MPO活力明顯降低至332.69 U/g,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示雷帕霉素可減輕中性粒細胞浸潤程度,見圖2。
圖2 各組大鼠心肌MPO 活力比較(± s, n = 10)
假手術(shù)組心肌組織ICAM-1 表達極低,模型組動物心肌 組 織ICAM-1 表 達 則 明 顯 升 高(IOD 值:24.93 ± 4.98),組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,雷帕霉素組可顯著降低心肌組織ICAM-1 表達(IOD 值:17.06 ±4.17)(P<0.01),見圖3。
圖3 各組大鼠心肌ICAM-1 表達比較(±s, n = 10)
心肌缺血再灌注損傷仍缺乏行之有效的防治方法,目前其治療措施主要有:①模擬內(nèi)源性保護劑;②清除氧自由基;③抗細胞凋亡;④減輕細胞內(nèi)Ca2+超載;⑤抑制炎癥反應;⑥缺血預處理(ischemic preconditioning,IP)等。缺血預處理使人們對器官保護產(chǎn)生了新的認識,但往往因倫理問題而難以在臨床上推廣開來。近年來有學者提出藥物預處理(pharmacological preconditioning,PP)的新策略,通過藥物預處理,提前激活內(nèi)源性保護途徑,抑制機體內(nèi)源性毒性物質(zhì)的產(chǎn)生,阻斷繼發(fā)性損傷的級聯(lián)反應,或促進機體釋放生物活性物質(zhì),以增強心肌對缺血再灌注損傷的耐受[5,6],這對探索心肌缺血再灌注損傷的臨床治療方法具有重要意義。本研究采用心肌缺血再灌注損傷發(fā)生前1 周口服雷帕霉素的預處理方式,結(jié)果表明雷帕霉素能顯著降低心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死率,提示雷帕霉素具有心肌保護作用。
炎癥反應是缺血再灌注引發(fā)間接損傷的重要病理特點之一,主要表現(xiàn)為炎癥細胞( 如中性粒細胞) 聚集浸潤、多種炎性細胞因子和黏附分子過度表達等[7];抑制炎癥反應可能成為防治心肌缺血再灌注損傷的有效手段[8]。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時炎癥細胞因子被激活,誘導大量的炎性細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞,進而促使蛋白水解酶、氧自由基、收縮血管因子等參與心肌缺血再灌注損傷進程,缺血區(qū)的炎癥細胞則同時分泌大量的細胞因子及炎癥介質(zhì),如白介素(interleukin)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B)、MPO 等,這些因子誘導缺血區(qū)內(nèi)皮細胞表達更多的細胞間黏附分子1(ICAM-1)、P 選擇素及E 選擇素等,進而介導中性粒細胞黏附于內(nèi)皮細胞并浸潤到心肌組織,既可影響凝血系統(tǒng)減少血供,又可釋放蛋白水解酶破壞血管壁的完整性,造成心肌細胞受損或其功能降低[9-11]。研究證實,大鼠缺血心肌組織中性粒細胞數(shù)量明顯比正常心肌組織高,并可在再灌注2 h 時達到最高點[12];而抑制中性粒細胞活化及浸潤則可減輕心肌受損程度[13]。本研究結(jié)果表明,再灌注2 h 后中性粒細胞標志物MPO 酶活力明顯增高,提示中性粒細胞的浸潤嚴重,雷帕霉素預處理可使心肌MPO 酶活力顯著降低(P<0.01),表明雷帕霉素可通過減少中性粒細胞活化,抑制其浸潤,實現(xiàn)心肌保護作用。
黏附分子ICAM-1 為免疫球蛋白超家族成員之一,又稱CD54,體內(nèi)存在于多種細胞表面,介導細胞間的黏附作用;ICAM-1 在正常心肌細胞表面僅有微量表達,當心肌缺血再灌注發(fā)生時在細胞因子(NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α 等)的誘導下會過量表達,與淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1) 及巨噬細胞活化趨化因子-1(Macrophage activation chemokine 1)結(jié)合,參與炎癥級聯(lián)反應[14]。在ICAM-1 介導下,可促使血液中白細胞激活和血管內(nèi)皮細胞活化,大量白細胞遷移、積聚到心肌缺血區(qū),進而與血管內(nèi)皮細胞黏附,這些白細胞可活化血小板及凝血系統(tǒng),引起血栓形成和微循環(huán)不暢,減少缺血區(qū)的血供;同時本身又會釋放多種蛋白水解酶、過氧化物、炎癥介質(zhì)等,蛋白水解酶可解離血管內(nèi)皮細胞和基底膜細胞,破壞血管壁的完整性,使炎癥細胞容易通過并聚集到缺血區(qū),過氧化物和炎癥介質(zhì)可進一步損傷心肌細胞,造成心肌缺血再灌注損傷的加重[15]。據(jù)報道,實驗動物心肌組織中性粒細胞浸潤數(shù)量與ICAM-1的表達呈現(xiàn)顯著的正相關[16]。本研究結(jié)果表明,再灌注2 h后心肌ICAM-1 表達明顯增高,提示ICAM-1 的高表達參與了缺血再灌注損傷的病理進程,這與上述報道結(jié)果類似;雷帕霉素組心肌ICAM-1 表達明顯降低(P<0.01),提示雷帕霉素可通過抑制ICAM-1 表達,減少中性粒細胞等炎性細胞在缺血區(qū)的黏附及浸潤,緩解了心肌缺血區(qū)的炎癥反應。
總之,雷帕霉素預處理可保護心肌缺血再灌注損傷大鼠的受損心肌組織,其作用機制可能與減少中性粒細胞浸潤、抑制黏附分子ICAM-1 高表達、緩解炎癥反應等有關。