基于生物信息基因表達(dá)譜的乳腺癌轉(zhuǎn)移基因標(biāo)志物的分析研究

吳奇橋 張樹民 鄭婷婷 劉 娟 胡 永 林登強(qiáng) 戴夢婷 孫 菁▲

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院放療科，福建廈門 361006；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放療科，上海 200030；3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院放射科，福建廈門 361006；4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院泌尿外科，福建廈門 361006

乳腺癌是威脅女性健康的最常見惡性腫瘤，是美國第二大最常見的癌癥相關(guān)死亡[1]。乳腺原位癌通常具有良好的預(yù)后，然而，乳腺癌若出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移往往會導(dǎo)致危及生命的結(jié)果[2]。總體而言，乳腺癌的5年平均生存率為90%，但如果存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則降至26%[3]。

乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制尚未完全了解。鑒于其高死亡率，迫切需要弄清乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制。既往的研究已經(jīng)調(diào)查乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因，如Chen 等[4]揭示了ECM-受體相互作用可能有助于乳癌骨轉(zhuǎn)移；Cai 等[5]表明CDCA8、CCNA2 與乳癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)；Zheng 等[6]鑒定了幾種與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。然而上述研究僅對單個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，目前仍然沒有研究結(jié)合相似數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因分析。本研究分析了三個(gè)數(shù)據(jù)集中與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），目的是更好地了解潛在乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并找到潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

GSE32489、GSE14776 和GSE103357[7]使 用 基 因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）得到的三個(gè)基因數(shù)據(jù)集，均使用Illumina HumanRef 平臺芯片，根據(jù)平臺中的注釋信息將探針轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的基因符號。GSE32489包含非轉(zhuǎn)移尸檢組織19 個(gè)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織90 個(gè)。GSE14776 包含8 個(gè)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞樣本和6 個(gè)骨轉(zhuǎn)移樣本。GSE103357 包含2 個(gè)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞樣本和3 個(gè)骨轉(zhuǎn)移樣本。

1.2 DEGs 的鑒定

Network Analyst（版本號：10.0）[8-9]（http://www.networkanalyst.ca）用于提取數(shù)據(jù)集乳腺腫瘤樣本和轉(zhuǎn)移樣本之間的DEGs。具有調(diào)整P 值<0.05 和|log2FC|>1.0的基因被認(rèn)為是DEGs。通過維恩（Venn）工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）檢測重疊以得到共差異表達(dá)的基因（co different-expressed genes，Co-DEGs）。調(diào)整P 值、Benjamini 和Hochberg 假陽性發(fā)現(xiàn)率，用于在統(tǒng)計(jì)顯著基因的發(fā)現(xiàn)和假陽性之間提供平衡。沒有相應(yīng)基因符號的探針組或具有多于一個(gè)探針組的基因被去除。識錯(cuò)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）的計(jì)算公式如下：q-value（i）=p（i）length（p）/rank（p），表明當(dāng)樣本量增大時(shí)，檢出假陽性率的概率增高，F(xiàn)DR 值越高，表明大樣本數(shù)據(jù)富集后出現(xiàn)的假陽性概率越高。

1.3 基因本體和京都基因與基因組百科全書途徑富集通路分析

基因本體（gene ontology，GO）分析用于對基因集進(jìn)行功能研究[10]。京都基因與基因組百科全書途徑富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）[11]是處理基因組和生物通路的數(shù)據(jù)庫集合。注釋可視化和 集 成 發(fā) 現(xiàn) 數(shù) 據(jù) 庫（DAVID，http://david.ncifcrf.gov）（6.8 版）[12]用于解開已識別共基因的GO 和KEGG 途徑。

1.4 DEGs 和模塊選擇的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)分析

STRING（版本號：11.5）用于闡明蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互（protein-protein interaction，PPI）相互作用[13]。使用Cytoscape（版本號：3.8.2）[14]進(jìn)行可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)。選擇>0.4 的組合分?jǐn)?shù)作為閾值。PPI 網(wǎng)絡(luò)可以協(xié)助從蛋白層面識別參與乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要基因模塊。此外，應(yīng)用分子模塊檢測（molecular complex detection，MCODE）[15]插件對重要模塊進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 核心基因的熱圖繪制、GO 和臨床分析

使用cytoHubba（版本號：3.8.2）插件和最大集團(tuán)中心性（maximum group centrality，MCC）方法來識別前20 個(gè)中樞基因。核心基因的熱圖是通過使用R 中的熱圖包繪制的，使用的聚類方法為離差平和法（Ward），標(biāo)準(zhǔn)化方法為正態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化（Z-score scaling）。使用Kaplan Meier-plotter（KM plotter，http://kmplot.com/analysis/）實(shí)現(xiàn)生存分析，Kaplan-Meier plotter 是一種生存分析軟件[16]。通過Cytoscape 的BiNGO 插件（版本號：3.8.2）評估核心基因的GO 功能。

1.6 DEG 的生存分析

乳腺癌患者根據(jù)特定基因的表達(dá)分為兩組（高表達(dá)與低表達(dá)）。通過Kaplan-Meier 生存圖比較兩個(gè)組患者的隊(duì)列，并計(jì)算具有95%置信區(qū)間和對數(shù)等級P 值的風(fēng)險(xiǎn)比（HR），其中，HR=1 意味著基因低表達(dá)與高表達(dá)的等效性，若低表達(dá)處理優(yōu)于高表達(dá)，則HR<1；若低表達(dá)處理劣于高表達(dá)，則HR>1。GEPIA[17]是基于TCGA 數(shù)據(jù)庫的在線基因表達(dá)譜分析工具，用于驗(yàn)證樞紐基因與臨床分期之間的相關(guān)性，其中，F(xiàn) value 代表單因素分析的F 值，這個(gè)值越大，表示組間差異越大，且當(dāng)P<0.05 時(shí)，表示該基因在腫瘤不同分期中差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

2 結(jié)果

2.1 三個(gè)基因數(shù)據(jù)集中DEG 和co-DEG 的鑒定

三個(gè)基因數(shù)據(jù)集中，韋恩圖見圖1A 及圖1B，基因表達(dá)熱圖見圖1C。結(jié)果顯示，295 個(gè)基因被鑒定為co-DEGs。其中上調(diào)151 個(gè)，下調(diào)144 個(gè)。調(diào)整P<0.05和|log2FC|>1 被設(shè)置為截止標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 維恩圖及基因熱圖

2.2 DEGs 的GO 富集分析及KEGG 通路分析

DAVID 在線工具用于闡明富集的co-DEGs 中的GO 和KEGG 通路。結(jié)果表明，對于BP，上調(diào)的基因主要富集在Ⅰ型干擾素信號通路、凋亡過程中，而下調(diào)的基因主要集中在DNA 修復(fù)、先天免疫反應(yīng)等方面。KEGG 通路結(jié)果顯示，DEGs 顯著富集在與癌癥發(fā)展的信號通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號通路和Rap1 信號通路（表1～2）。

表1 Co-DEGs 中上調(diào)基因的GO 分析

2.3 DEGs 和模塊選擇的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

基于STRING 數(shù)據(jù)庫得到PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，見圖2A，結(jié)果顯示，DEG 的PPI 網(wǎng)絡(luò)由280 個(gè)節(jié)點(diǎn)和357 條邊構(gòu)成。使用MCC 方法，總共選擇了20 個(gè)基因作為樞紐基因，分別為：CHEK1、POLR3H、IFITM1、XAF1、MCM5、ADCY3、ADCY6、KIF14、ADCY7、ADCY2、IFITM3、TYMS、IFI6、CDCA8、TIMP1、STAT2、SKA1、PKM、MX1、PRC1（ASE1）。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和樞紐基因的鑒定結(jié)果

表2 Co-DEGs 中下調(diào)基因的GO 分析

樞紐基因的鑒定結(jié)果見圖2B，結(jié)果顯示，使用MCODE 從DEG 的PPI 網(wǎng)絡(luò)中獲得了3 個(gè)分值大于或等于6 的重要模塊。

2.4 中樞基因的生存分析

根據(jù)每個(gè)基因的表達(dá)，繪制乳癌患者的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存（distance metastasis free survival，DMFS）和總生存（overall survival，OS）曲線，結(jié)果分別見圖3A 和圖3B。結(jié)果顯示，TYMS 的低表達(dá)[HR=0.52（0.29～0.91），P=0.021]、SKA1 的低表達(dá)[HR=0.57（0.32～1.01），P=0.049]、ADCY7 的低表達(dá)[HR=0.45（0.30～0.68），P<0.001]、MX1 的高表達(dá)[HR=2.07（1.17～3.66），P=0.011]與較差的OS 相關(guān)（圖3A）。POLR3H 的低表達(dá)[HR=0.71（0.51～0.98），P=0.039]、CDCA8 的高表達(dá)[HR=1.67（1.37～2.04），P<0.001]、ASE1 的高表達(dá)[HR=2.1（1.72～2.57），P<0.001]、KIF14 的高表達(dá)[HR=1.86（1.33～2.59），P<0.001]、MX1 的高表達(dá)[HR=1.31（1.08～1.6），P=0.006]與較差的DMFS 相關(guān)（圖3B）。

圖3 樞紐基因的臨床分析

選擇數(shù)據(jù)集TCGA-BRCA 來驗(yàn)證20 個(gè)核心基因與乳腺癌臨床分期之間的相關(guān)性。筆者比較了不同臨床分期乳腺癌樣本中核心基因的表達(dá)，結(jié)果見圖3C，結(jié)果顯示，在乳腺癌較晚分期中，TYMS 呈現(xiàn)低表達(dá)（P=0.0416），CDCA8 呈現(xiàn)高表達(dá)（P=0.003 66），PRC1（ASE1）呈現(xiàn)高表達(dá)（P=0.002 07），SKA1（P=0.000 909）呈現(xiàn)低表達(dá)，KIF14（P=0.000 711）呈現(xiàn)高表達(dá)。

3 討論

本研究中分析了三個(gè)包含乳腺癌轉(zhuǎn)移患者的基因數(shù)據(jù)集，進(jìn)行了功能富集分析，表明了樞紐基因通過某些途徑在轉(zhuǎn)移的進(jìn)展中發(fā)揮了作用。

結(jié)果表明，上調(diào)基因主要參與Ⅰ型干擾素信號通路、凋亡過程、粘著斑、蛋白質(zhì)同二聚化活性Rap1 信號通路[18]和MAPK 信號通路[19-21]，抗原加工和呈遞，細(xì)胞粘附分子，而下調(diào)基因主要富集在p53 類介質(zhì)、雌激素信號通路和趨化因子信號通路。這些發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的研究[19-29]高度一致，表明細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和粘附在乳腺癌進(jìn)展過程中的重要作用。

先前的研究[19-29]已經(jīng)為本研究所篩選的一些樞紐基因在乳腺癌癥進(jìn)展中的功能提供了大量證據(jù)。例如，TYMS 因其作為胸苷酸合酶的功能而被認(rèn)為是5-氟尿嘧啶的靶標(biāo)[23-24]。它與晚期乳腺癌[25]患者對化療的耐藥性和敏感性有關(guān)。CDCA8 是是有絲分裂的調(diào)節(jié)因子，SKA1 與有絲分裂有關(guān)，均被鑒定為乳癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樞紐基因[5，26]。KIF14 通過負(fù)調(diào)節(jié)Rap1a-Radil 信號通路促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。參與細(xì)胞抗病毒的MX1與乳腺癌對淋巴結(jié)的侵襲有關(guān)[28-29]。盡管有報(bào)道稱，PRC1（ASE1）促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生和肝癌的早期復(fù)發(fā)[30-31]，也和鼻咽癌的轉(zhuǎn)移[32]和乳癌患者較差的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)[33]，POLR3H 與促腫瘤作用相關(guān)[34-35]。它們在乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移中的確切功能仍然知之甚少，值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究確定了乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的優(yōu)勢基因及其PPI 網(wǎng)絡(luò)。其中一些基因從未被報(bào)道過影響乳腺癌的進(jìn)展，因此可能作為潛在的藥物靶點(diǎn)或生物標(biāo)志物。然而，本研究仍具有局限性，即需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。需要檢測更多基因來豐富網(wǎng)絡(luò)，以便更全面地了解乳腺癌的轉(zhuǎn)移通路。