牛源多殺性巴氏桿菌主要莢膜群和脂多糖基因型兩組三重PCR 檢測方法

李霄陽，許 建，劉文曉，章振華，徐福洲，陳小玲，李永清

（北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100097）

牛出血性敗血癥，也稱牛巴氏桿菌病，是由某些血清型的多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）引起牛的一種高發(fā)病率、高死亡率急性敗血癥或肺炎型疾病，對養(yǎng)牛業(yè)危害嚴(yán)重，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入須通報動物疫病名錄[1]。Pm 分為A、B、D、E、F 5 個莢膜血清群和16 個脂多糖（LPS）血清型（1～16）[2-3]，二者結(jié)合構(gòu)成完整的血清學(xué)分型系統(tǒng)[4]。在國外，牛源Pm 主要有B:2、B:5、E:2、A:1 和A:3 血清型。我國2006 年以前主要流行B:2、B:5 型，2008 年以來我國至少有一半省區(qū)市發(fā)生或流行過A 型巴氏桿菌病[5-6]。

過去對該病原的實驗室診斷依靠細(xì)菌分離、生化試驗和動物致病性試驗。而為進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和疫苗研發(fā)，還需要鑒定分離株的血清群和血清型。傳統(tǒng)血清學(xué)方法成本高，操作繁瑣耗時，制備高質(zhì)量抗血清難度大，且敏感性和特異性差，使得Pm 莢膜分群和LPS 分型的血清學(xué)方法難以推廣應(yīng)用。近年來核酸檢測方法逐漸用于鑒定Pm 種、血清群以及血清型所對應(yīng)的基因型[7-8]。Townsend 等[7]建立的Pm 種和莢膜分群六重PCR 方法已被納入OIE《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》[1]。鑒于我國牛源Pm 分離株血清群至今僅限于A 群和B 群，本研究選擇此六重PCR[7]中的Pm 種和莢膜A、B群引物并做了部分修改，優(yōu)化建立了鑒定Pm 種和莢膜A、B 群的三重PCR（PmAB-3PCR），以方便國內(nèi)使用。

隨著疫苗研究的深入，LPS 被發(fā)現(xiàn)是Pm 的主要免疫保護(hù)性抗原[8]。Harper 等[8]建立了以Pm 脂多糖外核生物合成基因為基礎(chǔ)的LPS 基因分型八重PCR，將Pm 分為8 個基因型，用它取代復(fù)雜且分型能力低的傳統(tǒng)1～16 分型系統(tǒng)。該方法在國內(nèi)也有了初步應(yīng)用[6，9]。鑒于牛Pm 的主要基因型為L1、L2和L3型，分別對應(yīng)傳統(tǒng)1～16型中的1、14型，2、5 型和3、4 型。本研究選出此八重PCR 中的L1、L2 和L3 型引物[8]，構(gòu)建鑒定LPS 基因型的三重PCR（LPS-3PCR）。在此，將PmAB-3PCR和LPS-3PCR 的建立、模擬臨床檢驗以及與傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法的比較試驗總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

本試驗所用30 株P(guān)m（表2）及7 株其他菌株，由國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心（CVCC）、澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall 教授、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)胡長敏博士、哈爾濱獸醫(yī)研究所提供或本實驗室保存。

1.2 實驗動物及病料

體質(zhì)量2 kg 新西蘭家兔、12 周齡SPF 雞和SPF 級BALB/c 小鼠，購自北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司；牛鼻拭子樣品，采自北京市某奶牛場。

1.3 PCR 模板及制備

挑取血清TSA平板上過夜培養(yǎng)的菌落3～5個，懸浮于50 μL 無菌去離子水，用煮沸法粗提DNA，即煮沸10 min，冰上冷卻3～5 min，12 000 r/min 離心2 min，取上清為模板。PCR 敏感性試驗所需純化DNA 樣品，經(jīng)細(xì)菌DNA 試劑盒提取后使用。

1.4 PCR 引物

參考文獻(xiàn)[7-8]合成3 對PmAB-3PCR 引物和3 對LPS-3PCR 引物（表1）。

1.5 體系優(yōu)化

在25.0 μL 反應(yīng)體系中，分別優(yōu)化模板DNA質(zhì)量濃度（5 pg/μL～50 ng/μL）、引物濃度（10 pmol/μL的PmAB-3PCR 引物每條0.1～0.8 μL，10 pmol/μL的LPS-3PCR 引物每條0.25～2.0 μL）、4 個不同公司或型號的2×PCR premix 試劑、退火溫度（47～57 °C）和PCR 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（25～40）等PCR條件。PCR 反應(yīng)完成后，分別取產(chǎn)物7.0 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PmAB-3PCR 特異性檢驗

用A、B、D、E、F 群參考菌株和7 株非Pm 菌株（溶血性曼氏桿菌、隱秘桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多動物鏈球菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）檢驗該P(yáng)CR 方法的特異性，對部分陽性PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序驗證。

1.7 PmAB-3PCR 和LPS-3PCR 敏感性檢驗

將已知 A 群、B 群和LPS 型菌株的DNA 樣品10 倍系列稀釋成50 ng/μL～5 pg/μL。將這些菌株在TSB 中振蕩培養(yǎng)16 h，進(jìn)行活菌計數(shù)后10 倍系列稀釋成106～102CFU/μL。以系列稀釋的DNA和菌液樣品各2.0 μL 進(jìn)行PCR 檢驗。

1.8 感染小鼠組織樣品檢驗

用A 群和B 群Pm 的TSB 過夜培養(yǎng)物0.3 mL腹腔注射小鼠各5 只，在小鼠死亡后取肺、心、肝組織接種TSA 分離Pm，并用試劑盒提取DNA 進(jìn)行PmAB-3PCR 檢測。設(shè)空白對照2 只，注射TSB培養(yǎng)基0.3 mL，同樣取組織進(jìn)行細(xì)菌分離和PCR鑒定。

1.9 牛鼻拭子樣品檢驗

從某奶牛場隨機(jī)采100 份牛鼻拭子，接種含小牛血清的TSA 和TSB，培養(yǎng)過夜，分離疑似Pm，并在其中10 份鼻拭子培養(yǎng)物（約含雜菌107CFU/μL）中加入等體積過夜培養(yǎng)的Pm A 型菌株，另外10 份中加入等量Pm B 型菌株（含Pm 2×106～3×106CFU/μL），全部進(jìn)行PmAB-3PCR檢測。

此外在25.0 μL PCR 體系中，加入1.0 μL 上述鼻拭子培養(yǎng)物（不含目的菌，約含雜菌107CFU/μL）和106～102CFU/μL 系列稀釋的PmA 或PmB 菌液1.0 μL，然后進(jìn)行PCR 檢測，檢驗PmAB-3PCR 檢測人工污染牛鼻拭子樣品的敏感性。

1.10 PCR 分群分型與常規(guī)血清學(xué)分群分型比較

參照文獻(xiàn)[1，3]用參考株和本實驗室分離株各2 株制備A 群和B 群兔抗血清，用LPS 1～4 型參考株制備1～4 型LPS 雞抗血清；將所有Pm 參考株和分離株制備不耐熱莢膜抗原和耐熱LPS 抗原；莢膜分群瓊擴(kuò)試驗用0.2 mol/L PBS 加1%瓊脂糖制備瓊脂板，LPS 分型瓊擴(kuò)試驗用8.5%生理鹽水加0.9%瓊脂糖制備瓊脂板，對30 個Pm 參考菌株的莢膜和菌體抗原進(jìn)行分群分型檢驗。同時對這30 個菌株按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行PmAB-3PCR和LPS-3PCR 檢測，對PmAB-3PCR 無法鑒定的菌株，用D、E、F 群引物[1]進(jìn)行單個PCR 鑒定。最后，將PCR 結(jié)果與瓊擴(kuò)試驗結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后的PCR 反應(yīng)條件

PmAB-3PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL：無菌去離子水8.1 μL，2×PCR premix 12.5 μL，10 pmol/μL的Pm 種引物各0.3 μL，B 群引物各0.3 μL，A 群引物各0.6 μL，模板2.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 °C，3 min；94 °C 30 s、55 °C 30 s、72 °C 1 min，30 個循環(huán)；72 °C 10 min 延伸后4 °C 保存。PCR 電泳結(jié)果見圖1-A。LPS-3PCR 反應(yīng)體系：10 pmol/μL 的L1 型引物各1.0 μL，L2 型引物各1.0 μL，L3 型引物各0.5 μL，其余成分和PCR 程序與上述PmAB-3PCR 相同。PCR 電泳結(jié)果見圖1-B。

2.2 PmAB-3PCR 特異性

PmAB-3PCR 特異性試驗結(jié)果見圖2。陽性A群和B 群菌株擴(kuò)增出兩條帶，分別為A 群或B 群特異性條帶和Pm 種特異性條帶；D、E、F 群只擴(kuò)增出Pm 種特異性條帶；7 株非巴氏桿菌PCR 結(jié)果均為陰性。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與目的片段序列一致。

2.3 PmAB-3PCR 和LPS-3PCR 敏感性

用已知Pm 莢膜群、LPS 基因型的純化DNA為模板，檢驗了兩組三重PCR 的敏感性。PmAB-3PCR 每個反應(yīng)可檢出10～100 pg DNA 和200～2 000 CFU，LPS-3PCR 每個反應(yīng)可檢出1 ng DNA和2 000～20 000 CFU。DNA檢測結(jié)果見圖3-A、B。

2.4 PmAB-3PCR 檢測模擬臨床樣品

從10 只感染小鼠的30 份組織樣品中，全部分離并擴(kuò)增出A 群或B 群Pm，而從2 只對照小鼠的6 份組織樣品中未分離和擴(kuò)增出A 群或B 群Pm，細(xì)菌分離和PCR 檢驗結(jié)果100%一致。部分PCR 檢測結(jié)果如圖4 所示。從100 個牛鼻拭子樣品中未分離到疑似Pm，進(jìn)而用鼻拭子肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行PmAB-3PCR 檢測。除人為加入A 群或B群Pm 菌液的20 份鼻拭子樣品PCR 檢測結(jié)果為陽性外，其余樣品均為陰性。100 個拭子中的48 個拭子PCR 檢測結(jié)果見圖5。檢測人工污染鼻拭子樣品的敏感性結(jié)果見圖6，每個反應(yīng)可檢出1 000 CFU。

2.5 PCR 與傳統(tǒng)血清學(xué)分群分型比較

瓊擴(kuò)試驗和PCR 試驗對30 個菌株的分群分型結(jié)果見表2，PmAB-3PCR、LPS-3PCR 分別與瓊擴(kuò)試驗分群分型的統(tǒng)計學(xué)比較結(jié)果見表3。因為D、E、F 群沒進(jìn)行莢膜分群瓊擴(kuò)試驗，所以比較莢膜分群時除去了D、E、F 群3 個參考株和2 個PCR 鑒定為D 群的澳大利亞菌株，只統(tǒng)計余下的25 株；30株P(guān)m 都進(jìn)行了LPS1～4 型瓊擴(kuò)試驗和LPS-3PCR分型試驗并進(jìn)行了比較。

表2 試驗所用Pm 菌株和分群分型結(jié)果

表3 多重PCR 與瓊擴(kuò)分群分型比較結(jié)果

綜合分析試驗結(jié)果和參考分型信息，對于莢膜分群，PmAB-3PCR 和瓊擴(kuò)試驗的檢出率（陽性率）分別為88%和72%，經(jīng)t 檢驗，二者差異不顯著（P＞0.05）；對于LPS 分型，LPS-3PCR 與瓊擴(kuò)試驗的檢出率分別為90%和50%，經(jīng)t 檢驗，二者差異顯著（P＜0.05）。PmAB-3PCR 和瓊擴(kuò)試驗分群方法的符合率為84%，LPS-3PCR 和瓊擴(kuò)試驗分型方法的符合率為60%。

3 討論

Townsend 等[7]建立的Pm 種和莢膜分群六重PCR 已被寫入OIE《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》。但OIE 手冊也指出用該多重PCR 系統(tǒng)做出的分型結(jié)果可能不清楚，遇到這種情況建議將擴(kuò)增Pm 種的引物，從多重PCR 中剔除（即單獨鑒定種）。該P(yáng)CR 方法在國內(nèi)外已得到廣泛應(yīng)用。各實驗室根據(jù)各自國家、地區(qū)的流行血清型，選擇性使用其中的莢膜分群引物。本研究開始也利用Townsend 等[7]設(shè)計的3 對引物進(jìn)行PmAB-3PCR研究，但發(fā)現(xiàn)檢測敏感性較低，故修改了Pm 種和莢膜A 群這2 對引物（其他報道[5]也對A 群引物進(jìn)行了修改）。修改后的引物特異性有保證，且敏感性提高了1～2 個數(shù)量級。Townsend 等[7]和Harper等[8]建立的多重PCR 沒有報道PCR 模板檢測限。2010 年段新華等[10]建立了檢測Pm 及3 個血清群的四重PCR 方法，發(fā)現(xiàn)其對B 群（該文中將B 群錯寫成了E 群）的檢測限為2.5 ng。本研究未包括E 群，因為E 群在國內(nèi)從未報道過，與本研究建立PmAB-3PCR 的目的不符。

本研究發(fā)現(xiàn)，PmAB-3PCR 的敏感性為10～100 pg DNA 和200～2 000 CFU，LPS-3PCR 的檢測限為1 ng DNA 和2 000～20 000 CFU。LPS-3PCR 的敏感性雖然偏低，但LPS 基因型鑒定是在Pm 種和莢膜群簽定出結(jié)果之后，屆時分離株已被保存收藏，模板量不成問題。PmAB-3PCR 對感染小鼠和污染牛鼻拭子樣品的PCR 定性與細(xì)菌分離結(jié)果完全一致，對污染牛鼻拭子樣品的敏感性為1 000 CFU，略低于檢驗A 群純Pm 菌液樣品。

有學(xué)者認(rèn)為，Pm 是動物和人類口腔、鼻咽部、上呼吸道的常在菌或條件致病菌[11-12]。試想如果能從健康牛鼻咽拭子中檢出Pm，那么從病牛鼻咽拭子就更容易檢出，這將有助于該病的早期診斷和早期治療。在牛鼻咽拭子Pm 核酸檢測方面，國外有很多研究，從獸醫(yī)到人醫(yī)，用核酸檢測方法檢測細(xì)菌、病毒，診斷疫病，越來越追求能從活動物（特別是牛這樣的大動物）和人體上找到病原。本研究從一個臨床健康奶牛場隨機(jī)采集了100 份鼻拭子，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)和PCR 檢測，結(jié)果均為陰性，分析原因可能有以下幾方面：（1）健康牛鼻腔帶Pm 量低。研究[12]顯示，從健康牛場運(yùn)出后2 d 進(jìn)行二代測序檢測到的Pm 只有運(yùn)出當(dāng)天的約1/5，到14 d 則降為約1/10。（2）使用的拭子長度不夠。國外給成年牛用20～27 cm 拭子，國內(nèi)能買到的最長拭子是15 cm，達(dá)不到鼻咽部[13]。（3）鼻拭子過夜培養(yǎng)，使得本來就少的目標(biāo)菌被雜菌掩蓋（活菌計數(shù)達(dá)1010CFU/mL）。更多研究[13-15]表明，從患呼吸道病或潛在呼吸道病牛的鼻咽拭子中檢出Pm 的可能性更大。

Carter[2]建立的經(jīng)典Pm 莢膜抗原分群方法是間接血凝試驗（IHA），但此法非常繁瑣、耗時。OIE 在手冊中將瓊擴(kuò)試驗也列入Pm 莢膜抗原分群方法。Heddleston 等[3]建立的LPS 抗原血清分型系統(tǒng)只有瓊擴(kuò)試驗方法。本研究在進(jìn)行PCR 與瓊擴(kuò)試驗比對中發(fā)現(xiàn)：兩組PCR 方法除了各有3 株不可分群或分型外，其他菌株都可以明確分入一個群或一個基因型；而瓊擴(kuò)試驗有7 株不可分群，8株不可分型，另外7株有多個血清型或交叉反應(yīng)（表2～3）。因此，本研究將試驗結(jié)果與參考血清學(xué)信息不一致的菌株進(jìn)行了重復(fù)驗證和分析，如參考株CVCC1672、CVCC 信息顯示為A:1 型，但用傳統(tǒng)方法和PCR 都不能將其定群定型，只能鑒定其為Pm；延伸測序發(fā)現(xiàn)，其與A 群PCR 引物序列匹配度很低，與A 群莢膜合成基因序列的同源性只有87%（GenBank 中A 群Pm 間此序列相似性大多在99% 以上）。另外CVCC406 株參考信息為A:7 型，而本研究進(jìn)行的瓊擴(kuò)和PCR 檢測結(jié)果一致，均為A:3型和A:L3，故將這株計入了有多型或交叉反應(yīng)。還有6個參考株與分離株瓊擴(kuò)試驗分型顯示有1、3、4 型間的交叉反應(yīng)。有報道[16]稱，Pm 傳統(tǒng)分型中1 個菌株中有1 種以上LPS 抗原的不在少數(shù)，如A:3、4、7，A:4、7，A:3、4、12 型。Harper 等[8]的LPS 基因分型研究也報告了有傳統(tǒng)血清學(xué)分型為7型，1、3 型，1、4 型，1、3、4 型的澳大利亞分離株用液相色譜進(jìn)行LPS 成分分析（作為金標(biāo)準(zhǔn)）和LPS-mPCR 分型檢測均為L3 型（對應(yīng)于血清3、4 型）的情況。本試驗檢測的參考株和分離株大多是已知血清群和血清型或經(jīng)同行實驗室用PCR 鑒定到群的菌株，與本試驗結(jié)果基本一致，說明這兩組三重PCR結(jié)果正確可信且優(yōu)于傳統(tǒng)血清學(xué)方法，特別是LPS-3PCR 的檢出率（90%）顯著高于傳統(tǒng)分型方法（50%）。Harper 等[8]建立的LPS-mPCR可對57/58（98.3%）的菌株正確分型，而瓊擴(kuò)試驗只能對20/58（34.5%）的菌株正確分型；Turni等[17]用傳統(tǒng)方法和Harper 等[8]的LPS-mPCR 對43 株豬Pm 進(jìn)行了LPS 分型，結(jié)果瓊擴(kuò)試驗有33株（77%）不可分型或有多個型，而用LPS-mPCR全部給出了可靠和可重復(fù)的分型結(jié)果，且無交叉反應(yīng)。

總之，本研究建立了特異、敏感的檢測牛源Pm 及莢膜A、B 群的三重PCR（PmAB-3PCR）和LPS 基因分型三重PCR（LPS-3PCR），前者可從人工感染小鼠組織和加入了Pm 的健康牛鼻拭子培養(yǎng)物（含大量雜菌）中直接檢測出Pm 及其莢膜群。對30 個菌株進(jìn)行了PCR 與傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定，證明了PCR 分群分型方法成本低、簡便高效，特別是LPS-3PCR 較少產(chǎn)生無法分型或多型交叉情況，這對流行病學(xué)調(diào)查和滅活苗菌株篩選至關(guān)重要。下一步擬收集有疑似呼吸道疾病的牛深部鼻咽、口咽拭子和組織樣品，進(jìn)行短時增菌后提取或直接提取核酸進(jìn)行PCR 檢測，以檢驗這兩組PCR 的臨床應(yīng)用效果。