上調(diào)miR- 200a 通過抑制MACC1 影響結(jié)直腸癌細胞生物學行為的研究

邱麗湞，吳共發(fā)，劉鈺君，曾宇婷，賴劍龍，李海剛

1.廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院健康管理中心，廣東廣州 511300；2.廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院病理科，廣東廣州511300；3.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院病理科，廣東廣州 510120

該課題組前期研究顯示，miR-200a 在結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）中表達下調(diào)[1]，具有高度轉(zhuǎn)移能力的細胞表達最低，成瘤但不轉(zhuǎn)移的細胞表達最高[2]，在CRC 細胞中下調(diào)miR-200a 能誘導細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促進細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡[3]。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關基因-1 （metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）已經(jīng)被認為可以作為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移和預后等的標志物。 前期研究證實，CRC 患者癌組織中高表達MACCl，MACCl 的高表達與CRC 發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和高級別臨床分期密切相關[4-5]。目前，miR-200a 與MACC1 的關系未闡明， 該研究是在前期研究基礎上，進一步探討miR-200a 對CRC 細胞的作用及潛在機制。 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細胞LoVo 購自中科院上海生命科學研究院。 miR-200a 的類似物mimics 及其陰性對照物negative control（NC）由上海吉瑪公司設計并合成，序列為：mimicssense：5’-UAACACUGUCUG GUAACGAUGU-3’、anti-sense：5’-AUCGUUACCAGACAGU GUUAUU -3’；NCsense：5’ -UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3’、anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti-MEM 和陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 購自美國Invitrogen 公司；兔多克隆濃縮型抗體MACC1（產(chǎn)品編號ab226803）購自英國abcam 公司；β-actin 抗體（sc-69879） 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；過氧辣根酶標記抗兔IgG 購自中杉金橋；PVDF 膜購自美國Millipore 公司； 抗體稀釋液購自福州邁新公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、蛋白抽提試劑盒 （P0028）、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（P0012）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（P0012AC）、ECL 反應檢測試劑盒（P0018S）均購自碧云天生物技術；Transwell板和各類培養(yǎng)板等購自美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 LOVO 細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI-1640， 培養(yǎng)環(huán)境37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，取生長狀態(tài)良好且無污染的細胞進行實驗。 實驗分為3組，mimics 組（轉(zhuǎn)染miR-200a mimics）、blank 組（轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體） 和NC 組 （轉(zhuǎn)染miR-200a negative control）。 細胞轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染效率檢測按照該實驗組前期方法進行[1]。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 制作細胞懸液并計算細胞濃度，96 孔板的每個孔的細胞量為0.5×104，每孔的終體積100 μl/孔，mimics 組、blank 組和NC 組的每組均設置5 個復孔， 各組轉(zhuǎn)染48 h 后進行CCK-8 檢測，每孔加CCK-8 液10 μl，加樣后的96 孔板避光，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，選擇450 nm 波長，酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光光度值（OD 值），計算平均值。

1.2.3 同質(zhì)性腫瘤細胞黏附實驗 mimics 組、blank 組和NC 組細胞轉(zhuǎn)染24 h 后，制作1×105個/mL 濃度的細胞懸液， 預鋪各組細胞的96 孔板中相對應地加入100 μl 懸液， 放置在37℃、50 mL/L CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，輕晃培養(yǎng)板后將所有液體吸到另外一塊新96 孔板，PBS 輕洗2 次并將液體完全吸到新96 孔板。 將新96 孔板置于培養(yǎng)箱孵育30 min，待細胞沉淀在板底后于倒置顯微鏡下觀察計數(shù)未黏附細胞數(shù)。同質(zhì)性細胞黏附數(shù)=1×104-未黏附細胞數(shù)，實驗設置3 個復孔。

1.2.4 細胞侵襲實驗Matrigel 基質(zhì)膠鋪24 孔板上室， 接種2×104/mL 個/每孔的各組細胞懸液于上室，下室加入500 μl RPMI-1640。 把24 孔板放入細胞培養(yǎng)箱孵育30 h，PBS 洗去死亡懸浮細胞，將膜用甲醇浸泡固定20 min，浸泡在蘇木素中染色5 min，PBS 清洗后用棉簽擦去膜的內(nèi)室面未穿膜的細胞，隨機計數(shù)顯微鏡下5 個高倍視野的下室面膜細胞穿過數(shù)， 取平均值。

1.2.5 Western Blot mimics 組、blank 組和NC 組細胞轉(zhuǎn)染48 h 后離心收集， 保存在-80℃冰箱備用。進行Western Blot 檢測時，-80℃冰箱中取出樣本，按試劑盒說明書進行蛋白提取并測定濃度，每個電泳孔的上樣量均為40 μg， 使用SDS-PAGE 凝膠電泳法，蛋白轉(zhuǎn)膜使用濕轉(zhuǎn)法， 室溫下用含5%脫脂奶粉的PBST 緩沖液封閉印跡膜1 h，加入MACC1 一抗（稀釋度為1:1 000），4℃過夜孵育， 封口膜封蓋防止干燥，次日上午洗膜，按1:5 000 稀釋過氧辣根酶標記抗兔IgG 配制成工作液使用，室溫條件下孵膜1 h，蛋白條帶顯影用ECL 化學發(fā)光法， 內(nèi)對照為β-actin 蛋白。 使用Image J 軟件對Western Blot 條帶進行灰度值量化分析，蛋白相對表達量=灰度值目的蛋白/灰度值β-actin。

1.2.6 在線基因庫數(shù)據(jù)庫預測 應用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)預測miR-200a 和MACC1 的靶向關系。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用（±s）表示，比較采用t 檢驗；影響因素采用單向方差分析，組間比較根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果選擇多重比較方法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組細胞增殖能力變化比較

CCK-8 法結(jié)果顯示mimics 組的OD 值為（1.27±0.07），均顯著低于blank 組的（1.75±0.04）和NC 組的（1.70±0.08）， 差異有統(tǒng)計學意義 （F=27.780，P<0.001），blank 組和NC 組差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.599）。統(tǒng)計結(jié)果顯示mimics 組細胞增殖能力顯著減低。 見圖1。

圖1 過表達miR-200a 對LOVO 細胞增殖能力的影響

2.2 3 組同質(zhì)性腫瘤細胞黏附力變化比較

mimics 組、blank 組和NC 組細胞的同質(zhì)性腫瘤細胞黏附數(shù)量分別為 （1 241.33±76.42）、（1 021.00±62.00）和（994.67±53.78），差異有統(tǒng)計學意義（F=13.130，P=0.006）， 兩兩比較顯示，mimics 組細胞黏附能力顯著高于blank 組和NC 組， 差異有統(tǒng)計學意義 （P=0.006、0.003）。 blank 組和NC 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.636）。 見圖2。

圖2 過表達miR-200a 對LOVO 細胞同質(zhì)性腫瘤細胞黏附力的影響

2.3 3 組細胞侵襲能力變化比較

mimics 組、blank 組和NC 組細胞的侵襲穿膜細胞數(shù)分別為 （54.20±6.83）、（85.6±6.39） 和 （88.00±5.52），3 組比較差異有統(tǒng)計學意義 （F=13.130，P=0.006）， 兩兩比較顯示，mimics 組細胞侵襲穿膜數(shù)顯著低于blank 組和NC 組， 差異有統(tǒng)計學意義 （P<0.001），blank 組和NC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.890）。 見圖3。

圖3 過表達miR-200a 對LOVO 細胞侵襲能力的影響

2.4 3 組細胞MACC1 的表達變化比較

Western Blot 條帶使用Image J 軟件讀取灰度值，計算各組蛋白相對表達量，mimics 組、blank 組和NC組的MACCI 蛋白表達灰度值分別是（0.011±0.003）、（0.284±0.043）和（0.293±0.071），差異有統(tǒng)計學意義（F=32.084，P=0.001）。 兩兩比較顯示，mimics 組的MACC1 表達量顯著低于blank 組和NC 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），blank 組和NC 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.820）。

2.5 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

在線數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-200a 與MACC1 存在一定的互補堿基對，MACC1 是miR-200a 的潛在靶向基因。 見圖4。

圖4 miR-200a 和MACC1 互補的核苷酸序列

3 討論

CRC 在世界范圍內(nèi)癌癥的病死率中居第二位，雖然近年對CRC 這種疾病治療干預方面已經(jīng)取得新進展，但CRC 患者的病死率仍然很高。轉(zhuǎn)移的形成是導致CRC 患者最終死亡的主要原因[6]，因此提高CRC患者存活率，尋找能評估轉(zhuǎn)移形成的風險和預后的生物標志物， 識別疾病驅(qū)動因素的分子機制有助于為CRC 尋找新的治療干預點。

大量研究報道顯示，miRNAs 在生理過程如新陳代謝、細胞凋亡、分化和病理過程如腫瘤細胞增殖，細胞周期、 細胞凋亡、 侵襲乃至轉(zhuǎn)移過程中極具效果，miRNAs 表達失調(diào)對惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌）的生長、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移具有重要關系[7-8]。 miR-200a 作為miR-200 家族成員之一，在CRC 中的表達失調(diào)及對侵襲轉(zhuǎn)移的可能作用機制已經(jīng)有文獻報道，miR-200a 在CRC 中的作用類似抑癌基因的作用,其表達下調(diào)甚至缺失能促進CRC 的惡性進展[9-11]。 該研究基于前期研究開展進一步探討實驗， 研究結(jié)果顯示，在CRC 細胞中過表達miR-200a 能抑制細胞的增殖和侵襲能力，增強同質(zhì)性細胞黏附力，結(jié)果證實了過表達miR-200a 能增強癌細胞間黏附能力，使細胞間變得黏附增強不易遷移、減低癌細胞增殖和侵襲能力，說明miR-200a 具有抑制CRC 細胞惡性生物行為的作用，結(jié)果符合現(xiàn)有關于miR-200a 的報道[12]。

雖然miR-200a 對CRC 的作用及機制有報道，且不少研究證實miR-200a 能通過調(diào)控EMT 通路上的關鍵位點基因從而影響腫瘤生物學行為，例如Park 等[13]、Pichler 等[14]報道在CRC 細胞HCT116 中誘導miR-200家族成員的過表達能抑制腫瘤細胞的EMT 表型，但miR-200a 調(diào)控CRC 生物學行為的機制仍然有待深入。已經(jīng)有強烈的證據(jù)支持MACC1 在CRC 中的異常高表達在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、預后等發(fā)揮重要作用，可以作為CRC 轉(zhuǎn)移、預后等預測和標志物的作用，是新的治療靶點[15-16]。 該研究組前期也報道MACC1 在CRC中的高表達與侵襲轉(zhuǎn)移及不良預后有關，是惡性進展的促進基因[17]。在肝癌中已經(jīng)證實miR-200a 通過靶向MACC1 抑制肝癌細胞遷移侵襲并能作為預后靶標[18]。目前CRC 中miR-200a 和MACC1 的關系未見報道。綜合文獻分析和數(shù)據(jù)庫分析， 研究推測在CRC 中，miR-200a 可能通過靶向調(diào)控MACC1 影響癌細胞的生物學行為。 該研究實驗結(jié)果顯示， 上調(diào)miR-200a表達后，MACC1 表達顯著減低，在線數(shù)據(jù)庫分析顯示miR-200a 與MACC1 存在一定的互補堿基對，MACC1 是miR-200a 的潛在靶向基因。該研究雖然沒有用熒光素酶報告實驗證實miR-200a 與MACC1 的直接靶向關系， 但依據(jù)肝癌中mir-200 能靶向調(diào)控MACC1 文獻報道[18]，可以推測出在CRC中，過表達miR-200a 通過靶向下調(diào)MACC1 表達抑制人CRC 細胞的增殖能力和侵襲能力，增強細胞黏附力。

綜上所述，過表達miR-200a 可以明顯抑制癌細胞增殖和侵襲能力， 增加癌細胞同質(zhì)性黏附能力，最終阻遏CRC 細胞的惡性生物學行為表型， 機制是通過靶向調(diào)控抑制MACC1 實現(xiàn)的， 但miR-200a 和MACC1 的直接靶向關系及調(diào)控惡性行為的作用機制有待進一步研究以明確。